李艷玲，丁 煌，傅馨瑩，唐 三，陸展輝，楊芙蓉，劉曉丹，鄧常清

? 藥理與臨床 ?

黃芪甲苷配伍三七總皂苷對腦缺血大鼠BMSCs移植后神經修復的影響

李艷玲，丁 煌，傅馨瑩，唐 三，陸展輝，楊芙蓉，劉曉丹*，鄧常清*

湖南中醫(yī)藥大學，中西醫(yī)結合心腦疾病防治湖南省重點實驗室，細胞生物學與分子技術湖南省高校重點實驗室，湖南 長沙 410208

探討黃芪甲苷IV（astragaloside IV，AST IV）與三七總皂苷（saponins，PNS）配伍聯(lián)合骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）移植對腦缺血大鼠神經功能修復的影響。大鼠隨機分為對照組、模型組、AST IV（10 mg/kg）與PNS（25 mg/kg）低劑量組、AST IV（20 mg/kg）與PNS（50 mg/kg）高劑量組、BMSCs輸注組、BMSCs輸注聯(lián)合AST IV（10 mg/kg）與PNS（25 mg/kg）低劑量組、BMSCs輸注聯(lián)合AST IV（20 mg/kg）與PNS（50 mg/kg）高劑量組。全骨髓貼壁法分離、純化BMSCs，流式細胞術檢測BMSCs表面標志物CD29、CD90、CD34、CD45陽性表達率。各給藥組給予藥物進行干預，采用大腦中動脈阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）建立局灶性腦缺血模型，采用Longa法測定各組大鼠神經功能缺損癥狀；采用蘇木素-伊紅（HE）染色與尼氏染色測定各組大鼠腦組織病理變化；采用免疫熒光法檢測各組大鼠海馬區(qū)BMSCs和神經元特異性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）陽性表達；采用Western blotting法測定各組大鼠腦組織腦源性神經營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）和膠質細胞源性神經營養(yǎng)因子（glial cell line derived neurotrophic factor，GDNF）蛋白表達。成功分離培養(yǎng)BMSCs，表面標志物CD29、CD90、CD34、CD45鑒定符合BMSCs特征。大鼠腦缺血后出現(xiàn)神經功能缺損癥狀及腦組織病理損傷，模型組大鼠神經功能缺損評分和腦組織細胞損傷率顯著升高（＜0.01），尼氏體數(shù)量顯著減少（＜0.01）；各給藥組均能夠不同程度減輕上述病理改變，其中效應最強為BMSCs輸注聯(lián)合AST Ⅳ＋PNS高劑量組（＜0.01），優(yōu)于單用藥物和單用BMSCs輸注。大鼠腦缺血后神經元損傷，輸注BMSCs后，細胞可在缺血側腦組織增殖并分化為神經元，藥物聯(lián)合BMSCs輸注能夠增強BMSCs在大鼠腦內的增殖和分化。大鼠腦缺血后，BDNF和GDNF蛋白表達增加，各藥物組均能夠不同程度上調其表達，其中效應最強為BMSCs輸注聯(lián)合ASTⅣ＋PNS組（＜0.01），優(yōu)于單用藥物和單用BMSCs輸注。AST Ⅳ配伍PNS能夠促進BMSCs移植的存活，靶向修復腦缺血后受損神經元，其機制可能與改善腦缺血后腦內局部微環(huán)境，促進移植干細胞的存活、增殖和分化有關。

黃芪甲苷；三七總皂苷；骨髓間充質干細胞；腦缺血；增殖；遷移；神經分化

缺血性腦損傷的病因和發(fā)病機制復雜，具有高發(fā)病率、高死亡率、高致殘率和治療費用高等特點，且目前受治療時間窗限制，臨床上大部分病人均未得到有效的救治。骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）具有向神經細胞分化的潛力，其移植后對缺血性實驗大鼠的神經功能具有改善作用，為神經系統(tǒng)疾病的治療提供了一種新的治療途徑[1]。但目前BMSCs的移植存在在實驗動物腦內成活率較低且向神經細胞定向分化能力不足等問題。因此，促進BMSCs移植后在體內的增殖并向神經細胞定向分化是目前研究的重點。近年研究發(fā)現(xiàn)[2-4]，中藥復方及有效單體能夠誘導BMSCs的分化，開辟了中藥干預BMSCs治療心腦血管疾病的新途徑。

