劉紅梅，張存艷，葉 強，張廷模，郭 力*

? 藥材與資源 ?

基于DNA條形碼技術對喉紅石斛的植物學分類研究

劉紅梅1, 2，張存艷1，葉 強1，張廷模1，郭 力1*

1. 成都中醫(yī)藥大學 西南特色中藥資源國家重點實驗室，四川 成都 611137 2. 電子科技大學，四川省人民醫(yī)院 藥學部（個體化藥物治療四川省重點實驗室），四川 成都 611731

利用DNA條形碼技術探索喉紅石斛的分類歸屬問題，并建立一種新的ITS2二級結(jié)構(gòu)的信息挖掘方法。提取分屬5個組14種石斛的DNA，對ITS序列（ITS1-5.8 S-ITS2）進行PCR擴增，測序，獲得ITS序列；基于序列信息，計算遺傳距離、構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，對ITS2的二級結(jié)構(gòu)進行預測，并對其進行量化、聚類分析。喉紅石斛與黑毛組的矮石斛、長距石斛的遺傳距離最小，NJ系統(tǒng)發(fā)育樹與ITS2二級結(jié)構(gòu)的系統(tǒng)聚類圖均顯示喉紅石斛與黑毛組石斛聚為一支，且喉紅石斛與黑毛組石斛的二級結(jié)構(gòu)圖基本一致。喉紅石斛與黑毛組石斛的親緣關系最近，應歸屬于黑毛組；新建立的ITS2二級結(jié)構(gòu)量化分析方法可提供更多的分類信息，具有更高水平的分類潛能。這是首次運用DNA條形碼進行石斛組間的分類研究，為石斛屬植物系統(tǒng)提供了重要依據(jù)。

喉紅石斛；DNA條形碼；ITS；二級結(jié)構(gòu)；分類鑒定

石斛屬Sw.是蘭科（Orchidaceae）植物中最大的屬之一[1]，大約有1200～1500種，主要分布于亞洲與澳洲[2]，具有良好的藥用與觀賞價值。自1995年以來，《中國植物志》收載了76種石斛屬植物，包括74種石斛和線葉石斛的2個變種，依據(jù)形態(tài)學分類法被分為12個組[3]；自2016年起《中國植物志》網(wǎng)絡版新收載了喉紅石斛[4]，為單列品種，尚未歸類。有研究指出喉紅石斛與矮石斛（黑毛組）形態(tài)相似[5]，認為其隸屬于黑毛組；然而石斛種類繁多，外觀形態(tài)均相似，石斛屬內(nèi)的分類鑒別歷來是蘭科植物分類中最復雜的難題[6-7]，僅依據(jù)與矮石斛的外觀形態(tài)進行歸屬，略顯證據(jù)不足。

DNA條形碼鑒定是近年來生物分類與鑒定的研究熱點，是利用基因組中一段公認標準的、相對較短的DNA片段進行物種鑒定和分類的技術[8]。該技術不受物種形態(tài)學特征與發(fā)育階段的限制，且不受藥材狀態(tài)的限制，新鮮材料、干燥后材料、加工炮制后的材料都可以運用該技術，彌補了經(jīng)典分類學性狀相似且不穩(wěn)定、易受外界因素影響等缺點[9-10]。目前DNA條形碼技術被廣泛應用于石斛的鑒定[11-13]，《中國植物志》中僅喉紅石斛尚未進行歸屬，而將DNA條形碼技術應用于石斛組間的分類鮮有報道。

目前石斛的分子鑒定主要基于核基因（ITS、IGS）與質(zhì)基因（、、、）[14-17]，其中核DNA（rDNA）ITS序列表現(xiàn)出較高的突變率與進化率，是鑒別石斛種屬水平最常用的條形碼。此外，ITS2序列在物種水平或種下水平具有明顯的序列變異性，其二級結(jié)構(gòu)可提高系統(tǒng)發(fā)育樹重建的穩(wěn)定性，為物種在分類水平上提供更多信息。然而，目前對石斛ITS2二級結(jié)構(gòu)的信息挖掘較少且大部分停留在“分子形態(tài)”層面[18]，即分析ITS2二級結(jié)構(gòu)的四個螺旋臂形態(tài)差異，未見“數(shù)據(jù)化”分析。本研究建立了一種新的ITS2二級結(jié)構(gòu)信息挖掘方法，結(jié)合rDNA ITS條形碼的序列分析、遺傳距離、系統(tǒng)發(fā)育關系探究喉紅石斛的分類歸屬，豐富DNA條形碼技術在植物系統(tǒng)進化與分類的應用。

