郭思武，鐘英杰，劉秋月，陶 林，劉玉芳，儲明星*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，北京 100193；2.河北工程大學生命科學與食品工程學院，河北邯鄲 056001）

哺乳動物中，亞種或家畜的品種之間經(jīng)常出現(xiàn)脊椎數(shù)的差異，即使在同種內(nèi)個體間也存在差異。胸椎數(shù)的變異在不同的物種中有著千差萬別，如在人類中發(fā)生脊椎數(shù)目的變異會造成嚴重的遺傳性疾病，影響正常生活[1]；在家畜中胸椎數(shù)的增加卻是一個非常有利的經(jīng)濟性狀，家畜胸椎和腰椎數(shù)目增加，胴體長度也會隨之增加，這就給養(yǎng)殖企業(yè)帶來更高的經(jīng)濟效益[2-3]。在豬[4-5]、牛[6]、羊[7-8]等物種中均已有多個基因調(diào)控脊椎數(shù)變異的相關(guān)報道。本研究選取的小尾寒羊（STH）是我國肉裘兼用型綿羊品種，具有耐粗飼、發(fā)育快、繁殖性能強、適應性強等特點[9]，而蘇尼特羊（SNT）屬蒙古綿羊系統(tǒng)中的一類，經(jīng)過長期的自然選擇和人工選擇而形成了具有耐寒、抗旱、生長發(fā)育快、生命力強的特性，是最能適應荒漠半荒漠草原的肉用地方良種之一[10]。這2 種羊均存在高比例的多脊椎數(shù)變異，含有14 個胸椎（T14，正常綿羊為T13）的個體比例高達20%～30%，同時其肉質(zhì)細嫩呈大理石紋狀，富含人體必需的各種氨基酸、維生素、礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，具有繁殖選育的潛力[11]。研究綿羊胸椎數(shù)相關(guān)基因已持續(xù)數(shù)年，通過分子生物學技術(shù)選育多脊椎數(shù)性狀的綿羊品種已成為當前階段的重要研究內(nèi)容。因此，本研究基于先前實驗的基因組重測序結(jié)果，對得到的21 個候選基因中的OSBPL11、PAEP、ALDH1A2基因進行胸椎數(shù)關(guān)聯(lián)分析研究，以期獲得新的多胸椎數(shù)相關(guān)分子標記。

OSBPL11、PAEP、ALDH1A2基因基于綿羊基因組重測序被篩選出來，但目前研究進展表明這3 個基因的功能在胸椎數(shù)變異中并無明顯的關(guān)聯(lián)性。其中，OSBPL11是氧甾醇結(jié)合蛋白（Oxysterol-Binding Protein,OSBP）家族的成員之一，OSBP 在20 世紀80 年代作為幾種氧甾醇的細胞質(zhì)親和力受體被分離出來[12-14]。與OSBP 具有序列同源性的蛋白質(zhì)家族存在于整個真核生物界，在哺乳動物中，OSBP 家族由12 個成員組成[15-17]。孕激素相關(guān)子宮內(nèi)膜蛋白（Progestagen Associated Endo metrial Protein，PAEP）長約5 050 bp，包括7 個外顯子和6 個內(nèi)含子，該基因由180 個氨基酸構(gòu)成，是一種分子大小為28 kDa 的糖蛋白，屬于核脂鈣蛋白家族[18]。PAEP是子宮內(nèi)膜分泌的主要蛋白質(zhì)之一，其中在雄性精囊中表達最高，PAEP還在生殖組織的其他上皮細胞中表達。醛脫氫酶1A2（ALDH1A2）是醛脫氫酶（ALDH1）家族中的一員，ALDH1 由ALDH1A1、ALDH1A2 和ALDH1A3 3 個亞科成員組成[19]。其中ALDH1A1參與視網(wǎng)膜氧化、乙醛代謝和環(huán)磷酰胺解毒，而ALDH1A2和ALDH1A3參與視網(wǎng)膜氧化為維甲酸（RA）[20]。因此，本研究利用分子遺傳學手段檢測了蘇尼特羊和小尾寒羊OSBPL11、PAEP、ALDH1A2基因的多態(tài)位點，并將這些位點與胸椎數(shù)性狀進行關(guān)聯(lián)分析，以揭示這3 個基因的遺傳變異與多脊椎數(shù)性狀之間的關(guān)系，初步推測OSBPL11、PAEP、ALDH1A2基因影響蘇尼特羊和小尾寒羊胸椎數(shù)的具體分子機理，為提高綿羊胸椎數(shù)、改良綿羊生長發(fā)育提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集 實驗采集了188 只來自內(nèi)蒙古巴彥淖爾烏拉特中旗的蘇尼特羊的組織樣品（樣品組織為背最長肌）和195 只來自內(nèi)蒙古巴彥淖爾及山東鄆城的小尾寒羊的組織樣品，采樣綿羊健康狀態(tài)良好。綿羊屠宰后，快速用2 mL 凍存管采集新鮮肌肉組織，并用液氮冷凍保存帶回實驗室轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。記錄綿羊胴體長度部分數(shù)據(jù)，其中蘇尼特羊胸椎數(shù)為13 個及14個的個體分別為122 只和66 只，小尾寒羊胸椎數(shù)為13個和14 個的個體分別為137 只和58 只。