黃芪甲苷IV（astragaloside IV，AST IV）和三七總皂苷（saponins，PNS）是黃芪和三七發(fā)揮心腦血管保護效應的有效組分。本課題組前期大量研究證實[5-7]，黃芪總苷的有效成分AST IV和PNS配伍可多靶點、多環(huán)節(jié)發(fā)揮對缺血性腦損傷的神經保護作用，并在體外能夠促進缺血再灌注模型BMSCs增殖、遷移，抑制其凋亡，誘導其向神經元、星形膠質細胞定向分化?；诖?，本研究采用大腦中動脈栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）建立缺血性腦損傷模型，觀察黃芪和三七主要有效成分AST IV和PNS配伍促BMSCs移植對MCAO大鼠神經修復的作用，為中藥有效組分配伍促進腦缺血后神經修復的治療提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

3周齡SPF級雄性SD大鼠，體質量（150±20）g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物合格證號ZS-202008110006；8周齡SPF級雄性SD大鼠，體質量（220±20）g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物合格證號ZS-202008040008。動物飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心，實驗動物許可證號SKY（湘）2013-0005。實驗前適應性飼養(yǎng)5～7 d，造模前禁食12 h，自由飲水。動物的使用符合科技部《關于善待實驗動物的指導性意見》相關規(guī)定，批準號LLBH-202004290001。

1.2 藥品與試劑

AST IV（質量分數(shù)為98%，批號AF9102805）、PNS（質量分數(shù)為90%，批號AF20033002）購自成都埃法生物科技有限公司；PKH26Red Fluorescent Cell Linker Mini Kit（批號MINI25-1KT）購自美國Sigma公司；CD29-FITC（批號HMb1-1）、CD90-FITC（批號HIS51）、CD34-PI（批號4H11）、CD45-PI（批號OX1）購自美國eBioscience公司；兔抗大鼠腦源性神經營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）單克隆抗體（批號ab108319）、兔抗大鼠膠質細胞源性神經營養(yǎng)因子（glial cell line derived neurotrophic factor，GDNF）單克隆抗體（批號ab176564）、兔抗大鼠神經元特異性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）單克隆抗體（批號ab180943）購自英國Abcam公司；兔抗大鼠β-actin單克隆抗體（批號20536-1-AP）、山羊抗兔IgG二抗（批號SA00001-2）購自美國Thermo Fisher Scientific公司；L-DMEM培養(yǎng)基（批號AF29527017）購自美國Hyclone公司；胎牛血清（批號SA190501）購自武漢普諾賽生命科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒（批號A00445）購自杭州聯(lián)科生物技術股份有限公司；MCAO栓線（批號2634-A4）購自北京西濃科技有限公司；FITC標記的山羊抗兔熒光二抗（批號GB27303）購自武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.3 儀器

CO2培養(yǎng)箱（德國Heraeus公司）；SW-CJ-1FD型超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；DxP Athenatm流式細胞儀（上海迪發(fā)儀器儀表有限公司）；Chemi-DoC-XRS+化學發(fā)光成像分析儀、CYTATION5多功能酶標成像系統(tǒng)儀（美國Bio-Rad公司）；BX51光學顯微鏡（日本Olympus公司）；Eclipse C1正置熒光顯微鏡（日本Nikon公司）。

2 方法

2.1 BMSCs分離、培養(yǎng)及鑒定

根據(jù)課題組前期方法[7]，取體質量（150±20）g的SD大鼠進行BMSCs分離、培養(yǎng)以及細胞表面標志物CD29、CD90、CD34、CD45的檢測。大鼠尾iv第3代BMSCs（1×104/mL）前用PKH26Red Fluorescent Cell Linker Mini Kit進行細胞標記使細胞自發(fā)紅光。

