王曉雅,梁 宇,楊偉祥,衛(wèi) 怡,曹國(guó)標(biāo)

(安康學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院, 陜西 安康 725000)

農(nóng)作物病蟲害發(fā)病率較高，使其成為導(dǎo)致農(nóng)業(yè)產(chǎn)品減產(chǎn)和質(zhì)量下降的主要原因之一[1]。當(dāng)前主要以藥物防治為主，研究和探索新型低毒農(nóng)藥一直是相關(guān)科研工作者研究熱點(diǎn)。近年來(lái)關(guān)于酰腙內(nèi)化合物作為新型潛在農(nóng)藥的研究也常有報(bào)道[2，3]。有研究表明，嗎啉基吲哚取代酰腙類化合物對(duì)柑橘潰瘍病菌和煙草青枯病菌具有一定的抑菌活性[4]。王彩霞等研究合成了腺嘌呤酰腙作為農(nóng)藥先導(dǎo)化合物，該類化合物對(duì)對(duì)小麥莖腐病菌、棉花枯萎病菌的抑菌活性優(yōu)于三唑酮[5]。文獻(xiàn)[6]報(bào)道了對(duì)硝基苯甲醛對(duì)氯苯甲酰腙對(duì)菜粉蝶幼蟲的殺蟲活性較好。

李建超等[7]利用活性亞結(jié)構(gòu)拼接理論，設(shè)計(jì)合成了系列新型N’-芳基亞甲基-N-(4-取代苯甲酰氧基噻唑-2-基)取代苯甲酰腙，并測(cè)試了這類化合物對(duì)水稻紋枯霉菌、黃瓜灰霉菌等的活性，結(jié)果表明其具有中等抑菌活性。段志芳[8]合成了含1,3,4-噁二唑啉苯氧乙氧基黃酮酰腙，生物活性研究結(jié)果表明：其能較好地抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌。

還有報(bào)道，新型的β-咔啉-3-酰腙衍生物對(duì)白菜具有除草活性[9]。王應(yīng)紅等[10]合成了9個(gè)新型硫基乙酰腙化合物，并研究了這類化合物的構(gòu)效關(guān)系，認(rèn)為：酰腙基團(tuán)上有強(qiáng)吸電子取代基比有給電子基團(tuán)具有更好的抑菌活性，尤其是枯草桿菌生長(zhǎng)影響較大。許雪棠等[11]合成了11個(gè)馬來(lái)松香酸酰腙類化合物，并初步測(cè)試它們的抑菌活性，所有化合物均對(duì)供試菌種具有殺菌活性，其中一個(gè)化合物對(duì)小麥赤霉菌抑制率達(dá)到68.3%。

從以上的研究文獻(xiàn)報(bào)道說(shuō)明，酰腙類化合物具有作為新型農(nóng)藥研究的價(jià)值。研究工作是在我們前期研究工作基礎(chǔ)上[12]，進(jìn)一步合成了系列新型酰腙類化合物，并考查了目標(biāo)化合物對(duì)茄鐮刀菌、淡紫擬青霉、葡萄青霉菌、米曲霉、灰霉病菌、黑斑病、念珠菌、克魯賽念珠菌、假熱帶念珠菌的抑菌活性。目標(biāo)化合物的合成路線如圖1。

圖1 目標(biāo)化合物合成路線

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器和試劑

BRUKE 400M 型核磁共振儀， BRUKE內(nèi)標(biāo)TMS；Bruker micrOTOF-Q Ⅱ ESI-Q-TOF LC/MS(德國(guó)Bruker公司)， DC-0515型循環(huán)低溫槽(金壇良友公司)； SHP 250生化培養(yǎng)箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，XXQ-L.S -50S2立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；SKJH-109生化超凈工作臺(tái)(上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司)。

水合肼(80%)、無(wú)水乙醇、二氯亞砜、苯乙酮、間氯苯乙酮、鄰氯苯乙酮、對(duì)甲氧基苯乙酮、DMSO、葡萄糖、瓊脂粉、醫(yī)用酒精(75%)(分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。