1.2 DNA 提取 使用DNA 提取試劑盒（天根生物科技有限公司，北京）進行組織DNA 提取，對提取后的組織樣品用NanoDrop 2000 和1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行濃度和質(zhì)量的評估，合格的DNA 樣品用于后續(xù)實驗。

1.3 引物設(shè)計 根據(jù)小尾寒羊和蘇尼特羊OSBPL11、PAEP、ALDH1A2基因的SNP 位點序列信息通過Assay design 3.1 軟件進行引物設(shè)計，具體信息見表1。引物設(shè)計及合成由康普森生物技術(shù)有限公司完成。

表1 小尾寒羊與蘇尼特羊OSBPL11、PAEP 和ALDH1A2 基因的引物序列

1.4 基因分型 采用Sequenom MassARRAY?SNP[21]分型技術(shù)對OSBPL11基因的g.188064535A＞G、PAEP基因的g.3541777A＞G 和ALDH1A2基因的g.49249275G＞A進行分型檢測，分型樣品為DNA，每個樣品需要量為20 μL，DNA 濃度為40～80 ng/μL。分型的具體過程見Zhang 等[22]所示方法。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 利用Microsoft Excel 2019 軟件計算各位點的基因頻率、基因型頻率、有效等位基因數(shù)、多態(tài)信息含量（Polymorphism Information Content,PIC）和雜合度（Heterozygosity,He），并進行哈代溫伯格平衡檢驗。計算群體遺傳學參數(shù)的方法詳見Zhang 等[22]。利用SPSS 19.0 采取一般線性模型單變量分析與單因素方差分析LSD 對OSBPL11、PAEP、ALDH1A2不同基因型的小尾寒羊和蘇尼特羊進行胸椎數(shù)關(guān)聯(lián)分析。模型為yijn=μ+Pi+Gj+IPG+eijn。式中：yijn代表表型值（胸椎數(shù)）；μ 代表群體均值；Pi代表品種效應（i=1，2）；Gj代表j 種基因型的影響（j=1，2，3）；IPG表示品種與基因型的互作效應；eijn代表隨機誤差。胸椎數(shù)用平均值±標準誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1OSBPL11、PAEP、ALDH1A2基因多態(tài)性分析 測序結(jié)果顯示，383 只綿羊群體基因型及分型分別是：OSBPL11基因g.188064535A＞G 位 點AA 型350 只、AG型30 只、GG（不計入統(tǒng)計分析）型1 只；PAEP基因g.3541777A＞G 位點AA 型216 只、AG 型143 只、GG 型21 只；ALDH1A2基因g.49249275G＞A 位點GG 型362 只、AG 型18 只（圖1～3）。