2.2 大鼠MCAO模型制備

參照Longa法改良[8]，取體質量（220±20）g的SD大鼠，ip 10%水合氯酸（300 mg/kg）麻醉，頸正中切口，依次分離右側頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈，結扎右側頸總動脈近心端、頸外動脈及其所有分支動脈，在右側頸總動脈分叉處做一切口，向右側頸內動脈方向插入栓線，推進17～20 mm感阻力時停止，固定栓線，縫合皮膚，此時即完成一側大腦中動脈阻塞。對照組大鼠僅分離血管，不進行血管結扎及線栓導入。

2.3 分組及給藥

根據(jù)前期的研究結果[6]，將大鼠隨機分為對照組、模型組、AST IV（10 mg/kg）與PNS（25 mg/kg）低劑量組、AST IV（20 mg/kg）與PNS（50 mg/kg）高劑量組、BMSCs輸注組、BMSCs輸注聯(lián)合AST IV（10 mg/kg）與PNS（25 mg/kg）低劑量組、BMSCs輸注聯(lián)合AST IV（20 mg/kg）與PNS（50 mg/kg）高劑量組，每組10只。藥物以0.5%羧甲基纖維素鈉（CMCNa）配制成相應質量濃度的混懸液。于造模前1 d，各給藥組ig 1 mL相應藥物，2次/d，并尾iv 1 mL 0.9%氯化鈉溶液，1次/d；對照組和模型組ig等體積0.5% CMCNa并尾iv等體積0.9%氯化鈉溶液。于給藥后24 h行MCAO，術后除BMSCs輸注組及BMSCs輸注與藥物聯(lián)用組外同前給藥，BMSCs輸注組尾iv BMSCs并ig等體積0.5% CMCNa，BMSCs輸注與藥物聯(lián)用組尾iv BMSCs并ig相應藥物，術后連續(xù)給藥2 d。缺血7 d后處死大鼠，取材。

2.4 Longa法測定大鼠神經功能評分

大鼠造模清醒后每天采用Longa神經功能評分法進行評分。評分標準：0分，無神經功能缺損體征；1分，患側前爪不能完全伸展，為輕度神經功能缺損；2分，行走時大鼠身體向癱瘓側轉圈，為中度神經功能缺損；3分，行走時大鼠身體向癱瘓側傾倒，為重度神經功能缺損；4分，不能自發(fā)性走并伴有意識障礙。選取實驗第7天的評分結果進行分析。

2.5 蘇木素-伊紅（HE）染色考察大鼠腦組織病理變化

造模7 d后，再次麻醉大鼠，以0.9%氯化鈉溶液進行心臟灌注后，斷頭取腦，將腦組織置于4%多聚甲醛固定，固定結束后進行切片、二甲苯脫蠟、乙醇梯度脫水、蘇木素染色、清洗、伊紅染色、乙醇梯度脫水、封片，于顯微鏡下觀察并拍照，采用Image J軟件分析缺血側腦組織海馬CA1區(qū)的病理損傷情況，計算每個視野下的總細胞數(shù)和損傷細胞數(shù)，計算細胞損傷率。

細胞損傷率＝損傷細胞數(shù)/總細胞數(shù)

2.6 尼氏染色測定神經細胞的損傷

取各組大鼠損傷側腦組織，置于4%多聚甲醛固定，固定結束后進行切片、脫蠟、甲基紫染色、沖洗、分化、封片，于顯微鏡下觀察并拍照，采用Image J軟件統(tǒng)計單位面積下尼氏體染色陽性數(shù)。

2.7 熒光雙標法測定大鼠海馬區(qū)BMSCs和NSE表達

取各組大鼠損傷側腦組織，固定后切片，石蠟切片脫蠟，置于盛滿EDTA抗原修復緩沖液（pH 8.0）的修復盒中，于微波爐進行抗原修復；滴加3% BSA孵育30 min進行封閉，滴加兔抗大鼠NSE單克隆一抗（1∶500），濕盒內4 ℃孵育過夜；滴加FITC標記的山羊抗兔熒光二抗（1∶500），加入自發(fā)熒光淬滅劑5 min，流水沖洗10 min；滴加DAPI染液，封片，烘干后于顯微鏡下觀察并拍照，BMSCs為自發(fā)的紅色熒光，NSE為FITC標記的綠色熒光。采用Image J軟件分析BMSCs和NSE共表達區(qū)的熒光強度，以熒光強度表示蛋白表達。