1 材料與儀器

1.1 材料

本研究所用14種石斛采自四川、云南，由成都中醫(yī)藥大學張廷模教授鑒定，樣品信息見表1。

表1 石斛樣品信息

1.2 儀器與試劑

全自動冷凍球磨儀（上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司），Sartorius BP121s電子分析天平（Sartorius公司，德國），UPT-II-107優(yōu)普系列超純水器（成都超純水科技有限公司），T100 PCR儀、自動凝膠成像系統(tǒng)、核酸蛋白檢測儀，電泳儀、電泳槽（Bio-Rad公司，美國）；MK200-2型干式恒溫箱（杭州奧盛儀器有限公司）、Allegra X-30R Centrifuge高速冷凍離心機（Beckman Coulter公司，美國）、HVE-50型高壓蒸汽滅菌器（Hirayama公司，日本）、VOREX-5型渦旋混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；植物DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）；引物由成都擎科梓熙生物技術有限公司合成。

2 方法

2.1 DNA提取、PCR擴增及測序

取各石斛樣品約100 mg，加入液氮后，用快速球磨儀研磨3 min （30次/s），用植物DNA提取試劑盒提取總DNA。以樣品DNA作為模板，對ITS進行PCR擴增，正向引物P1：5’-CGTAACAAGGTT- TCCGTAGGTGAAC-3’，反向引物P2：5’- TTATTGATATGCTTAAACTCAGCGGG-3’。反應體系為：25 μL 2×Easy Taq PCR Super Mix，正反引物各2.0 μL，1.0 μL模板DNA和20 μL蒸餾水。PCR擴增程序為94 ℃變性3 min；94 ℃變性40 s；56.4 ℃退火40 s；72 ℃延伸5 min，循環(huán)35次。反應產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測純度后，送至成都擎科梓熙生物技術有限公司進行測序。

2.2 數(shù)據(jù)處理

將所得的測序峰圖利用Codon Code Aligner V 6.0.2 （Codon Code Co.，美國）進行校對拼接，除去引物區(qū)和低質(zhì)量的序列，將獲得的序列提交到美國國立生物技術信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）進行Blast比對，獲得標準的ITS1-5.8 S-ITS2與ITS2間隔區(qū)序列。采用 MEGA 5.0計算K2P（Kimura 2-parameter）遺傳距離，同時截取云南石仙桃此區(qū)域序列作為系統(tǒng)發(fā)育樹的外族群，構(gòu)建鄰接（neighbor-joining，NJ）系統(tǒng)發(fā)育樹，并根據(jù)Bootstrap（1000次重復）檢驗各分支的支持率，對ITS2的二級結(jié)構(gòu)進行預測（http://its2. bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de/）。測量二級結(jié)構(gòu)四個螺旋的長度、角度以及每個螺旋環(huán)的個數(shù)，采用SPSS 18.0統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進行聚類分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 石斛ITS序列分析

由表2可知，14種石斛的ITS序列有327個變異位點，變異率為50.9%；5.8 S序列有20個變異位點，變異率為12.3%；ITS1序列有157個變異位點，變異率為65.6%；ITS2有150個變異位點，變異率為60.5%，變異率大小順序：ITS1＞ITS2＞ITS＞5.8 S。由此可見，5.8 S基因序列趨于保守，在物種間變化小，而內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS1和ITS2作為非編碼區(qū)，變異率在60%以上，這也是選擇ITS序列作為石斛分類的基礎。此外，鳥嘌呤和胞嘧啶所占的比率稱為GC含量，GC含量越高，DNA的密度也越高，且熱及堿穩(wěn)定性也越高，ITS區(qū)域的GC含量在47.2%～54.5%（平均含量為52.0%），5.8 S的GC含量在56.4%～59.6%（平均含量為58.3%），ITS1的GC含量在43.2%～53.3%（平均含量為48.9%），ITS2的GC含量在44.7%～54.7%（平均含量為50.6%），GC含量由小到大順序為ITS1＜ITS2＜ITS＜5.8 S。結(jié)果發(fā)現(xiàn)GC含量的大小順序與變異率的順序恰好相反，由此可以得出結(jié)論：GC含量越低，DNA序列的穩(wěn)定性相對較低，則變異率越高。

