趙晶，李蒙，葉成，戴金峰，范一宏

浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院 消化科，浙江 杭州 310006

我國(guó)胃癌發(fā)病率逐年上升，且由于胃癌早期臨床癥狀不明顯導(dǎo)致大部分患者確診時(shí)已處于中晚 期[1]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long chain non-coding RNA, lncRNA）在胃癌中異常表達(dá)并可能發(fā)揮癌基因或抑癌基因作用[2-4]。lncRNA肌聯(lián)蛋白反義RNA 1（lncRNA titin antisense RNA 1, lncRNA TTNAS1）可促進(jìn)胃癌的發(fā)展[5]，但TTN-AS1在胃癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用機(jī)制尚未完全闡明。靶基因預(yù)測(cè)顯示微小RNA-204-3p（miR-204-3p）與TTN-AS1存在結(jié)合位點(diǎn)，研究表明miR-204-3p通過(guò)調(diào)節(jié)乳酸脫氫酶介導(dǎo)的糖酵解抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖[6]。 但TTN-AS1與miR-204-3p在胃癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用機(jī)制尚未可知。因此，本研究主要探討TTN-AS1對(duì)胃癌細(xì)胞遷移、侵襲及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）的影響及其與miR-204-3p的關(guān)系，旨在探究TTN-AS1在胃癌中的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 臨床標(biāo)本：收集2018年1月至2019年10月于浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院接受胃癌根治術(shù)治療的30例癌組織標(biāo)本及其相應(yīng)癌旁組織標(biāo)本（距離病灶組織＞5 cm處），置于液氮中保存，均經(jīng)病理診斷為胃癌，其中男20例，女10例，年齡52～68（56.4±10.0）歲；TNM分期I期7例，II期5例，III期18例；排除患有其他惡性腫瘤、自身免疫系統(tǒng)疾病以及肝、腎等重要臟器功能障礙的患者。每位患者均知情同意，本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 細(xì)胞和試劑：人胃癌細(xì)胞AGS購(gòu)自南京科佰生物公司；Lipofectamine2000購(gòu)自上海潤(rùn)成生物科技有限公司；si-NC、si-TTN-AS1、miR-NC、miR-204-3p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-204-3p購(gòu)自廣州銳博生物公司；TRIzol試劑購(gòu)自廣州國(guó)奧生物公司；反轉(zhuǎn)錄、qRT-PCR試劑購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；Transwell小室購(gòu)自上海宇進(jìn)生物公司；Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自上海浩然生物公司；兔抗人MMP-2、MMP-9、Vimentin、E-cadherin抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組：AGS細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)后以每孔5× 103個(gè)接種于96孔板，分別將si-NC、si-TTN-AS1、miR-NC、miR-204-3p mimics、si-TTN-AS1與anti-miR-NC、si-TTN-AS1與anti-miR-204-3p轉(zhuǎn)染至AGS細(xì)胞，標(biāo)記為si-NC組、si-TTN-AS1組、miR-NC組、miR-204-3p組、si-TTN-AS1+anti-miR-NC組、si-TTNAS1+anti-miR-204-3p組。

1.2.2 qRT-PCR檢測(cè)TTN-AS1、miR-204-3p的表達(dá)：采用TRIzol法提取癌旁組織、胃癌組織及各組轉(zhuǎn)染48 h的AGS細(xì)胞中總RNA，將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA（嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作），以cDNA為模板，在美國(guó)ABI StepOnePlus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)（嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作），檢測(cè)TTN-AS1相對(duì)于內(nèi)參GAPDH、miR-204-3p相對(duì)于內(nèi)參U6的表達(dá)量。

1.2.3 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移與侵襲：取各組轉(zhuǎn)染48 h的AGS細(xì)胞，制備每mL無(wú)血清培養(yǎng)液含1×104個(gè)細(xì)胞的懸液，加200 μL至上室，將含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液加600 μL至下室，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，固定20 min（多聚甲醛）并染色15 min（0.1%結(jié)晶 紫），應(yīng)用顯微鏡測(cè)量遷移細(xì)胞數(shù)。預(yù)先將Matrigel基質(zhì)膠40 μL加至上室，保持5 h，后續(xù)操作同細(xì)胞遷移步驟。