2.8 Western blotting檢測大鼠腦組織BDNF和GDNF蛋白表達

取大鼠大腦患側視交叉后3～4 mm腦組織25 mg，提取總蛋白，采用BCA蛋白定量法測定蛋白質量濃度，蛋白樣品經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF膜，于5%脫脂牛奶中封閉1～2 h，分別加入兔抗大鼠β-actin單克隆抗體（1∶10 000）、兔抗大鼠BDNF單克隆抗體（1∶8000）、兔抗大鼠GDNF單克隆抗體（1∶8000），4 ℃孵育過夜；TBST清洗3次，再加入山羊抗兔二抗（1∶10 000），37 ℃孵育1 h，TBST洗膜后，顯影，采用Image Lab軟件分析條帶灰度值。

2.9 統(tǒng)計分析

3 結果

3.1 BMSCs的鑒定

如圖1所示，BMSCs表面抗原CD29、CD90、CD34、CD45陽性率分別為80.4%、88.1%、4.5%、10.4%，原代細胞符合BMSCs表面抗原特征，鑒定為BMSCs。

3.2 AST IV與PNS配伍聯(lián)合BMSCs對大鼠神經功能評分的影響

如圖2所示，與對照組比較，模型組大鼠出現(xiàn)明顯的神經功能障礙，神經功能評分顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組神經功能評分顯著降低（＜0.05、0.01）；與AST IV＋PNS低、高劑量組比較，BMSCs輸注聯(lián)合AST IV＋PNS低、高劑量組神經功能評分顯著下降（＜0.01）；與BMSCs輸注組比較，BMSCs輸注聯(lián)合AST IV＋PNS低、高劑量組神經功能評分顯著降低（＜0.01）。

3.3 AST IV與PNS配伍聯(lián)合BMSCs對腦組織形態(tài)損傷的影響

如圖3、4所示，對照組海馬CA1區(qū)無明顯病理學改變，錐體細胞排列整齊規(guī)則，形態(tài)完整，胞核飽滿，核仁清晰，染色質分布均勻。與對照組比較，模型組CA1區(qū)錐體細胞缺失較多，而且殘留的錐體細胞排列不整齊，形態(tài)不完整，多數(shù)錐體細胞的細胞核固縮，核仁不清晰，細胞損傷率顯著升高（＜0.01）。與模型組比較，各給藥組細胞損傷率顯著降低（＜0.05、0.01）；與AST Ⅳ＋PNS低、高劑量組比較，AST Ⅳ＋PNS低、高劑量組聯(lián)合BMSCs輸注組細胞損傷率顯著降低（＜0.01）；與BMSCs輸注組比較，BMSCs輸注聯(lián)合AST Ⅳ＋PNS低、高劑量組細胞損傷率顯著降低（＜0.01）。

圖1 流式細胞術檢測BMSCs表面抗原

1-對照組 2-模型組 3-AST IV＋PNS低劑量組 4-AST IV＋PNS高劑量組 5-BMSCs輸注組 6-BMSCs輸注聯(lián)合AST IV＋PNS低劑量組 7-BMSCs輸注聯(lián)合AST IV＋PNS高劑量組 與對照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：▲P＜0.05 ▲▲P＜0.01；與BMSCs輸注聯(lián)合AST IV＋PNS低劑量組比較：**P＜0.01；與BMSCs輸注聯(lián)合AST IV＋PNS高劑量組比較：&&P＜0.01；與BMSCs輸注組比較：■■P＜0.01，圖4、7同

