曹語珈，王 凱，王子麗，邊金煥，安禮友，許舒雯，龔祝南, *

多花黃精多糖對斑馬魚2型糖尿病合并骨質(zhì)疏松癥模型的藥效學研究

曹語珈1，王 凱2#，王子麗1，邊金煥3，安禮友3，許舒雯2*，龔祝南1, 3*

1. 南京師范大學食品與制藥工程學院，江蘇 南京 210046 2. 安徽省科學技術研究院，安徽 合肥 230031 3. 南京師范大學生命科學學院，江蘇 南京 210046

研究多花黃精多糖對斑馬魚幼魚2型糖尿病合并骨質(zhì)疏松癥的作用。用鏈脲佐菌素和潑尼松龍建立斑馬魚幼魚2型糖尿病合并骨質(zhì)疏松癥模型，設置對照組、模型組、二甲雙胍＋依替膦酸二鈉組和多花黃精多糖（60、120、240 μg/mL）組，考察藥物對斑馬魚早期發(fā)育毒性的影響；采用試劑盒測定各組幼魚組織的糖含量；采用茜素紅染色法考察各組斑馬魚頭骨礦化面積和骨密度；采用qRT-PCR法檢測各組斑馬魚骨質(zhì)疏松相關基因Runx家族轉(zhuǎn)錄因子2b（Runx family transcription factor 2b，）、Sp7轉(zhuǎn)錄因子（Sp7 transcription factor，）、I型膠原蛋白α2（collagen type I α2，）、富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白質(zhì)因子（cysteine-rich acidic secreted protein，）和維生素D受體b（vitamin D receptor b，）mRNA表達情況。顯微注射鏈脲佐菌素和浸泡潑尼松龍能夠提高幼魚組織糖濃度，降低頭骨礦化面積和骨密度。與模型組比較，多花黃精多糖顯著上調(diào)斑馬魚幼魚2型糖尿病合并骨質(zhì)疏松癥模型、、、、mRNA表達水平（＜0.05、0.01、0.001）。多花黃精多糖對斑馬魚幼魚2型糖尿病合并骨質(zhì)疏松癥模型有較好的降血糖及抗骨質(zhì)疏松癥作用。

斑馬魚；多花黃精；多糖；糖尿病；骨質(zhì)疏松

糖尿病是一種以高血糖為特征的代謝紊亂性疾病[1]，高血糖可增加晚期糖基化終端產(chǎn)物的蓄積，抑制成骨細胞的形成，激活破骨細胞，成骨細胞和破骨細胞的平衡被打破，影響骨的正常形成，從而導致骨質(zhì)疏松的發(fā)生，因此2型糖尿病患者很容易產(chǎn)生骨質(zhì)疏松這一并發(fā)癥[2-3]?，F(xiàn)代醫(yī)學采用降糖、促進骨生成、抗氧化等常規(guī)治療，均存在不足與局限，而中藥治療具有顯著的潛力和優(yōu)勢，正逐漸被接受和使用。黃精系藥食同源的多年生草本植物，具有補氣養(yǎng)陰、健脾、潤肺、益腎之效[4]。現(xiàn)代藥理學研究表明，黃精的主要成分黃精多糖具有降血糖、調(diào)血脂、抗腫瘤、抑菌、抗炎、抗病毒、增強免疫等作用[5]。多花黃精Hua屬天門冬科黃精屬植物，與滇黃精、黃精一同收錄于《中國藥典》2020年版[6]。目前，多花黃精多糖的降血糖合并骨質(zhì)疏松癥研究鮮有報道。

本研究通過分析多花黃精多糖對2型糖尿病合并骨質(zhì)疏松癥斑馬魚幼魚模型的組織糖含量、骨骼礦化面積、積累光密度[7]和骨代謝相關因子表達等影響，來評價多花黃精多糖對糖尿病合并骨質(zhì)疏松的作用，以期為后續(xù)研究提供參考。

