郭思武，鐘英杰，劉秋月，陶 林，劉玉芳，儲(chǔ)明星*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北邯鄲 056001）

哺乳動(dòng)物中，亞種或家畜的品種之間經(jīng)常出現(xiàn)脊椎數(shù)的差異，即使在同種內(nèi)個(gè)體間也存在差異。胸椎數(shù)的變異在不同的物種中有著千差萬(wàn)別，如在人類中發(fā)生脊椎數(shù)目的變異會(huì)造成嚴(yán)重的遺傳性疾病，影響正常生活[1]；在家畜中胸椎數(shù)的增加卻是一個(gè)非常有利的經(jīng)濟(jì)性狀，家畜胸椎和腰椎數(shù)目增加，胴體長(zhǎng)度也會(huì)隨之增加，這就給養(yǎng)殖企業(yè)帶來(lái)更高的經(jīng)濟(jì)效益[2-3]。在豬[4-5]、牛[6]、羊[7-8]等物種中均已有多個(gè)基因調(diào)控脊椎數(shù)變異的相關(guān)報(bào)道。本研究選取的小尾寒羊（STH）是我國(guó)肉裘兼用型綿羊品種，具有耐粗飼、發(fā)育快、繁殖性能強(qiáng)、適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)[9]，而蘇尼特羊（SNT）屬蒙古綿羊系統(tǒng)中的一類，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的自然選擇和人工選擇而形成了具有耐寒、抗旱、生長(zhǎng)發(fā)育快、生命力強(qiáng)的特性，是最能適應(yīng)荒漠半荒漠草原的肉用地方良種之一[10]。這2 種羊均存在高比例的多脊椎數(shù)變異，含有14 個(gè)胸椎（T14，正常綿羊?yàn)門(mén)13）的個(gè)體比例高達(dá)20%～30%，同時(shí)其肉質(zhì)細(xì)嫩呈大理石紋狀，富含人體必需的各種氨基酸、維生素、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有繁殖選育的潛力[11]。研究綿羊胸椎數(shù)相關(guān)基因已持續(xù)數(shù)年，通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)選育多脊椎數(shù)性狀的綿羊品種已成為當(dāng)前階段的重要研究?jī)?nèi)容。因此，本研究基于先前實(shí)驗(yàn)的基因組重測(cè)序結(jié)果，對(duì)得到的21 個(gè)候選基因中的OSBPL11、PAEP、ALDH1A2基因進(jìn)行胸椎數(shù)關(guān)聯(lián)分析研究，以期獲得新的多胸椎數(shù)相關(guān)分子標(biāo)記。

OSBPL11、PAEP、ALDH1A2基因基于綿羊基因組重測(cè)序被篩選出來(lái)，但目前研究進(jìn)展表明這3 個(gè)基因的功能在胸椎數(shù)變異中并無(wú)明顯的關(guān)聯(lián)性。其中，OSBPL11是氧甾醇結(jié)合蛋白（Oxysterol-Binding Protein,OSBP）家族的成員之一，OSBP 在20 世紀(jì)80 年代作為幾種氧甾醇的細(xì)胞質(zhì)親和力受體被分離出來(lái)[12-14]。與OSBP 具有序列同源性的蛋白質(zhì)家族存在于整個(gè)真核生物界，在哺乳動(dòng)物中，OSBP 家族由12 個(gè)成員組成[15-17]。孕激素相關(guān)子宮內(nèi)膜蛋白（Progestagen Associated Endo metrial Protein，PAEP）長(zhǎng)約5 050 bp，包括7 個(gè)外顯子和6 個(gè)內(nèi)含子，該基因由180 個(gè)氨基酸構(gòu)成，是一種分子大小為28 kDa 的糖蛋白，屬于核脂鈣蛋白家族[18]。PAEP是子宮內(nèi)膜分泌的主要蛋白質(zhì)之一，其中在雄性精囊中表達(dá)最高，PAEP還在生殖組織的其他上皮細(xì)胞中表達(dá)。醛脫氫酶1A2（ALDH1A2）是醛脫氫酶（ALDH1）家族中的一員，ALDH1 由ALDH1A1、ALDH1A2 和ALDH1A3 3 個(gè)亞科成員組成[19]。其中ALDH1A1參與視網(wǎng)膜氧化、乙醛代謝和環(huán)磷酰胺解毒，而ALDH1A2和ALDH1A3參與視網(wǎng)膜氧化為維甲酸（RA）[20]。因此，本研究利用分子遺傳學(xué)手段檢測(cè)了蘇尼特羊和小尾寒羊OSBPL11、PAEP、ALDH1A2基因的多態(tài)位點(diǎn)，并將這些位點(diǎn)與胸椎數(shù)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，以揭示這3 個(gè)基因的遺傳變異與多脊椎數(shù)性狀之間的關(guān)系，初步推測(cè)OSBPL11、PAEP、ALDH1A2基因影響蘇尼特羊和小尾寒羊胸椎數(shù)的具體分子機(jī)理，為提高綿羊胸椎數(shù)、改良綿羊生長(zhǎng)發(fā)育提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集 實(shí)驗(yàn)采集了188 只來(lái)自內(nèi)蒙古巴彥淖爾烏拉特中旗的蘇尼特羊的組織樣品（樣品組織為背最長(zhǎng)?。┖?95 只來(lái)自內(nèi)蒙古巴彥淖爾及山東鄆城的小尾寒羊的組織樣品，采樣綿羊健康狀態(tài)良好。綿羊屠宰后，快速用2 mL 凍存管采集新鮮肌肉組織，并用液氮冷凍保存帶回實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｓ涗浘d羊胴體長(zhǎng)度部分?jǐn)?shù)據(jù)，其中蘇尼特羊胸椎數(shù)為13 個(gè)及14個(gè)的個(gè)體分別為122 只和66 只，小尾寒羊胸椎數(shù)為13個(gè)和14 個(gè)的個(gè)體分別為137 只和58 只。