3.4 AST IV與PNS配伍聯(lián)合BMSCs對大鼠海馬區(qū)尼氏體數(shù)目的影響

如圖5和表1所示，對照組海馬CA1區(qū)神經元胞質內可見大量深藍色斑塊狀尼氏體；與對照組比較，模型組尼氏體數(shù)量顯著減少（＜0.01）；與模型組比較，AST Ⅳ＋PNS低、高劑量組以及BMSCs輸注組、BMSCs輸注聯(lián)合AST Ⅳ＋PNS低、高劑量組尼氏體數(shù)量顯著增加（＜0.01）；與AST Ⅳ＋PNS低、高劑量組比較，AST Ⅳ＋PNS低、高劑量聯(lián)合BMSCs輸注組尼氏體數(shù)量顯著增多（＜0.01）；與BMSCs輸注組比較，BMSCs輸注聯(lián)合AST Ⅳ＋PNS低、高劑量組尼氏體數(shù)量顯著增多（＜0.01）。

3.5 AST IV與PNS配伍聯(lián)合BMSCs對大鼠腦組織NSE蛋白表達的影響

如圖6所示，與BMSCs輸注組比較，BMSCs輸注聯(lián)合AST IV＋PNS高劑量組海馬區(qū)NSE/ BMSCs陽性表達顯著升高（＜0.05）。

圖3 AST IV與PNS配伍聯(lián)合BMSCs對大鼠腦組織海馬區(qū)病理變化的影響(HE, ×200)

3.6 AST IV與PNS配伍聯(lián)合BMSCs對大鼠腦組織BDNF和GDNF蛋白表達的影響

如圖7所示，與對照組比較，模型組大鼠腦組織BDNF和GDNF蛋白表達水平顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組BDNF蛋白表達水平顯著升高（＜0.01），AST Ⅳ＋PNS低、高劑量組以及BMSCs輸注組GDNF蛋白表達水平顯著降低（＜0.05），BMSCs輸注聯(lián)合AST Ⅳ＋PNS低、高劑量組GDNF蛋白表達水平顯著升高（＜0.01）；與AST Ⅳ＋PNS低、高劑量組比較，BMSCs輸注聯(lián)合AST Ⅳ＋PNS低劑量組BDNF和GDNF蛋白表達水平顯著升高（＜0.01），BMSCs輸注聯(lián)合AST Ⅳ＋PNS高劑量組腦組織BDNF蛋白表達水平顯著降低（＜0.01），GDNF蛋白表達水平顯著升高（＜0.01）。

圖4 AST IV與PNS配伍聯(lián)合BMSCs對大鼠腦組織海馬區(qū)細胞損傷率的影響(, n = 5)

4 討論

缺血性腦損傷的病理是一個復雜的級聯(lián)反應，目前已知的病理機制主要有興奮性氨基酸毒性、氧自由基過度生成、Ca2+超載、炎性反應等，這些病理反應引起的微環(huán)境變化發(fā)生在腦缺血的各個階段且相互作用[9]，造成血腦屏障破壞、血管損傷、神經細胞腫脹，發(fā)生炎型反應，產生大量的有害因子，進一步加重腦損傷。針對腦缺血后的各種損傷變化，對神經細胞給予及時的保護，對減少神經功能缺損、改善預后具有重要意義。BMSCs是一種多能干細胞，具有來源廣、易培養(yǎng)、低免疫原性和無倫理學爭議的優(yōu)勢，可作為治療神經系統(tǒng)疾病的理想種子[10]，其治療神經系統(tǒng)疾病的主要方式為直接修復和間接修復：直接修復是BMSCs直接分化神經細胞參與組織的修復和再生；間接修復則是BMSCs通過分泌一些物質從而達到組織的修復作用[11-12]。但單一的BMSCs移植后在實驗動物腦內存活率低和定向分化為神經細胞的能力不足，這可能與缺血后腦內微環(huán)境的改變有關。

圖5 AST IV與PNS配伍聯(lián)合BMSCs對大鼠海馬區(qū)尼氏體的影響 (×200)

表1 AST IV與PNS配伍聯(lián)合BMSCs對大鼠海馬區(qū)尼氏體數(shù)目的影響(, n = 5)

與對照組比較：##＜0.01；與模型組比較：▲▲＜0.01；與BMSCs輸注聯(lián)合AST IV＋PNS低劑量組比較：**＜0.01；與BMSCs輸注聯(lián)合AST IV＋PNS高劑量組比較：&&＜0.01；與BMSCs輸注組比較：■■＜0.01