1 材料

1.1 動物

AB系野生型斑馬魚購自上海費曦生物科技有限公司。

1.2 藥材

黃精于2016年7月采自安徽省青陽縣九華山地區(qū)，經(jīng)南京師范大學生命科學院龔祝南教授鑒定為天門冬科植物多花黃精Hua的根莖。

1.3 藥品與試劑

多花黃精多糖（批號20191113）由安徽省科學技術研究院提供；Runx家族轉(zhuǎn)錄因子2b（Runx family transcription factor 2b，）、Sp7轉(zhuǎn)錄因子（Sp7 transcription factor，）、I型膠原蛋白α2（collagen type I α2，）、富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白質(zhì)因子（cysteine-rich acidic secreted protein，）、維生素D受體b（vitamin D receptor b，）、引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；鏈脲佐菌素（批號20191022）購自廣州賽國生物科技有限公司；潑尼松龍（批號c10788051）、鹽酸二甲雙胍（批號c10440628）購自上海麥克林生化科技有限公司；依替膦酸二鈉（批號20191015）購自中國藥品生物制品檢定所；茜素紅S（批號20191203）、檸檬酸（批號20190409）購自國藥集團化學試劑有限公司；檸檬酸鈉（批號190311-1）購自西隴科學股份有限公司；QuantiChrom? Glucose Assay Kit葡萄糖測試盒購自北京群曉科苑生物技術有限公司。

1.4 儀器

恒溫光照培養(yǎng)箱（寧波東南儀器有限公司）；IM-9B型手動斑馬魚顯微注射泵（日本Narishige公司）；qRT-PCR儀（瑞士Roche公司）；EVOS新型顯微鏡細胞成像系統(tǒng)（美國Life Technologies公司）。

2 方法

2.1 多花黃精多糖的制備

多花黃精經(jīng)洗凈烘干，切片，粉粹成60目，備用。取0.5 kg多花黃精粉末加入5倍量水，85 ℃水浴回流提取2次，2 h/次，濾過，取濾液，恒溫水浴濃縮至一定體積，濾過除渣。所得濾液加3倍量100%乙醇，于4 ℃放置24 h，抽濾后減壓干燥得沉淀，冷凍干燥所得粉末即為黃精粗多糖。由安徽省科學技術研究院提取并檢測，采用苯酚硫酸法測定多花黃精粗多糖的質(zhì)量分數(shù)為63.7%[8]。

2.2 實驗培養(yǎng)液及藥液的制備

2.2.1 10×E3斑馬魚胚胎培養(yǎng)液的制備 稱取NaCl 1 462.5 mg、KCl 63.325 mg、CaCl2242.583 mg、MgSO4198 mg，加入適量單蒸水溶解，超聲20 min，待全部溶解后移入500 mL量瓶中，定容，于4 ℃保存?zhèn)溆?，后續(xù)用單蒸水稀釋10倍使用。

2.2.2 500 μg/mL鏈脲佐菌素母液的制備 稱取0.015 g鏈脲佐菌素粉末，加入適量純凈水溶解，超聲5 min，保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.3 1 mg/mL鹽酸二甲雙胍母液的制備 稱取0.025 g鹽酸二甲雙胍粉末，加入適量純凈水溶解，超聲5 min，保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.4 120 μg/mL潑尼松龍母液的制備 稱取2.6 mg潑尼松龍粉末，滴加微量二甲基亞砜（DMSO）使其溶解后，再加入適量純凈水，磁力攪拌器攪拌3 min，保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.5 180 μg/mL依替膦酸二鈉母液的制備 稱取6.3 mg依替膦酸二鈉固體，加入適量純凈水溶解，超聲5 min，保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.6 480 μg/mL多花黃精多糖母液的制備 稱取16.8 mg多花黃精多糖粉末，加入適量純凈水溶解，超聲10 min，保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 藥物對斑馬魚早期發(fā)育毒性的影響

