王紅力，文穎強(qiáng)

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 園藝學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

葡萄 (VitisviniferaL.) 既可鮮食, 亦可用于釀酒、制汁和制干，且其含有白藜蘆醇等有利于防癌、防心血管病、抗衰成分，在世界果品貿(mào)易中占有重要的位置[1]。我國(guó)是葡萄屬植物的起源中心之一，也是東亞種群的集中分布區(qū)，產(chǎn)于我國(guó)的葡萄種類約占世界葡萄屬植物種類的60%，為現(xiàn)代葡萄育種提供了豐富的種質(zhì)基礎(chǔ)[2]。世界主栽歐洲葡萄品種品質(zhì)優(yōu)，但其突出缺點(diǎn)是不抗病[3]。因此，對(duì)歐洲葡萄進(jìn)行抗病改良以提高其抗病性是解決這一生產(chǎn)問題的有效途徑[4]。近年來，分子育種雖然取得一定的成果，但是部分轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)緩慢且長(zhǎng)勢(shì)差，極大的影響基因功能研究。因此，通過嫁接的手段將轉(zhuǎn)基因植株嫁接到生長(zhǎng)健壯的常規(guī)品種當(dāng)中進(jìn)行培育，以提高轉(zhuǎn)基因植株成活率，從而為葡萄分子育種提供技術(shù)支持。

試管嫁接是一種在試管內(nèi)將砧木與接穗進(jìn)行嫁接的技術(shù)，它是植物組織培養(yǎng)與嫁接技術(shù)的結(jié)合[5]。早在 1972年，Murashige等[6]就提出試管嫁接技術(shù)，隨著該項(xiàng)技術(shù)的不斷發(fā)展，并逐漸運(yùn)用到蘋果、桃、柑桔、葡萄等多種果樹研究中。目前，試管嫁接已被廣泛應(yīng)用于快速檢測(cè)植物病毒[7]、繁殖保存珍貴育種材料、脫除植物病毒等方面。

與常規(guī)嫁接相比，試管嫁接技術(shù)除了可以在無菌環(huán)境得到無病毒植株以外，還可以提高砧木與接穗之間的親和力，并可排除時(shí)間、土地等因素干擾。試管嫁接與組培快繁一樣，具有周期短，條件易于控制，不受季節(jié)限制和環(huán)境影響等優(yōu)點(diǎn)[8]。

1 材料和方法

試驗(yàn)材料為歐洲葡萄品種‘無核白’‘里扎馬特’和中國(guó)葡萄‘白河35-1’組培苗，以及課題組前期通過基因編輯技術(shù)得到的植株。

1.1 嫁接材料的獲得

2019年5月在西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄種植資源圃中分別采集‘無核白’‘里扎馬特’‘白河35-1’三個(gè)品種進(jìn)行外植體構(gòu)建。將采集到的材料剪成小段，在流水條件下反復(fù)沖洗12 h，隨后在超凈工作臺(tái)下將材料置于裝有10%次氯酸鈉溶液的玻璃瓶中進(jìn)行消毒處理，接著用無菌水沖洗，再用75%酒精再次消毒。洗脫次數(shù)視材料情況而定，脫洗次數(shù)過少會(huì)引起污染，過多則會(huì)對(duì)材料本身造成嚴(yán)重?fù)p害。待生長(zhǎng)到一定階段，將目標(biāo)材料在無菌條件下進(jìn)行繼代培養(yǎng)、擴(kuò)繁備用。

1.2 培養(yǎng)基的準(zhǔn)備

MS粉，1 mg·mL1IAA，1 mg·mL16-BA以及1 mg·mL1NAA，添加蔗糖30 g·L-1，瓊脂7 g·L-1；為降低褐化率，加入活性炭1 g·L-1，調(diào)節(jié)pH至5.8～6.0，在121 ℃高溫高壓條件下滅菌20 min后，取出混勻，冷卻至凝固備用。

1.3 其他材料的準(zhǔn)備

裝有濾紙的200 mm培養(yǎng)皿，11號(hào)手術(shù)刀(0.4 mm刀片)，鑷子，彎頭剪刀，錫箔紙，硅膠管，90 mm培養(yǎng)皿，無菌水。以上材料均需在121 ℃高溫高壓下滅菌，取出后放入烘箱烘干備用。

1.4 試管嫁接

1.4.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) (1)不同砧木品種比較。以‘白河35-1’為接穗，‘無核白’‘里扎馬特’作為砧木進(jìn)行嫁接成活率的比較。