1.2 供試菌株

鐮刀菌，淡紫擬青霉，葡萄青霉菌，米曲霉，灰霉病菌，黑斑病。

1.3 合成與結(jié)構(gòu)表征

1.3.1 酰氯(2)的合成 稱取0.1 mol(16.6 g)2-甲基-3-甲氧基苯甲酸(1)，放入到裝有恒壓滴液漏斗、冷凝管、尾氣吸收裝置的三口燒瓶中、然后加入15 mL甲苯，油浴，升溫至80℃后，滴加0.2 mol的二氯亞砜，反應(yīng)體系慢慢變?yōu)槌吻迦芤海渭油旰?，保? h。然后，冷卻至室溫，改為減壓蒸餾，蒸去甲苯和多余的二氯亞砜，粗產(chǎn)物酰氯，密閉放置備用。

1.3.2 酰肼(3)的合成 將帶有冷凝管的250mL 三口燒瓶固定在磁力攪拌低溫槽中，將95%的乙醇40 mL 、0.01mol(0.4g)氫氧化鈉加入到燒瓶?jī)?nèi)，開動(dòng)磁力攪拌使堿溶解。再加入10 mL 80%的水合肼，然后將反應(yīng)液冷卻到-15 mol時(shí)，開始滴加0.01 mol(1.7g)酰氯，維持反應(yīng)溫度-15～ -10 ℃，大約6分鐘后開始有白色固體物質(zhì)析出，保溫反應(yīng)0.5h后，停止反應(yīng)，用10%的氫氧化鈉水溶液中和反應(yīng)體系，然后減壓蒸去乙醇，用乙酸乙酯萃取，無(wú)水硫酸鎂干燥萃取液，過(guò)濾，減壓蒸去乙酸乙酯，冷卻得到白色固體物質(zhì)，即為酰肼的粗產(chǎn)物，然后用二氯甲烷重結(jié)晶。

1H NMR (400 MHz，CDCl3) δ ：7.43 (s，1H)， 7.15 (t， J = 7.9 Hz，1H)， 6.89 (s， 1H)， 6.87 (s， 1H)， 3.82 (s， 5H)， 2.23 (s， 3H)。13C NMR (101 MHz，CDCl3) δ： 170.84，157.98， 135.70， 126.63，125.14，118.90，111.76， 55.63， 12.62。

1.3.3 酰肼酰腙(4)的合成 將酰肼和苯乙酮等摩爾混合，加入到三口燒瓶中，并加入適量的乙醇使之完全溶解，磁力攪拌，油浴，70℃下反應(yīng)，用薄層色譜跟蹤反應(yīng)至完全，停止反應(yīng) ，冷卻，即有大量白色固體析出，抽濾，干燥濾餅，用甲醇重結(jié)晶。

2-甲基-3-甲氧基苯甲酰肼苯乙酮酰腙(4a)：白色固體，產(chǎn)率45%。1H NMR (400 MHz， DMSO-d6) δ 10.89 (d，J = 95.2， 2.3 Hz, 1H)， 7.89 - 7.81 (m, 1H)， 7.43 (dt，J = 5.6， 2.5 Hz， 3H)， 7.35 - 7.17 (m， 2H)， 7.08 (d， J = 8.2 Hz， 1H)， 7.05 - 6.77 (m，1H)， 3.83 (d，J = 2.2 Hz， 3H)，2.29 (d， J = 6.0 Hz，3H)， 2.14 (dd， J = 51.8，1.9 Hz，3H)。 13C NMR (101 MHz，DMSO) δ 172.62，166.19，148.47，138.66， 138.52， 137.89， 129.38，128.80， 128.72，127.04，126.90，122.94，119.53，112.03，56.13， 39.35，15.01。ESI-MS，C17H18N2O2，實(shí)測(cè)值( 計(jì)算值) ，m/z: 283.1435 (282.1368)[M+H]+。