挑選受精后第2天（2 dpf）的斑馬魚胚胎，置24孔板，每孔6個胚胎，設置對照組、鏈脲佐菌素（50、100、200、300、400、500 μg/mL）、潑尼松龍（5、10、20、40、80、120 μg/mL）、二甲雙胍（50、100、200、400、800、1000 μg/mL）、依替膦酸二鈉（30、60、90、120、150、180 μg/mL）和多花黃精多糖（80、160、240、320、400、480 μg/mL）組，設置3個平行復孔，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3天換1次液，給藥周期為8 d，每8小時觀察幼魚的狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)死亡的魚卵或幼魚及時挑出，4 dpf通過EVOS新型顯微鏡細胞成像系統(tǒng)觀察斑馬魚給藥后的形態(tài)變化，計算胚胎孵化率和死亡率，繪制最佳“死亡率-濃度”效應曲線，用GraphPad Prisr 6.0軟件擬合得出半數(shù)致死濃度（half lethal concentration，LC50）值[9]。

胚胎孵化率＝孵化的胚胎數(shù)量/總胚胎數(shù)量

胚胎死亡率＝死亡胚胎數(shù)量/總胚胎數(shù)量

2.4 斑馬魚幼魚2型糖尿病合并骨質(zhì)疏松癥模型的建立和給藥

選擇2 dpf的斑馬魚胚胎放置在瓊脂糖魚卵固定板上，采用顯微注射方式在卵黃囊部位注射2 nL鏈脲佐菌素（200 μg/mL），注射完成的胚胎立即放回E3培養(yǎng)液，以免停留時間過久導致胚胎死亡，影響死亡率。注射后每8小時觀察，移除脫下的卵黃膜，4 dpf后轉(zhuǎn)移到24孔板中（6尾/孔）并采用直接浸泡潑尼松龍（10 μg/mL）方式造模。置24孔板，6尾/孔，設置對照組、模型組、二甲雙胍（150 μg/mL）＋依替膦酸二鈉（30 μg/mL）組和多花黃精多糖（60、120、240 μg/mL）組，每組90～100尾。培養(yǎng)周期為4 d，隔2 d換新液體，直至8 dpf。

2.5 幼魚組織的糖含量測定

由于無法在幼魚身上獲得血液樣本，因此測定整個魚體勻漿中的糖含量。給藥后4 dpf和8 dpf的斑馬魚幼魚每組各取30尾，加入200 μL冰PBS溶液充分研磨，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，采用QuantiChrom? Glucose Assay Kit葡萄糖測試盒進行測定。

2.6 斑馬魚礦化骨骼定量分析

取培養(yǎng)至8 dpf的斑馬魚幼魚置于培養(yǎng)皿中，加入4%多聚甲醛，4 ℃固定過夜；用磷酸鹽吐溫緩沖液（PBST）洗3遍，用0.5% KOH和3% H2O2的漂白劑脫色30 min至斑馬魚無黑色素，去除漂白劑后，加入4%多聚甲醛，4 ℃固定過夜；PBST清洗3次，甲醇梯度洗脫，置換20% DMSO-80%甲醇，于?20 ℃保存；4 h后復水和染色，用PBST洗3遍，于0.5% KOH配制的茜素紅染液中染色過夜，室溫避光孵育12 h以上，去除染色液，用PBST洗3遍，再更換為80%甘油，避光保存，于顯微鏡下拍照，采用Image pro plus 6.0軟件分析頭部骨骼染色面積和骨密度。

2.7 qRT-PCR檢測骨質(zhì)疏松相關基因mRNA表達

從對照組、模型組、二甲雙胍＋依替膦酸二鈉組和多花黃精多糖（60、120、240 μg/mL）組選取25尾8 dpf斑馬魚幼魚，按照試劑盒說明書提取斑馬魚組織總RNA并合成cDNA，進行qRT-PCR分析。引物序列見表1。

2.8 統(tǒng)計學分析

表1 引物序列

3 結果

3.1 斑馬魚早期發(fā)育死亡率和孵化率

選取2 dpf斑馬魚胚胎給藥，培養(yǎng)7 d得出鏈脲佐菌素、潑尼松龍、二甲雙胍、依替膦酸二鈉和多花黃精多糖對斑馬魚幼魚的LC50（表2）。從圖1可以看出，480 μg/mL多花黃精多糖給藥后斑馬幼魚很快死亡，320 μg/mL多花黃精多糖給藥5 d后斑馬魚出現(xiàn)明顯死亡且死亡率較低，并且在6 dpf之后死亡率保持不變；斑馬魚孵化率在3～4 dpf時保持不變。