1.2.4 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)TTN-AS1與miR-204-3p的靶向關(guān)系：miR-NC、miR-204-3p mimics與WT-TTN-AS1、MUT-TTN-AS1共轉(zhuǎn)染至AGS細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集AGS并檢測(cè)熒光素酶活性。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測(cè)蛋白表達(dá)：以400 μL RIPA裂解液提取轉(zhuǎn)染48 h的AGS細(xì)胞總蛋白，吸取蛋白樣品40 μg進(jìn)行SDS-PAGE電泳反應(yīng)，轉(zhuǎn)膜、封閉后分別于4 ℃孵育一抗稀釋液（兔抗人MMP-2、MMP-9、Vimentin、E-cadherin抗體；均為1:1 000）24 h、于室溫孵育二抗稀釋液（HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗；1:2 000）1 h，在ECL中顯影，采用ImageJ軟件分析各條帶相對(duì)于內(nèi)參GAPDH的灰度值之比。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料均符合正態(tài)分布，以±s表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采 用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織中l(wèi)ncRNA TTN-AS1和miR-204-3p表達(dá) 胃癌組織中TTN-AS1的表達(dá)水平比癌旁組織增加約2.90倍（P＜0.05），miR-204-3p的表達(dá)水平比癌旁組織減少約0.57倍（P＜0.05），見表1。

表1 lncRNA TTN-AS1和miR-204-3p在胃癌組織中的表達(dá)（± s，n=30）

2.2 抑制lncRNA TTN-AS1表達(dá)對(duì)胃癌AGS細(xì)胞遷移、侵襲的影響 si-TTN-AS1組胃癌AGS細(xì)胞遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)均比si-NC組大幅減少（P＜0.05），MMP-2、MMP-9蛋白水平和TTN-AS1的表達(dá)水平也比si-NC組降低（P＜0.05），見圖1、表2。

表2 抑制lncRNA TTN-AS1表達(dá)對(duì)胃癌AGS細(xì)胞遷移、侵襲的影響（±s，每組n=9）

表2 抑制lncRNA TTN-AS1表達(dá)對(duì)胃癌AGS細(xì)胞遷移、侵襲的影響（±s，每組n=9）

分組 TTN-AS1 遷移細(xì)胞數(shù)（個(gè)） 侵襲細(xì)胞數(shù)（個(gè)） MMP-2 MMP-9 si-NC組 1.02±0.03 147.15±5.77 115.16±3.44 0.81±0.04 0.65±0.03 si-TTN-AS1組 0.36±0.02 68.58±3.55 52.21±1.32 0.35±0.01 0.23±0.01 t 19.069 11.602 17.071 11.790 12.159 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

圖1 抑制lncRNA TTN-AS1表達(dá)對(duì)胃癌AGS細(xì)胞遷移、侵襲的影響

2.3 抑制lncRNA TTN-AS1表達(dá)對(duì)胃癌AGS細(xì)胞EMT的影響 與si-NC組比，si-TTN-AS1組E-cadherin蛋白水平升高（P＜0.05），Vimentin蛋白水平降低（P＜0.05），見表3。

表3 抑制lncRNA TTN-AS1表達(dá)對(duì)胃癌AGS細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（±s，每組n=9）

表3 抑制lncRNA TTN-AS1表達(dá)對(duì)胃癌AGS細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（±s，每組n=9）

分組 E-cadherin Vimentin si-NC組 0.19±0.01 0.69±0.03 si-TTN-AS1組 0.56±0.03 0.25±0.01 t 11.766 13.780 P＜0.001 ＜0.001

2.4 lncRNA TTN-AS1靶向調(diào)控miR-204-3p的表達(dá)LncBase Predicted v.2軟件對(duì)TTN-AS1和miR-204-3p的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，見圖2。miR-204-3p組與miR-NC組比WT-TTN-AS1載體的熒光素酶活性較低 （P＜0.05），見表4。TTN-AS1可負(fù)向調(diào)控miR-204-3p的表達(dá)，見表5。

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)（±s，每組n=9）

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)（±s，每組n=9）

分組 WT-TTN-AS1 MUT-TTN-AS1 miR-NC組 1.01±0.03 1.02±0.04 miR-204-3p組 0.39±0.02 0.98±0.03 t 16.068 0.975 P＜0.001 0.385