1.2 DNA 提取 使用DNA 提取試劑盒（天根生物科技有限公司，北京）進(jìn)行組織DNA 提取，對(duì)提取后的組織樣品用NanoDrop 2000 和1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行濃度和質(zhì)量的評(píng)估，合格的DNA 樣品用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)小尾寒羊和蘇尼特羊OSBPL11、PAEP、ALDH1A2基因的SNP 位點(diǎn)序列信息通過(guò)Assay design 3.1 軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，具體信息見(jiàn)表1。引物設(shè)計(jì)及合成由康普森生物技術(shù)有限公司完成。

表1 小尾寒羊與蘇尼特羊OSBPL11、PAEP 和ALDH1A2 基因的引物序列

1.4 基因分型 采用Sequenom MassARRAY?SNP[21]分型技術(shù)對(duì)OSBPL11基因的g.188064535A＞G、PAEP基因的g.3541777A＞G 和ALDH1A2基因的g.49249275G＞A進(jìn)行分型檢測(cè)，分型樣品為DNA，每個(gè)樣品需要量為20 μL，DNA 濃度為40～80 ng/μL。分型的具體過(guò)程見(jiàn)Zhang 等[22]所示方法。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 利用Microsoft Excel 2019 軟件計(jì)算各位點(diǎn)的基因頻率、基因型頻率、有效等位基因數(shù)、多態(tài)信息含量（Polymorphism Information Content,PIC）和雜合度（Heterozygosity,He），并進(jìn)行哈代溫伯格平衡檢驗(yàn)。計(jì)算群體遺傳學(xué)參數(shù)的方法詳見(jiàn)Zhang 等[22]。利用SPSS 19.0 采取一般線性模型單變量分析與單因素方差分析LSD 對(duì)OSBPL11、PAEP、ALDH1A2不同基因型的小尾寒羊和蘇尼特羊進(jìn)行胸椎數(shù)關(guān)聯(lián)分析。模型為yijn=μ+Pi+Gj+IPG+eijn。式中：yijn代表表型值（胸椎數(shù)）；μ 代表群體均值；Pi代表品種效應(yīng)（i=1，2）；Gj代表j 種基因型的影響（j=1，2，3）；IPG表示品種與基因型的互作效應(yīng)；eijn代表隨機(jī)誤差。胸椎數(shù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1OSBPL11、PAEP、ALDH1A2基因多態(tài)性分析 測(cè)序結(jié)果顯示，383 只綿羊群體基因型及分型分別是：OSBPL11基因g.188064535A＞G 位 點(diǎn)AA 型350 只、AG型30 只、GG（不計(jì)入統(tǒng)計(jì)分析）型1 只；PAEP基因g.3541777A＞G 位點(diǎn)AA 型216 只、AG 型143 只、GG 型21 只；ALDH1A2基因g.49249275G＞A 位點(diǎn)GG 型362 只、AG 型18 只（圖1～3）。