#< 0.05##< 0.01control group;▲< 0.05▲▲< 0.01model group;**< 0.01BMSCs infusion combined with AST IV + PNS low dose group;&&< 0.01BMSCs infusion combined with AST IV + PNS high dose group;■■< 0.01BMSCs infusion group

傳統(tǒng)醫(yī)學認為，腦缺血屬于腦卒中范疇，氣虛血瘀為其主要病機，益氣活血法為其主要治法。黃芪和三七是治療心腦血管的主要有效中藥，黃芪益氣，三七活血，兩者配伍具有益氣活血的功效。本課題組前期對黃芪和三七的有效組（成）分配伍抗缺血性腦損傷的作用進行了系統(tǒng)研究[13-17]，發(fā)現(xiàn)AST IV配伍PNS可減輕腦組織炎型反應、抑制神經細胞凋亡、改善腦組織能量代謝、提高腦缺血后神經細胞存活率、促進神經功能的修復，進而改善腦缺血后微環(huán)境；最新研究發(fā)現(xiàn)[7]，AST IV配伍PNS在體外可促進BMSCs向神經元和星形膠質細胞分化。

1-BMSCs輸注組 2-BMSCs輸注聯(lián)合AST IV＋PNS低劑量組 3-BMSCs輸注聯(lián)合AST IV＋PNS高劑量組 與BMSCs輸注組比較：■P＜0.05

圖7 AST IV與PNS配伍聯(lián)合BMSCs對大鼠腦組織BDNF和GDNF蛋白表達的影響(, n = 5)

為進一步驗證AST IV配伍PNS是否能夠改善腦缺血后微環(huán)境，促進BMSCs移植后細胞的存活、增殖及定向分化，減輕腦缺血后神經損傷，本研究建立MCAO模型，探究AST IV配伍PNS對腦缺血大鼠BMSCs移植后神經修復的影響。結果顯示，MCAO損傷后，動物發(fā)生明顯的神經功能缺損，腦組織發(fā)生病理損傷，尼氏體明顯減少，提示腦缺血可導致大鼠腦組織損傷；各給藥組均能不同程度減輕腦組織損傷，且BMSCs輸注與藥物聯(lián)用組療效最佳；腦缺血后BDNF和GDNF蛋白表達水平升高，提示腦缺血后腦內微環(huán)境會發(fā)生應激變化，AST IV配伍PNS低、高劑量組以及BMSCs輸注組、BMSCs輸注聯(lián)合藥物低、高劑量組均能夠促進BDNF蛋白表達，BMSCs輸注聯(lián)合藥物低、高劑量組均能夠促進GDNF蛋白表達，但與BMSCs輸注聯(lián)合藥物相比，BMSCs輸注組效果不佳，可能與缺血微環(huán)境改變有關，提示AST Ⅳ配伍PNS主要通過促進BDNF和GDNF蛋白表達改善缺血后微環(huán)境，從而促進BMSCs移植后的存活和增殖。此外，BMSCs輸注聯(lián)合藥物組的免疫熒光共染結果顯示，NSE/BMSCs陽性表達升高，提示藥物可促進BMSCs向神經元的分化。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)AST IV配伍PNS一方面可減輕腦缺血后的腦組織損傷，促進BMSCs的存活，另一方面可通過改善腦缺血后的微環(huán)境促進BMSCs向神經元分化，發(fā)揮神經修復的作用。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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[16] 歐陽波, 劉曉丹, 楊筱倩, 等. 冰片配伍黃芪甲苷和三七總皂苷通過Notch信號通路對大鼠腦缺血再灌注損傷模型的神經保護作用 [J]. 中草藥, 2020, 51(23): 5990-5997.

[17] 劉曉丹, 鄧常清. 黃芪甲苷和三七總皂苷中主要有效成分抗PC12細胞氧化損傷的配伍研究 [J]. 湖南中醫(yī)藥大學學報, 2012, 32(1): 8-12.