表2 各藥物對斑馬魚幼魚的LC50值 (6 dpf)

圖1 多花黃精多糖對斑馬魚死亡率和孵化率的影響

3.2 多花黃精多糖對斑馬魚幼魚形態(tài)和心臟毒性的影響

4 dpf斑馬魚魚卵已經(jīng)發(fā)育成熟，幼魚將從絨毛膜中孵化出，同時心臟已經(jīng)發(fā)育[10]，因此選擇4 dpf時間點進行毒性暴露和心臟毒性分析。圖2清晰地展示了不同質(zhì)量濃度多花黃精多糖給藥后斑馬魚幼魚形態(tài)和心臟組織形態(tài)變化。發(fā)育異常的斑馬魚的腹部或腹部周圍會發(fā)生水腫或出血現(xiàn)象，造成身體畸形包括脊柱彎曲和折尾等，同時斑馬魚幼魚心臟組織形態(tài)發(fā)生異常，心包囊腫等癥狀逐漸加重。從圖中可以看出，與對照組比較，多花黃精多糖（160 μg/mL）組斑馬魚出現(xiàn)輕微腹部水腫和心臟毒性，400 μg/mL多花黃精多糖組斑馬魚水腫和心包囊腫明顯，呈劑量相關性。結合LC50值，后續(xù)實驗多花黃精多糖給藥質(zhì)量濃度為60～240 μg/mL，避免影響斑馬魚幼魚發(fā)育異常和死亡。

圖2 多花黃精多糖對斑馬魚幼魚形態(tài)和心臟毒性的影響(×10)

3.3 多花黃精多糖對幼魚組織糖含量的影響

使用QuantiChrom? Glucose Assay Kit葡萄糖測試盒檢測組織糖含量。在0～300 mg/dL內(nèi)，斑馬魚幼魚組織糖含量與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關系，得到的標準曲線回歸方程：＝0.000 9＋0.001，＝0.999 9；其中，是葡萄糖測試盒中對照品溶液的質(zhì)量濃度，是吸光度。

當模型組斑馬魚的血糖水平高于對照組3倍時，可認為糖尿病斑馬魚造模成功[11-12]。如圖3所示，2 dpf斑馬魚胚胎注射鏈脲佐菌素后，4 dpf模型組斑馬魚幼魚的組織糖含量為3.457 nmol/尾，明顯高于對照組的1.063 nmol/尾，為對照組的3.25倍。潑尼松龍浸泡給藥后8 dpf模型組糖含量為3.068 nmol/尾，為對照組的2.88倍，表明給予潑尼松龍后，斑馬魚幼魚達到2型糖尿病的檢測標準，因此斑馬魚幼魚2型糖尿病模型構建成功。

圖3 多花黃精多糖對幼魚組織糖含量的影響(, n = 3)

與模型組比較，二甲雙胍＋依替膦酸二鈉組和多花黃精多糖（60、120、240 μg/mL）組斑馬魚組織糖含量有降低的趨勢，且呈劑量相關性。由于高劑量多花黃精多糖對幼魚會有形態(tài)和心臟毒性，未能進一步加大給藥濃度充分驗證其降糖作用。

3.4 斑馬魚礦化骨骼定量分析

各組8 dpf斑馬魚腹面頭骨茜素紅染色的顯微成像見圖4，斑馬魚頭骨礦化面積和骨密度見圖5。與對照組相比，模型組斑馬魚頭骨礦化面積和骨密度顯著降低（＜0.01、0.001），表明鏈脲佐菌素＋潑尼松龍成功誘導了糖尿病斑馬魚骨質(zhì)疏松模型。與模型組比較，多花黃精多糖組斑馬魚頭骨礦化面積和骨密度顯著升高（＜0.05、0.01），且呈劑量相關性。