2-甲基-3-甲氧基苯甲酰肼鄰氯苯乙酮酰腙(4b)：白色固體，產(chǎn)率85 %。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ： 10.92 (d， J = 74.4 Hz， 1H)， 7.59 - 7.49 (m， 1H)， 7.43 (qd， J = 8.8， 4.2 Hz， 2H)， 7.36 - 7.22 (m，1H)， 7.22 - 7.11 (m， 1H)，7.05 (dd，J = 21.4， 7.9 Hz， 1H)， 6.87 (dd， J = 35.9， 7.9 Hz，1H)， 3.79 (d， J = 28.6 Hz， 3H)， 2.26 (d， J = 7.4 Hz， 3H)，2.13 (d，J = 50.9 Hz， 3H)。13C NMR (101 MHz，DMSO) δ 172.65， 166.33，157.85， 137.64， 131.52，130.70，130.49，130.40，130.12， 127.71， 126.61， 122.84，119.42，112.11， 56.14，18.67，13.22。ESI-MS，C17H17ClN2O2，實(shí)測(cè)值( 計(jì)算值) ，m/z: 317.1045 (316.0979)[M+H]+。

2-甲基-3-甲氧基苯甲酰肼間氯苯乙酮酰腙(4c)：白色固體，產(chǎn)率80 %。1H NMR (400 MHz， DMSO-d6) δ ：11.00 (d， J = 104.3 Hz， 1H)， 7.88 (d，J = 2.1 Hz， 1H)， 7.79 (dt， J = 6.7， 1.9 Hz， 1H)， 7.57 - 7.43 (m， 1H)， 7.43 - 7.32 (m， 1H)， 7.26 (dq， J = 15.1，7.7 Hz，1H)， 7.15 - 6.78 (m， 2H)，3.83 (s， 3H)， 2.29 (d， J = 10.0 Hz， 3H)，2.13 (d， J = 53.7 Hz，3H)。13C NMR (101 MHz， DMSO) δ：166.34， 157.85， 146.64， 138.37， 137.70， 133.74， 133.64， 130.61， 129.56， 126.62，126.41， 122.97， 119.47，112.13，56.15， 14.87， 13.17。ESI-MS，C17H17ClN2O2，實(shí)測(cè)值( 計(jì)算值) ，m/z: 339.0884 (316.0979)[M+Na]+。

2-甲基-3-甲氧基苯甲酰肼對(duì)甲氧基苯乙酮酰腙(4d)：白色固體，產(chǎn)率50 %。1H NMR (400 MHz， DMSO-d6) δ： 7.98 - 7.74 (m， 4H)， 7.19 - 6.65 (m，4H)， 3.81 (s， 6H)， 2.28 (s， 6H)。 13C NMR (101 MHz，DMSO-d6) δ ：161.05， 158.06，131.08， 128.48， 114.23， 55.74， 14.94。ESI-MS，C17H17ClN2O2，實(shí)測(cè)值( 計(jì)算值) ，m/z: 311.1755 (310.1681)[M+H]+。

1.4 抑菌活性初步篩選

參考文獻(xiàn)[15，16]，以PDA為培養(yǎng)基、采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定目標(biāo)化合物對(duì)鐮刀菌、淡紫擬青霉、葡萄青霉菌、米曲霉、灰霉病菌、黑斑病菌的抑菌活性。藥劑濃度100 μg·mL-1，用十字交叉法測(cè)定72 h的菌絲生長(zhǎng)大小，每病菌重復(fù)3次，計(jì)算平均值，對(duì)這些化合物進(jìn)行體外抑菌活性評(píng)價(jià)，見表1。