3.2 遺傳距離分析

蘭科石仙桃屬植物與石斛屬植物非常相似，以截取的云南石仙桃（AF362911）ITS序列為外族群，與14種石斛的ITS序列建立遺傳距離矩陣（表3）。

表2 14種石斛的ITS序列信息

表3 石斛種間遺傳距離分析

由表3可知，14種石斛的種間遺傳距離在0～0.293，其中草葉組間的遺傳距離為0.056，頂葉組間的遺傳距離為0.148，黑毛組間的遺傳距離為0.026，石斛組間的遺傳距離為0.119～0.155，不同組間的遺傳距離具有差異性。草葉組與黑毛組的組間遺傳相似度高，與其他組的遺傳距離均在0.224以上，黑毛組與其他組的距離均在0.113以上，表明草葉組和黑毛組的組內(nèi)接受率高，且組間拒絕率高，更宜用于組間的鑒別與分類研究。而喉紅石斛與黑毛組中矮石斛與長距石斛的遺傳距離最低，分別為0、0.026。因此，從遺傳距離的角度分析，喉紅石斛更支持歸屬于黑毛組。此外，14種石斛與外族種云南石仙桃的遺傳距離范圍為0.239～0.360，總體上高于石斛屬內(nèi)遺傳距離，表明石斛屬內(nèi)的遺傳分化程度低于外族群。

3.3 系統(tǒng)發(fā)育樹分析

根據(jù)ITS1-5.8 S-ITS2序列對所有石斛樣品與云南石仙桃構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹，利用Bootstrap 1000次檢驗各分支的支持率（圖1）。

由NJ系統(tǒng)發(fā)育樹可知，草葉組石斛的親緣關系很近，梳唇石斛和單葶草石斛以100%的支持率聚為一支，且與劍葉組的刀葉石斛比較近，但支持率僅44%；石斛組的曲軸石斛、細葉石斛、蘇瓣石斛、美花石斛、羅河石斛與線葉石斛這6種石斛以53%的支持率聚為一支；頂葉組的具槽石斛與聚石斛的親緣關系較遠，未被聚為一支；喉紅石斛與黑毛組的矮石斛、長距石斛以100%的支持率聚為一支。由此可以看出，系統(tǒng)發(fā)育樹的聚類結(jié)果同樣支持喉紅石斛歸屬于黑毛組，與K2P遺傳距離的分析結(jié)果一致。

圖1 14種石斛的系統(tǒng)發(fā)育樹(NJ法)

3.4 ITS2二級結(jié)構(gòu)分析

基于14種石斛的ITS2序列，預測其二級結(jié)構(gòu)（圖2），可以看出二級結(jié)構(gòu)由4個螺旋區(qū)組成（Helix Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ），通過統(tǒng)計14種石斛二級結(jié)構(gòu)的螺旋夾角、長度以及莖環(huán)數(shù)目（表4），采用“組間連接”方法，并以平方歐氏距離為度量標準進行系統(tǒng)聚類分析（圖3）。

從二級結(jié)構(gòu)的“分子形態(tài)”（圖2）可以看出，矮石斛、長距石斛與喉紅石斛的二級結(jié)構(gòu)完全一致，該結(jié)果與遺傳距離、系統(tǒng)發(fā)育樹一致，同樣支持將喉紅石斛歸屬于黑毛組。其余大部分石斛的二級結(jié)構(gòu)具有獨特性，螺旋環(huán)的長度、莖環(huán)數(shù)目以及螺旋之間的角度都存在差異。將二級結(jié)構(gòu)“量化”后（圖3），可以明顯看出，除矮石斛、長距石斛、喉紅石斛被聚為一類外，石斛組的美花石斛、羅河石斛、細葉石斛與曲軸石斛也被聚為一類，表明“量化”的二級結(jié)構(gòu)能避免肉眼觀察的局限性，提供更多客觀的石斛組間分類信息。此外，石斛組的蘇瓣石斛與線葉石斛未與其他4種石斛組石斛聚為一類，草葉組與頂葉組的2種石斛也未被聚為一類，表明同組石斛的種間差異或可通過ITS2二級結(jié)構(gòu)進行區(qū)分與鑒別。

圖2 14種石斛的ITS2序列二級結(jié)構(gòu)

表4 ITS2二級結(jié)構(gòu)的量化信息

圖3 ITS2二級結(jié)構(gòu)聚類圖

4 討論

基于DNA條形碼的分子技術是分類鑒定的最新進展，近年來，DNA條形碼在物種鑒定與分類方面得到了快速發(fā)展，并迅速成為了研究熱點。與傳統(tǒng)的形態(tài)鑒定及其他分子標記技術相比，DNA條形碼技術具有操作簡單、快速、重復性和穩(wěn)定性高、結(jié)果可靠[8]的優(yōu)勢。目前，DNA條形碼在石斛中的應用非常廣泛，包括物種鑒定、系統(tǒng)分類、物種進化、植物育種、資源保護等領域[7]。