(2)接口部位的材料選擇。選擇內(nèi)徑2 mm、外徑3 mm的硅膠管，在其側(cè)面剪出一條縫隙，便于操作。用剪刀將錫箔紙剪成長(zhǎng)約1 cm、寬約為0.5 cm的條形備用。采用無處理的方式進(jìn)行對(duì)照，待解除綁縛后統(tǒng)計(jì)成活率，選出最合適的嫁接用材。

(3)接穗和砧木有無葉片對(duì)嫁接成活率的影響。以接穗不保留葉片與接穗保留1～2個(gè)葉片進(jìn)行比較(視具體植株而定，若葉片生長(zhǎng)較好，則留1片即可；若葉片很小，則留2片)。具體可分為以下4種嫁接方式：接穗留葉砧木無葉；接穗無葉砧木無葉；接穗留葉砧木留葉；接穗無葉砧木留葉。

1.4.2 試管苗嫁接方法 采用劈接法進(jìn)行。選取生長(zhǎng)性狀優(yōu)良、直立的莖段作為砧木。選定后，用彎頭剪刀將其剪下，長(zhǎng)度不宜過長(zhǎng)，一般保持在1～2 cm。選好莖段后，用手術(shù)刀(0.4 mm刀片)從莖段縱切面垂直切下，形成0.3～0.5 cm深的切口。在剪斷接穗的形態(tài)學(xué)下端用手術(shù)刀切出楔形(若莖段細(xì)弱，則將其對(duì)應(yīng)長(zhǎng)度用刀刮出傷口即可)，隨后小心插入準(zhǔn)備好的砧木切口中。若此過程所需時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)，可將砧木或接穗放入事先準(zhǔn)備好的裝有無菌水的玻璃皿中保持濕潤(rùn)，避免在操作結(jié)束前萎蔫。嫁接操作完成后，對(duì)嫁接部位進(jìn)行綁縛(或不作處理)，最后將其插入新的培養(yǎng)基中。觀察其生長(zhǎng)狀況，15d后統(tǒng)計(jì)成活率。

1.5 結(jié)果統(tǒng)計(jì)

嫁接成活率/% =(嫁接成活數(shù)/總嫁接株數(shù))× 100

2 結(jié)果與分析

2.1 不同砧木品種對(duì)嫁接成活率的影響

兩個(gè)品種砧木的嫁接成活率如表1所示，以‘無核白’‘里扎馬特’為砧木均得到較高成活率。兩個(gè)品種表型相似，莖段粗壯，根系發(fā)達(dá)，均適合用來作為嫁接砧木。因此，二者可以互為替代。在對(duì)‘白河35-1’進(jìn)行自根嫁接后，發(fā)現(xiàn)成活率較低，原因可能是莖段較軟、韌性較差所導(dǎo)致?？紤]到長(zhǎng)期使用一個(gè)品種材料進(jìn)行嫁接，可能會(huì)造成剩余苗木數(shù)量對(duì)其他工作的資源供應(yīng)不足，且繼代后需要一定的生長(zhǎng)周期，故將前兩種材料進(jìn)行交替使用。

表1 嫁接成活率比較

2.2 接口捆綁材料對(duì)嫁接成活率的影響

采用錫箔紙和硅膠管進(jìn)行處理的嫁接苗成活率均在70%以上，而不采用任何處理的嫁接苗成活率則較低，如表2所示。造成這種差異性的原因初步分析為在嫁接初期，接穗與砧木還暫時(shí)處于半貼合狀態(tài)，不進(jìn)行任何處理會(huì)使得接穗一旦受到外界的干擾便導(dǎo)致其與砧木錯(cuò)位，甚至從接口處脫落，從而降低了嫁接成活率。使用材料處理可以加固接穗與砧木接口處的貼合狀態(tài)，促進(jìn)愈傷組織的形成，加快輸導(dǎo)組織的上下連通，以此提高嫁接成活率。在操作過程中，由于硅膠管口徑大小固定，在處理直徑過小的嫁接苗時(shí)很容易造成松動(dòng)，而錫箔紙則具有很強(qiáng)的可塑性，更適合用來作為接口處理材料。

表2 不同接口捆綁材料處理后的嫁接成活率

2.3 四種不同組合方式對(duì)嫁接成活率的影響

嫁接結(jié)果如表3所示，采用接穗不帶葉片、砧木帶葉片的嫁接組合成活率最低，二者均不帶葉片的組合成活率次之。接穗帶有葉片、砧木不帶葉片的成活率最高，一個(gè)月后的生長(zhǎng)狀況也最好。造成這種現(xiàn)象的原因可能是由于莖尖段的細(xì)胞生長(zhǎng)活躍，代謝力較強(qiáng)，可以合成大量促進(jìn)接口愈合生長(zhǎng)的生長(zhǎng)素類與細(xì)胞分裂素類，更好地促進(jìn)了嫁接苗的愈合與生長(zhǎng)[9]。而在實(shí)際操作中，砧木帶有葉片會(huì)對(duì)整個(gè)嫁接過程造成困難，影響了嫁接進(jìn)度。因此，采用“接穗留葉，砧木無葉”的方式能最大程度地提高成活率。