圖2 TTN-AS1與miR-204-3p存在互補(bǔ)序列

表5 lncRNA TTN-AS1調(diào)控miR-204-3p表達(dá)（±s，每組n=9）

表5 lncRNA TTN-AS1調(diào)控miR-204-3p表達(dá)（±s，每組n=9）

與pcDNA組比：aP＜0.05；與si-NC組比：bP＜0.05

分組 miR-204-3p pcDNA組 1.01±0.05 pcDNA-TTN-AS1組 0.33±0.02a si-NC組 0.97±0.04 si-TTN-AS1組 3.05±0.19b F 133.404 P＜0.001

2.5 過(guò)表達(dá)miR-204-3p對(duì)胃癌AGS細(xì)胞遷移、侵襲的影響 miR-204-3p組胃癌AGS細(xì)胞的遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)及MMP-2、MMP-9蛋白水平均低于miR-NC組（P＜0.05），miR-204-3p表達(dá)水平高于miR-NC組（P＜0.05），見圖3和表6。

表6 過(guò)表達(dá)miR-204-3p對(duì)胃癌AGS細(xì)胞遷移、侵襲的影響（±s，每組n=9）

表6 過(guò)表達(dá)miR-204-3p對(duì)胃癌AGS細(xì)胞遷移、侵襲的影響（±s，每組n=9）

分組 miR-204-3p 遷移細(xì)胞數(shù)（個(gè)） 侵襲細(xì)胞數(shù)（個(gè)） MMP-2 MMP-9 miR-NC組 1.02±0.03 141.76±6.84 122.92±3.70 0.86±0.04 0.67±0.04 miR-204-3p組 3.12±0.16 61.54±2.08 67.83±2.29 0.37±0.01 0.21±0.02 t 13.171 11.216 12.659 12.559 10.776 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.6 過(guò)表達(dá)miR-204-3p對(duì)胃癌AGS細(xì)胞EMT的影響 miR-204-3p組E-cadherin蛋白水平與miR-NC組比有所增加（P＜0.05），Vimentin蛋白水平與miR-NC組比大幅減少（P＜0.05），見表7。

表7 過(guò)表達(dá)miR-204-3p對(duì)胃癌AGS細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（±s，每組n=9）

表7 過(guò)表達(dá)miR-204-3p對(duì)胃癌AGS細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（±s，每組n=9）

分組 E-cadherin Vimentin miR-NC組 0.22±0.01 0.64±0.04 miR-204-3p組 0.59±0.03 0.19±0.02 t 12.184 10.843 P＜0.001 ＜0.001

2.7 下調(diào)miR-204-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制lncRNA TTNAS1表達(dá)對(duì)胃癌AGS細(xì)胞遷移、侵襲和EMT的影響 與si-TTN-AS1+anti-miR-NC組比較，si-TTNAS1+anti-miR-204-3p組遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)增多（P＜ 0.05），并且si-TTN-AS1+anti-miR-204-3p組比si-TTN-AS1+anti-miR-NC組增加MMP-2、MMP-9、Vimentin 蛋白水平（P＜0.05），但降低E-cadherin蛋白水平和miR-204-3p表達(dá)水平（P＜0.05），見圖4和表8。

表8 下調(diào)miR-204-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制lncRNA TTN-AS1表達(dá)對(duì)胃癌AGS細(xì)胞遷移、侵襲和EMT的影響（±s，每組n=9）

表8 下調(diào)miR-204-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制lncRNA TTN-AS1表達(dá)對(duì)胃癌AGS細(xì)胞遷移、侵襲和EMT的影響（±s，每組n=9）