圖1 OSBPL11 基因g.188064535A＞G 位點(diǎn)分型結(jié)果

圖2 PAEP 基因g.3541777A＞G 位點(diǎn)分型結(jié)果

圖3 ALDH1A2 基因g.49249275G＞A 位點(diǎn)分型結(jié)果

PIC：OSBPL11基因g.188064535A＞G位點(diǎn)中小尾寒羊和蘇尼特羊PIC 分別是0.06 和0.09，均屬于低度 多 態(tài)（PIC＜0.25）；PAEP基 因g.3541777A＞G 位點(diǎn)中小尾寒羊和蘇尼特羊PIC 分別是0.32 和0.27，均屬于中度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.50）；ALDH1A2基因g.49249275G＞A 位點(diǎn)中小尾寒羊和蘇尼特羊PIC 分別是0.05 和0.04，均屬于低度多態(tài)（PIC＜0.25）（表2）。在卡方檢驗(yàn)值方面，OSBPL11基因g.188064535A＞G位點(diǎn)小尾寒羊與蘇尼特羊的卡方檢驗(yàn)值分別為0.631 和0.439；PAEP基因g.3541777A＞G 位點(diǎn)小尾寒羊與蘇尼特羊的卡方檢驗(yàn)值分別為0.427 和0.930；ALDH1A2基因g.49249275G＞A 位點(diǎn)小尾寒羊與蘇尼特羊的卡方檢驗(yàn)值分別為0.685 和0.793。結(jié)果表明，小尾寒羊和蘇尼特羊中3 個(gè)SNPs 位點(diǎn)均處于哈代溫伯格平衡狀態(tài)（P＞0.05）。

表2 3 個(gè)位點(diǎn)在小尾寒羊和蘇尼特羊中的群體遺傳學(xué)分析

2.2OSBPL11、PAEP、ALDH1A2基因3個(gè)位點(diǎn)與胸椎數(shù)的關(guān)聯(lián)分析 由表3 可知，OSBPL11、PAEP、ALDH1A2基因的3 個(gè)突變位點(diǎn)均與胸椎數(shù)不顯著相關(guān)。對(duì)188 只蘇尼特羊和195 只小尾寒羊2 個(gè)種群?jiǎn)为?dú)進(jìn)行胸椎數(shù)關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ALDH1A2基因g.49249275G＞A 位點(diǎn)在蘇尼特羊中野生型個(gè)體（GG）的胸椎數(shù)顯著低于突變雜合個(gè)體（AG），其他位點(diǎn)與胸椎數(shù)均不顯著相關(guān)；而在小尾寒羊中OSBPL11、PAEP、ALDH1A2基因的3 個(gè)突變位點(diǎn)與胸椎數(shù)均不顯著相關(guān)，表明ALDH1A2基因g.49249275G＞A 位點(diǎn)與蘇尼特羊的胸椎數(shù)變化有關(guān)（表4）。

表3 OSBPL11、PAEP 及ALDH1A2 基因位點(diǎn)與綿羊胸椎數(shù)關(guān)聯(lián)分析結(jié)果

表4 3 個(gè)位點(diǎn)各基因型與小尾寒羊和蘇尼特羊胸椎數(shù)最小二乘均值及標(biāo)準(zhǔn)誤

2.3OSBPL11、PAEP、ALDH1A2基因3 個(gè)位點(diǎn)與小尾寒羊胴體長(zhǎng)的關(guān)聯(lián)分析 由表5 可知，這3 個(gè)突變位點(diǎn)各基因型與小尾寒羊胴體長(zhǎng)均不顯著相關(guān)。

表5 各位點(diǎn)基因型與小尾寒羊胴體長(zhǎng)的關(guān)聯(lián)分析（平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤）

3 討論

哺乳動(dòng)物脊椎是由胚胎發(fā)育到原腸胚時(shí)中胚層分化而來(lái)，而控制胸椎生長(zhǎng)的初級(jí)神經(jīng)胚的發(fā)育變化主要受到骨形成蛋白（BMP）的濃度控制。其中發(fā)育的每個(gè)階段都是極為復(fù)雜的工程，任何地方出錯(cuò)都有可能導(dǎo)致胸椎的異常分化[23-24]。家畜多脊椎性狀是指家畜胸椎數(shù)和腰椎數(shù)比正常個(gè)體增多的現(xiàn)象。早在20 世紀(jì)中期，人們就發(fā)現(xiàn)家畜的胸腰椎數(shù)目存在變異。脊椎數(shù)的增多可以間接地提高家畜的體長(zhǎng)、體重、產(chǎn)肉量和肋骨數(shù)等性狀，從而提高其經(jīng)濟(jì)效益。所以家畜脊椎數(shù)變異的遺傳改良也在近年來(lái)得到了深入的研究。