表3 4種不同組合的嫁接成活率及生長(zhǎng)情況

2.4 轉(zhuǎn)基因苗嫁接結(jié)果

將最優(yōu)嫁接方式運(yùn)用到課題組前期通過基因編輯技術(shù)得到的EDR轉(zhuǎn)基因苗當(dāng)中，成活率見表4。由于受部分轉(zhuǎn)基因苗玻璃化現(xiàn)象的影響，部分嫁接苗的成活率會(huì)有所降低。

表4 不同時(shí)間轉(zhuǎn)基因苗的嫁接成活率

2.5 轉(zhuǎn)基因嫁接苗的生長(zhǎng)變化情況

對(duì)不同時(shí)期的轉(zhuǎn)基因嫁接苗進(jìn)行株高統(tǒng)計(jì)，以普通組培苗為對(duì)照，觀察比較兩者的差異性。所得結(jié)果如圖1所示。可以看出，在前半個(gè)月，嫁接苗與組培苗之間幾乎無差異；而后半個(gè)月，普通組培苗的長(zhǎng)勢(shì)更快。造成這種差異的原因可能是砧木接穗愈合過程較為緩慢，且接穗質(zhì)量不高所導(dǎo)致。但兩個(gè)月后，嫁接苗與普通組培苗的生長(zhǎng)高度差異較小。因此，當(dāng)傳統(tǒng)繼代方式無法發(fā)揮作用時(shí)，嫁接可作為一種替代的方法對(duì)目標(biāo)植株進(jìn)行保存培育。

圖1 轉(zhuǎn)基因嫁接苗的株高變化趨勢(shì)

3 討論與結(jié)論

在整個(gè)實(shí)驗(yàn)探究過程中發(fā)現(xiàn)，某些因素對(duì)嫁接成活率有著至關(guān)重要的影響。趙巍巍等[10]以梨為材料研究認(rèn)為，砧木是否帶有葉片對(duì)嫁接成活率影響不大，但砧木保留葉片時(shí)不利于嫁接操作，該觀點(diǎn)與本研究結(jié)果一致。周瑞金等[11]在蘋果微試管嫁接研究中發(fā)現(xiàn)接穗葉片會(huì)增大蒸騰面積，且會(huì)增加嫁接操作中的難度，從而降低嫁接成活率，但當(dāng)接穗沒有葉片或葉片過少時(shí)，接穗又會(huì)缺少向上吸收水分和營(yíng)養(yǎng)的動(dòng)力。Palma 等[12]用 Acacia senegal 作試驗(yàn)研究的結(jié)果表明，離體嫁接時(shí)接穗上必須帶葉片。因此，接穗上的葉片對(duì)試管嫁接成活必不可少。在離體嫁接過程中，對(duì)嫁接結(jié)合部不進(jìn)行薄鋁片綁束可造成愈合不良[9]；在試管嫁接技術(shù)的基礎(chǔ)上馬云霞等[13]用試管內(nèi)離體嫁接快速檢測(cè)法將離體嫁接植株苗培養(yǎng) 2、3 個(gè)月后檢測(cè)出扇葉癥狀。劉真真等[14]通過對(duì)石榴試管苗的嫁接，成功解決石榴在遺傳轉(zhuǎn)化過程中生根困難的問題，縮短了石榴遺傳轉(zhuǎn)化周期。蔣愛麗[15]通過試管微型嫁接的方式成功解決野生山葡萄生根難的問題。郝新意[16]運(yùn)用葡萄微型嫁接手段并結(jié)合病毒定位技術(shù)成功觀察到病毒的轉(zhuǎn)運(yùn)情況。

通過本試驗(yàn)研究得到一套適合葡萄試管嫁接的方式，為改良、挽救葡萄在分子育種過程中得到的不良性狀植株及其相關(guān)后續(xù)研究工作提供技術(shù)支持。選用生長(zhǎng)健壯的砧木是首要條件，在此基礎(chǔ)上采用“砧木無葉，接穗留葉”的方式能提高嫁接成活率并保證操作效率；錫箔紙具有很好的可塑性，采用錫箔紙對(duì)接口進(jìn)行處理，不僅更加簡(jiǎn)便，而且更加牢固。在此基礎(chǔ)上熟練掌握嫁接技術(shù)與組培技能，能大大提高嫁接的成活率。