與si-NC組比：aP＜0.05；與si-TTN-AS1+anti-miR-NC組比：bP＜0.05

分組 miR-204-3p 遷移細(xì)胞數(shù)（個(gè)）侵襲細(xì)胞數(shù)（個(gè)） MMP-2 MMP-9 E-cadherin Vimentin si-NC組 0.98±0.04 145.11±7.09 118.69±6.15 0.82±0.05 0.63±0.04 0.18±0.01 0.65±0.05 si-TTN-AS1組 2.95±0.13a 65.33±3.75a 61.39±3.76a 0.34±0.01a0.21±0.02a0.55±0.04a0.23±0.02a si-TTN-AS1+anti-miR-NC組 2.98±0.17 63.13±1.44 58.16±1.59 0.31±0.03 0.22±0.01 0.58±0.03 0.19±0.02 si-TTN-AS1+anti-miR-204-3p組 1.56±0.08b 111.84±6.52b 97.15±3.45b 0.72±0.05b0.52±0.03b0.45±0.03b0.53±0.04b F 75.274 57.307 51.293 48.539 58.519 36.464 51.955 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

圖4 下調(diào)miR-204-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制lncRNA TTN-AS1表達(dá)對(duì)胃癌AGS細(xì)胞遷移、侵襲和EMT的影響

3 討論

胃癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，lncRNA可充當(dāng)miRNA的競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)源性RNA而參與胃癌發(fā)生及發(fā)展過(guò)程[7-10]。但仍有部分lncRNA在胃癌發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中的作用機(jī)制尚未闡明。

TTN-AS1通過(guò)miR-134-5p/MBTD1軸調(diào)節(jié)骨肉瘤細(xì)胞凋亡和耐藥性[11]。TTN-AS1通過(guò)調(diào)節(jié)miR-142-5p/CDK5促進(jìn)肺腺癌的遷移、侵襲和EMT[12]。TTN-AS1通過(guò)調(diào)節(jié)miR-153-3p/ZNRF2軸促進(jìn)甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生[13]。上述研究表明TTN-AS1在腫瘤發(fā)生過(guò)程中可能發(fā)揮癌基因作用。本研究結(jié)果顯示，胃癌組織中TTN-AS1呈高表達(dá)，提示TTN-AS1在胃癌發(fā)生過(guò)程中可能發(fā)揮重要調(diào)控作用。MMP-2、MMP-9可促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[14]。本研究結(jié)果顯示，抑制TTN-AS1的表達(dá)使遷移及侵襲能力減弱，同時(shí)MMP-2、MMP-9的表達(dá)下調(diào)，提示抑制TTN-AS1的表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞遷移及侵襲起抑制作用。EMT過(guò)程中上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)水平降低可促進(jìn)EMT，而間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Vimentin表達(dá)水平降低可抑制EMT[15-16]。本研究結(jié)果顯示，抑制TTN-AS1表達(dá)可明顯提高Ecadherin蛋白水平及降低Vimentin蛋白水平，提示抑制TTN-AS1表達(dá)可通過(guò)抑制EMT從而減弱胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力。

本研究證實(shí)TTN-AS1可靶向結(jié)合miR-204-3p。研究表明lncRNA LINC00963通過(guò)調(diào)控miR-204-3p/FN1軸促進(jìn)骨肉瘤的增殖和侵襲[17]。miR-204-3p通過(guò)靶向HMGA2抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[18]。沉默lncRNA LINC00514通過(guò)調(diào)控miR-204-3p/CDC23軸抑制甲狀腺乳頭狀癌的惡性行為[19]。本研究結(jié)果顯示，胃癌組織中miR-204-3p的表達(dá)水平降低，miR-204-3p過(guò)表達(dá)可通過(guò)抑制EMT從而抑制胃癌細(xì)胞遷移及侵襲，下調(diào)miR-204-3p表達(dá)可明顯逆轉(zhuǎn)抑制TTN-AS1表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞遷移、侵襲及EMT的作用。

綜上所述，TTN-AS1在胃癌中表達(dá)水平升高，而miR-204-3p的表達(dá)水平降低，抑制TTN-AS1表達(dá)可通過(guò)上調(diào)miR-204-3p的表達(dá)從而抑制胃癌細(xì)胞遷移、侵襲及EMT，其可能作為胃癌分子治療的潛在靶點(diǎn)。TTN-AS1可通過(guò)調(diào)節(jié)多個(gè)miRNA影響多種腫瘤的遷移、侵襲和EMT，是否在胃癌的發(fā)病中也存在同時(shí)調(diào)節(jié)多個(gè)miRNA影響胃癌細(xì)胞的生物學(xué)行為，均需進(jìn)一步探究。