豬多脊椎性狀候選基因的挖掘始于QTL 定位。由于豬的繁殖速度較其他家畜快，使得在利用家系進(jìn)行多脊椎性狀相關(guān)QTL 定位研究中較其他單胎家畜具有明顯的優(yōu)勢(shì)，這也是豬繁殖研究中獲得成果較其他家畜多的原因之一。早在2000 年，Wada 等[25]首次將脊椎數(shù)相關(guān)QTL 位點(diǎn)定位在豬1 號(hào)染色體和2 號(hào)染色體上。其中1 號(hào)染色體上脊椎數(shù)相關(guān)的QTL 與Rohrer 等定位在1 號(hào)染色體與胴體長(zhǎng)度相關(guān)的QTL 在位置上很接近[26]，提示脊椎數(shù)與胴體長(zhǎng)可能存在相關(guān)性。在此基礎(chǔ)上，該研究團(tuán)隊(duì)后期研究又發(fā)現(xiàn)在豬1 號(hào)染色體和7 號(hào)染色體各存在1 個(gè)與脊椎數(shù)相關(guān)的QTL 位點(diǎn)[27]，該結(jié)果后來(lái)也被在其他不同豬品種上的研究所證實(shí)[28-29]。與豬相比，羊脊椎數(shù)變化范圍要小很多。張立嶺等[3]研究發(fā)現(xiàn)，蒙古羊每增加1 枚胸椎或腰椎，脊柱就加長(zhǎng)約2.40 cm或3.50 cm。無(wú)論多1 枚胸椎還是腰椎，綿羊的活重、胴體重、凈肉重和眼肌面積均明顯增加，其中凈肉平均增加4 kg 以上。該研究結(jié)果與豬的研究結(jié)果基本一致。最早在大白豬群體中發(fā)現(xiàn)控制脊椎數(shù)性狀的VRTN基因首次被證實(shí)為影響脊椎數(shù)性狀的主效基因[30]，隨后又發(fā)現(xiàn)了更多影響胸椎數(shù)性狀的基因，如NR6A1[7]、Hoxc[31]和TGFβ3[32]等，而在蘇尼特羊中已被證實(shí)VRTN對(duì)胸椎數(shù)的影響仍然存在[33]。

查閱OSBPL11基因相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，該基因的表達(dá)在各物種間可能存在差異，人OSBPL11基因的功能與脂肪形成有關(guān)，綿羊中卻在肺臟和淋巴組織中高度表達(dá)。目前OSBPL11所在家族中的其他成員OSBP 相關(guān)（ORP）蛋白或OSBP 樣（OSBPL）蛋白更多的研究主要聚焦在哺乳動(dòng)物和酵母系統(tǒng)中，主要參與控制細(xì)胞脂質(zhì)代謝、囊泡運(yùn)輸和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)[34-35]，在脊椎數(shù)變異等骨相關(guān)的研究鮮少。查閱PAEP基因相關(guān)文章發(fā)現(xiàn)，還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)PAEP在綿羊胸椎數(shù)變異研究的報(bào)道，已知的PAEP 蛋白亞型有4 種，分別為glycodelin A（來(lái)自羊水、內(nèi)膜和母體血清）、glycodelin S（來(lái)自雄性精漿和精液囊泡）、glycodelin F（來(lái)自卵泡液和輸卵管）和glycodelin C（來(lái)自卵丘），這些亞型的蛋白骨架完全相同，區(qū)別僅在糖基結(jié)構(gòu)部分，表現(xiàn)出不同甚至相反的功能，提示糖基化對(duì)蛋白功能具有重要的調(diào)節(jié)作用[36]。且在NCBI 中發(fā)現(xiàn)PAEP主要在綿羊乳腺中高度表達(dá)，其原因是由于PAEP的表達(dá)受孕酮/孕激素、松弛素和組蛋白去乙酰化酶抑制劑的調(diào)控[37]。

ALDH1A2是醛脫氫酶1（ALDH1）家族的一員，而ALDH1 是通過(guò)氧化全跨視網(wǎng)膜（all-trans-retinal）和9-順視網(wǎng)膜（9-cis-retinal）產(chǎn)生維甲酸（RA）的主要酶，主要參與細(xì)胞分化、細(xì)胞周期阻滯最終凋亡等生物學(xué)功能[38-40]。ALDH1A2的功能與胸椎數(shù)性狀沒(méi)有直接關(guān)系，但是本研究結(jié)果表明，ALDH1A2基因在存在品種效應(yīng)的條件下雖與胸椎數(shù)呈不顯著關(guān)系，但在單獨(dú)群體中ALDH1A2基因的突變位點(diǎn)可以顯著提高蘇尼特羊的胸椎數(shù)，其機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

在小尾寒羊中OSBPL11基因g.188064535A＞G、PAEP基因g.3541777A＞G 和ALDH1A2基 因g.49249275G＞A位點(diǎn)與胸椎數(shù)和胴體長(zhǎng)無(wú)顯著關(guān)聯(lián)。OSBPL11基因g.188064535A＞G 和PAEP基 因g.3541777A＞G 位 點(diǎn)與蘇尼特羊胸椎數(shù)性狀無(wú)顯著關(guān)聯(lián)；ALDH1A2基因g.49249275G＞A 位點(diǎn)突變與蘇尼特羊胸椎數(shù)呈顯著相關(guān)。ALDH1A2基因可作為潛在的多胸椎數(shù)的分子標(biāo)記。