圖1 OSBPL11 基因g.188064535A＞G 位點分型結(jié)果

圖2 PAEP 基因g.3541777A＞G 位點分型結(jié)果

圖3 ALDH1A2 基因g.49249275G＞A 位點分型結(jié)果

PIC：OSBPL11基因g.188064535A＞G位點中小尾寒羊和蘇尼特羊PIC 分別是0.06 和0.09，均屬于低度 多 態(tài)（PIC＜0.25）；PAEP基 因g.3541777A＞G 位點中小尾寒羊和蘇尼特羊PIC 分別是0.32 和0.27，均屬于中度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.50）；ALDH1A2基因g.49249275G＞A 位點中小尾寒羊和蘇尼特羊PIC 分別是0.05 和0.04，均屬于低度多態(tài)（PIC＜0.25）（表2）。在卡方檢驗值方面，OSBPL11基因g.188064535A＞G位點小尾寒羊與蘇尼特羊的卡方檢驗值分別為0.631 和0.439；PAEP基因g.3541777A＞G 位點小尾寒羊與蘇尼特羊的卡方檢驗值分別為0.427 和0.930；ALDH1A2基因g.49249275G＞A 位點小尾寒羊與蘇尼特羊的卡方檢驗值分別為0.685 和0.793。結(jié)果表明，小尾寒羊和蘇尼特羊中3 個SNPs 位點均處于哈代溫伯格平衡狀態(tài)（P＞0.05）。

表2 3 個位點在小尾寒羊和蘇尼特羊中的群體遺傳學分析

2.2OSBPL11、PAEP、ALDH1A2基因3個位點與胸椎數(shù)的關(guān)聯(lián)分析 由表3 可知，OSBPL11、PAEP、ALDH1A2基因的3 個突變位點均與胸椎數(shù)不顯著相關(guān)。對188 只蘇尼特羊和195 只小尾寒羊2 個種群單獨進行胸椎數(shù)關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ALDH1A2基因g.49249275G＞A 位點在蘇尼特羊中野生型個體（GG）的胸椎數(shù)顯著低于突變雜合個體（AG），其他位點與胸椎數(shù)均不顯著相關(guān)；而在小尾寒羊中OSBPL11、PAEP、ALDH1A2基因的3 個突變位點與胸椎數(shù)均不顯著相關(guān)，表明ALDH1A2基因g.49249275G＞A 位點與蘇尼特羊的胸椎數(shù)變化有關(guān)（表4）。

表3 OSBPL11、PAEP 及ALDH1A2 基因位點與綿羊胸椎數(shù)關(guān)聯(lián)分析結(jié)果

表4 3 個位點各基因型與小尾寒羊和蘇尼特羊胸椎數(shù)最小二乘均值及標準誤

2.3OSBPL11、PAEP、ALDH1A2基因3 個位點與小尾寒羊胴體長的關(guān)聯(lián)分析 由表5 可知，這3 個突變位點各基因型與小尾寒羊胴體長均不顯著相關(guān)。

表5 各位點基因型與小尾寒羊胴體長的關(guān)聯(lián)分析（平均值±標準誤）

3 討論

哺乳動物脊椎是由胚胎發(fā)育到原腸胚時中胚層分化而來，而控制胸椎生長的初級神經(jīng)胚的發(fā)育變化主要受到骨形成蛋白（BMP）的濃度控制。其中發(fā)育的每個階段都是極為復雜的工程，任何地方出錯都有可能導致胸椎的異常分化[23-24]。家畜多脊椎性狀是指家畜胸椎數(shù)和腰椎數(shù)比正常個體增多的現(xiàn)象。早在20 世紀中期，人們就發(fā)現(xiàn)家畜的胸腰椎數(shù)目存在變異。脊椎數(shù)的增多可以間接地提高家畜的體長、體重、產(chǎn)肉量和肋骨數(shù)等性狀，從而提高其經(jīng)濟效益。所以家畜脊椎數(shù)變異的遺傳改良也在近年來得到了深入的研究。