Effect of astragaloside IV combined withsaponins on nerve repair after BMSCs transplantation in rats with cerebral ischemia

LI Yan-ling, DING Huang, FU Xin-ying, TANG San, LU Zhan-hui, YANG Fu-rong, LIU Xiao-dan, DENG Chang-qing

Hunan Provincial Key Laboratory of Cell Biology and Molecular Technology, Hunan Provincial Key Laboratory of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Hunan University of Traditional Chinese Medicine, Changsha 410208, China

To investigate the effect of astragaloside IV (AST IV) andsaponins (PNS) combined with bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) transplantation on neural function repair in rats with cerebral ischemia.Rats were randomly divided into control group, model group, AST IV (10 mg/kg) + PNS (25 mg/kg) low dose group, AST IV (20 mg/kg) + PNS (50 mg/kg) high dose group, BMSCs infusion group, BMSCs infusion combined with AST IV (10 mg/kg) and PNS (25 mg/kg) low dose group, BMSCs infusion combined with AST IV (20 mg/kg) and PNS (50 mg/kg) high dose group. BMSCs were isolated and purified by whole bone marrow adherent method. The positive expression rates of CD29, CD90, CD34 and CD45 were detected by flow cytometry. Each drug administration group was given drugs for intervention, model of focal cerebral ischemia was established by middle cerebral artery occlusion (MCAO). Longa method was used to determine the symptoms of neurological deficits in each group of rats; Hematoxylin-eosin (HE) staining and Nissl staining were used to determine the pathological changes in brain tissue of each group of rats; Immunofluorescence was used to detect positive expressions of neuron specific enolase (NSE) and BMSCs in hippocampus of rats in each group; Western blotting was used to determine brain-derived neurotrophic factor (BDNF) and glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF) protein expressions in brain tissue of rats in each group.BMSCs were isolated and cultured successfully. The surface markers CD29, CD90, CD34 and CD45 were identified to be in accordance with the characteristics of BMSCs. Neurologic defects and pathological damage of brain tissue occurred after cerebral ischemia. Neurological deficit score and brain tissue cell damage rate in model group were significantly increased (< 0.01), and number of Nissl bodies was significantly reduced (< 0.01). Each administration group alleviated the above-mentioned pathological changes to varying degrees. Among them, the strongest effect was BMSCs infusion combined with AST Ⅳ + PNS high dose group (< 0.01), which was better than the single drug and BMSCs infusion. Neurons were damaged after cerebral ischemia in rats. After BMSCs infusion, cells could proliferate and differentiate into neurons in ischemic brain tissue. The infusion of drugs and BMSCs could enhance the proliferation and differentiation of BMSCs in brain of rats. After cerebral ischemia in rats, BDNF and GDNF protein expressions were increased, and each drug group could increase their expression to varying degrees. Among them, the strongest effect was BMSCs infusion combined with AST IV + PNS group (< 0.01), which was better than single drug and BMSCs infusion.AST Ⅳ combined with PNS can promote the survival of bone marrow mesenchymal stem cells transplantation and repair the damaged neurons after cerebral ischemia. The mechanism may be related to improve the local microenvironment after cerebral ischemia and promote the survival, proliferation and differentiation of transplanted stem cells.

astragaloside IV;saponins; BMSCs; cerebral ischemia; proliferation; migration; neural differentiation

R285.5

A

0253 - 2670(2021)21 - 6537 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.21.011

2021-04-19

國家自然科學基金資助項目（81904181）；湖南省自然科學基金資助項目（2018JJ3382）；湖南省教育廳優(yōu)秀青年項目（18B236）；湖南省科技廳科技創(chuàng)新平臺與人才計劃項目（2017SK4005）；湖南中醫(yī)藥大學研究生創(chuàng)新課題（2020CX63）

李艷玲（1995—），女，碩士研究生，研究方向為心腦血管疾病的中醫(yī)藥防治。Tel: 15108955149 E-mail: 374038521@qq.com

鄧常清（1963—），男，教授，博士生導師，從事心腦血管疾病及中藥（成）分配伍研究。Tel: (0731)88458710 E-mail: dchangq@sohu.com

劉曉丹（1985—），女，實驗師，研究方向為心腦血管疾病的中醫(yī)藥防治。E-mail: 314086131@qq.com

[責任編輯 李亞楠]