喉紅石斛作為《中國植物志》石斛屬下唯一未被分類的品種，其分類歸屬問題亟待解決。前人[5]根據(jù)外觀形態(tài)指出喉紅石斛與矮石斛相似，應歸屬于黑毛組。本文從石斛的rDNA ITS序列信息、遺傳距離、NJ系統(tǒng)發(fā)育樹以及ITS2二級結(jié)構(gòu)多方面對喉紅石斛的分類進行研究，均發(fā)現(xiàn)喉紅石斛與黑毛組石斛的親緣關系非常接近，因此認為喉紅石斛應該被歸為黑毛組石斛，本研究結(jié)果更加可靠，且為DNA條形碼作為石斛分類以及系統(tǒng)發(fā)育的研究提供了有力證據(jù)。

陳士林等[8]指出二級結(jié)構(gòu)的差異主要體現(xiàn)在以下3點：①HelixⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ之間的夾角；②Helix Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的長度；③HelixⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ上面莖、環(huán)的數(shù)目與形狀。基于此，本研究在以往根據(jù)遺傳距離與系統(tǒng)發(fā)育樹進行分類鑒定研究的基礎上，建立了一種新的利用ITS2二級結(jié)構(gòu)進行數(shù)據(jù)分析的方法，該方法打破了以往“看圖說話”的主觀分析模式，首次將二級結(jié)構(gòu)圖的差異性“量化”，為物種鑒定與分類提供更多、更準確的信息。如草葉組的梳唇石斛與單葶草石斛，其遺傳距離（0.056）與系統(tǒng)發(fā)育樹（100%支持率）結(jié)果都顯示它們親緣關系非常近，筆者通過ITS2序列建立系統(tǒng)發(fā)育樹統(tǒng)同樣顯示兩者的支持率為100%，這也導致二者種間鑒別比較困難，而通過ITS2二級結(jié)構(gòu)圖以及二級結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)聚類分析可以明顯將兩者區(qū)分開，該結(jié)果表明ITS2二級結(jié)構(gòu)的信息具有用于植物更高水平的分類與鑒別研究的潛能，與遺傳距離和系統(tǒng)發(fā)育樹分析可以進行相互驗證與補充，整套方法體系更加科學完整，為石斛屬植物的不同水平上分類研究提供了可靠的方法。同時也為其他植物的DNA條形碼的進一步研究提供借鑒與參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Botanical Classification ofbased on DNA barcode technology

LIU Hong-mei1, 2, ZHANG Cun-yan1, YE Qiang1, ZHANG Ting-mo1, GUO Li1

1. State Key of Characteristic Chinese Medicine Resources in Southwest China , Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China 2. Personalized Drug Therapy Key Laboratory of Sichuan Province, Department of Pharmacy, Sichuan Provincial People's Hospital, University of Electronic Science and Technology of China, Chengdu 611731, China.

To explore the classification ofby using DNA barcode technology, and establish a new information mining method for ITS2 secondary structure.Extraction of DNA from 14 Dendrobium species belonging to 5 groups. The ITS sequence (ITS1-5.8 S-ITS2) was amplified by PCR and sequenced to obtain ITS sequence. Based on the sequence information, the genetic distance was calculated and the phylogenetic tree was constructed. The secondary structure is predicted, quantified and clustered.The genetic distance ofare closest toandbelong to Section Formosae. NJ phylogenetic tree and ITS2 secondary structure cluster diagram also showed thatand Dendrobium species which belong to Section Formosae were divided into one branch. The secondary structure ofis consistent with that of Section Formosae.The relationship among theand Dendrobium species of Section Formosae are the closest, andshould be categorized as the Section Formosae. The newly established quantitative analysis method of ITS2 secondary structure can provide more classification information and have higher classification potential. This is the first time that DNA barcode has been used to classify and identify among Dendrobium groups, which provides an important basis for the identification and classification of Dendrobium resources.

Rchb. f.; DNA barcode; ITS; secondary structure; taxonomy and identification

R282.12

A

0253 - 2670(2021)21 - 6656 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.21.023

2021-03-06

國家自然科學基金國家基礎人才培養(yǎng)項目（J1310034-18）；國家重點研發(fā)項目（2017YFC1701804）；成都中醫(yī)藥大學科技發(fā)展基金（CXTD2018012）

劉紅梅（1992—），女，博士，從事中藥化學成分與質(zhì)量標準化研究。Tel: 18215529213 E-mail: liuhongmei@stu.cdutcm.edu.cn

郭 力，男，博士，博士生導師，從事中藥化學成分與質(zhì)量標準化研究。E-mail: guoli@cdutcm.edu.cn

[責任編輯 時圣明]