豬多脊椎性狀候選基因的挖掘始于QTL 定位。由于豬的繁殖速度較其他家畜快，使得在利用家系進行多脊椎性狀相關(guān)QTL 定位研究中較其他單胎家畜具有明顯的優(yōu)勢，這也是豬繁殖研究中獲得成果較其他家畜多的原因之一。早在2000 年，Wada 等[25]首次將脊椎數(shù)相關(guān)QTL 位點定位在豬1 號染色體和2 號染色體上。其中1 號染色體上脊椎數(shù)相關(guān)的QTL 與Rohrer 等定位在1 號染色體與胴體長度相關(guān)的QTL 在位置上很接近[26]，提示脊椎數(shù)與胴體長可能存在相關(guān)性。在此基礎(chǔ)上，該研究團隊后期研究又發(fā)現(xiàn)在豬1 號染色體和7 號染色體各存在1 個與脊椎數(shù)相關(guān)的QTL 位點[27]，該結(jié)果后來也被在其他不同豬品種上的研究所證實[28-29]。與豬相比，羊脊椎數(shù)變化范圍要小很多。張立嶺等[3]研究發(fā)現(xiàn)，蒙古羊每增加1 枚胸椎或腰椎，脊柱就加長約2.40 cm或3.50 cm。無論多1 枚胸椎還是腰椎，綿羊的活重、胴體重、凈肉重和眼肌面積均明顯增加，其中凈肉平均增加4 kg 以上。該研究結(jié)果與豬的研究結(jié)果基本一致。最早在大白豬群體中發(fā)現(xiàn)控制脊椎數(shù)性狀的VRTN基因首次被證實為影響脊椎數(shù)性狀的主效基因[30]，隨后又發(fā)現(xiàn)了更多影響胸椎數(shù)性狀的基因，如NR6A1[7]、Hoxc[31]和TGFβ3[32]等，而在蘇尼特羊中已被證實VRTN對胸椎數(shù)的影響仍然存在[33]。

查閱OSBPL11基因相關(guān)文獻發(fā)現(xiàn)，該基因的表達在各物種間可能存在差異，人OSBPL11基因的功能與脂肪形成有關(guān)，綿羊中卻在肺臟和淋巴組織中高度表達。目前OSBPL11所在家族中的其他成員OSBP 相關(guān)（ORP）蛋白或OSBP 樣（OSBPL）蛋白更多的研究主要聚焦在哺乳動物和酵母系統(tǒng)中，主要參與控制細胞脂質(zhì)代謝、囊泡運輸和細胞信號傳導[34-35]，在脊椎數(shù)變異等骨相關(guān)的研究鮮少。查閱PAEP基因相關(guān)文章發(fā)現(xiàn)，還沒有發(fā)現(xiàn)PAEP在綿羊胸椎數(shù)變異研究的報道，已知的PAEP 蛋白亞型有4 種，分別為glycodelin A（來自羊水、內(nèi)膜和母體血清）、glycodelin S（來自雄性精漿和精液囊泡）、glycodelin F（來自卵泡液和輸卵管）和glycodelin C（來自卵丘），這些亞型的蛋白骨架完全相同，區(qū)別僅在糖基結(jié)構(gòu)部分，表現(xiàn)出不同甚至相反的功能，提示糖基化對蛋白功能具有重要的調(diào)節(jié)作用[36]。且在NCBI 中發(fā)現(xiàn)PAEP主要在綿羊乳腺中高度表達，其原因是由于PAEP的表達受孕酮/孕激素、松弛素和組蛋白去乙酰化酶抑制劑的調(diào)控[37]。

ALDH1A2是醛脫氫酶1（ALDH1）家族的一員，而ALDH1 是通過氧化全跨視網(wǎng)膜（all-trans-retinal）和9-順視網(wǎng)膜（9-cis-retinal）產(chǎn)生維甲酸（RA）的主要酶，主要參與細胞分化、細胞周期阻滯最終凋亡等生物學功能[38-40]。ALDH1A2的功能與胸椎數(shù)性狀沒有直接關(guān)系，但是本研究結(jié)果表明，ALDH1A2基因在存在品種效應的條件下雖與胸椎數(shù)呈不顯著關(guān)系，但在單獨群體中ALDH1A2基因的突變位點可以顯著提高蘇尼特羊的胸椎數(shù)，其機理有待進一步研究。

4 結(jié)論

在小尾寒羊中OSBPL11基因g.188064535A＞G、PAEP基因g.3541777A＞G 和ALDH1A2基 因g.49249275G＞A位點與胸椎數(shù)和胴體長無顯著關(guān)聯(lián)。OSBPL11基因g.188064535A＞G 和PAEP基 因g.3541777A＞G 位 點與蘇尼特羊胸椎數(shù)性狀無顯著關(guān)聯(lián)；ALDH1A2基因g.49249275G＞A 位點突變與蘇尼特羊胸椎數(shù)呈顯著相關(guān)。ALDH1A2基因可作為潛在的多胸椎數(shù)的分子標記。