表1 藥劑濃度100μg·mL-1目標(biāo)化合物的抑菌活性

2 結(jié)果和討論

2.1 合成

在現(xiàn)代有機(jī)合成中，無(wú)論是工業(yè)上還是實(shí)驗(yàn)室中制備酰氯，一般采用兩種方法：一種是羧酸[17，18]和固光反應(yīng)[19，20]，還一種是二氯亞砜和羧酸反應(yīng)得到，以上兩種方法合成產(chǎn)率均可以達(dá)到100%，用固光作為氯源，需要密閉反應(yīng)設(shè)備以及尾氣光氣吸收裝置，因此這種方法不太適合在實(shí)驗(yàn)室普遍使用，但是，這種制備酰氯方法具有反應(yīng)溫度低，室溫下就可以完成反應(yīng)，副產(chǎn)物酸酐含量低等優(yōu)點(diǎn)。用二氯亞砜和芳香酸反應(yīng)來(lái)制備酰氯具有成本低，反應(yīng)裝置簡(jiǎn)單，產(chǎn)率高等優(yōu)點(diǎn)，但這種方法，需要過(guò)量的氯化亞砜，酸與氯化亞砜最佳摩爾比為1∶1.8。酰肼的合成常用的兩種方法有羧酸酯和肼通過(guò)酯的氨解反應(yīng)以及酰氯的氨解反應(yīng)來(lái)制備，我們本次合成方法采用酰氯的氨解方法來(lái)制備，這種方法的優(yōu)點(diǎn)就是比酯的氨解反應(yīng)時(shí)間短，反應(yīng)溫度低，本次合成產(chǎn)率達(dá)到90%，相比我們?cè)谇懊嫜芯克捎玫孽サ陌苯夂铣煞椒óa(chǎn)率偏低，而且這種方法后處理，比相對(duì)復(fù)雜點(diǎn)。目標(biāo)化合物合成進(jìn)程采用薄層色譜跟蹤，合成化合物4a、4d 反應(yīng)在70℃反應(yīng)所需要時(shí)間為4h,產(chǎn)率較低分別為45%和50%，而合成化合物4b、4c在室溫下，2h就可以完成反應(yīng)，反應(yīng)速度快，且產(chǎn)率較高，分別達(dá)到85%和80%，這可能與苯乙酮苯環(huán)上的取代基有關(guān)，吸電子基氯原子能使酮羰基碳原子電正性增強(qiáng)，從而有利于酮羰基的親核加成反應(yīng)。

2.2 結(jié)構(gòu)解析

在化合物3的1H NMR 譜圖中δ ：7.43 (s，1H)為酰肼化合物中 -CONH- 的氫峰，-NH2中的氫位移與基團(tuán)-OCH3中的甲基氫位移值重合，因此在δ：3.82 處形成了單峰、5H。當(dāng)用酰肼作底物進(jìn)一步合成酰肼酰腙化合物后，-NH2基團(tuán)變?yōu)榱藖啺坊?-N=C ，在化合物4的氫譜圖中 2個(gè)-NH2消失，在目標(biāo)化合物1H NMR 譜圖中3.82 處形成了單峰、3H，即-OCH3；同時(shí)， -CONH- 的氫位移進(jìn)一步處于低場(chǎng)區(qū)δ： 10.89，峰型也由原來(lái)的單峰變?yōu)榱穗p重峰。

在化合物4的1H NMR 譜圖中 4a， δ：2.29 (d， J = 6.0 Hz，3H)， 2.14 (d， J = 51.8，1.9 Hz，3H)；4b， δ：2.26 (d, J = 7.4 Hz, 3H), 2.13 (d, J = 50.9 Hz, 3H)；4c ，2.29 (d， J = 10.0 Hz， 3H)，2.13 (d， J = 53.7 Hz，3H)的位移分別為苯環(huán)甲基和亞乙基的甲基，并且均出現(xiàn)雙重峰，這些現(xiàn)象產(chǎn)生原因是因?yàn)轫樂(lè)串悩?gòu)體所致。

2.3 抑菌活性

從表1，我們可以看出， 4a、4b、4c、4d對(duì)以上6種供試菌種具有一定的抑菌活性菌種數(shù)目分別為3、5、4、2。4b表現(xiàn)出較好廣譜抑菌活性，尤其是對(duì)鐮刀菌的抑菌活性在藥劑濃度100 μg ·mL-1時(shí)，能夠達(dá)到80%的抑菌率。以上現(xiàn)象的存在表明結(jié)構(gòu)決定物質(zhì)生物活性，同時(shí)也表明進(jìn)一步優(yōu)化酰腙的結(jié)構(gòu)作為真菌抑制劑具有廣闊的研究前景。結(jié)合我們前面報(bào)道的結(jié)果，再一次表明苯環(huán)上含有拉電子基的酰腙抑菌活性大。