3.5 qRT-PCR檢測成骨細胞基因mRNA表達

如圖6所示，與對照組比較，模型組斑馬魚、、、、mRNA表達水平均顯著降低（＜0.05、0.001）；與模型組比較，多花黃精多糖組、、、、mRNA表達水平均顯著升高（＜0.05、0.01、0.001），且呈劑量相關性。

4 討論

2型糖尿病患者的血糖比正常人偏高[13]，一方面由于外周血管粥樣硬化使血供明顯減少，易出現(xiàn)肢體壞疽，運動負荷減小，嚴重影響骨質(zhì)量；另一方面糖尿病微血管病變[14]，造成骨組織的血液不能正常供應，血液內(nèi)營養(yǎng)障礙，影響骨質(zhì)量和骨密度，這些都會使骨質(zhì)疏松發(fā)生的風險隨之增加。降糖藥物主要影響2型糖尿病患者血糖水平，但對機體除血糖外的其他指標也有一定影響。自從研究人員發(fā)現(xiàn)噻唑烷二酮類降糖藥物[15]有增加骨折的風險后，就廣泛開展了大量關于降糖藥物和骨代謝及骨密度的臨床試驗和動物實驗。多項研究顯示，各類降糖藥物在穩(wěn)定血糖的同時也對骨代謝造成影響，因此預防糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展，改善骨代謝對患者有重要作用[16]。

圖4 骨骼染色的顯微成像 (×10)

與對照組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01 ###P＜0.001；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001，圖6同

圖6 多花黃精多糖對斑馬魚Runx2b、Sp7、vdrb、sparc、col1a2 mRNA表達的影響(, n = 3)

本研究利用斑馬魚體型小、易飼養(yǎng)、繁殖周期短等其他模式生物不具備的優(yōu)點[17-18]建立2型糖尿病合并骨質(zhì)疏松癥斑馬魚幼魚模型。通過加入不同濃度的藥物觀察并統(tǒng)計對斑馬魚生長發(fā)育的影響，選擇給予鏈脲佐菌素（200 μg/mL）和潑尼松龍（10 μg/mL）進行造模，通過試劑盒測定斑馬魚組織糖含量后，采用茜素紅對斑馬魚礦化骨骼進行固定染色，分析骨礦化面積和骨密度。結果表明，給予鏈脲佐菌素和潑尼松龍后能夠建立2型糖尿病合并骨質(zhì)疏松癥斑馬魚幼魚模型。

黃精是中醫(yī)臨床常用的治療消渴癥較為有效的中藥。黃精多糖是黃精的主要有效成分，黃精可入腎經(jīng)，中醫(yī)理論認為腎主骨生髓，因此黃精多糖具有應用于治療骨代謝相關疾病的潛在作用[19]。本研究利用2型糖尿病合并骨質(zhì)疏松癥斑馬魚幼魚模型研究多花黃精多糖降血糖和抗骨質(zhì)疏松作用，通過qRT-PCR法檢測多花黃精多糖對2型糖尿病合并骨質(zhì)疏松癥斑馬魚模型成骨細胞標志基因、、、、mRNA表達的影響，結果顯示，與模型組比較，多花黃精多糖可以通過上調(diào)和mRNA表達，調(diào)控成骨細胞分化過程中轉(zhuǎn)錄級聯(lián)反應，共同加速成骨細胞分化；而vdrb這種維生素D受體轉(zhuǎn)錄因子，能調(diào)節(jié)體內(nèi)鈣或磷酸鹽的吸收，多花黃精多糖能夠上調(diào)和mRNA表達，有助于皮膚、骨骼、肌腱以及其他纖維連接組織。sparc不僅在骨骼組織中引起活躍的礦化作用，還能夠促進與游離的鈣離子結合。因此，多花黃精多糖能夠不同程度地降低2型糖尿病合并骨質(zhì)疏松癥斑馬魚組織糖濃度，上調(diào)成骨細胞相關因子表達，促進成骨細胞分化，恢復維持骨骼礦化，加快骨重建。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Pharmacodynamics study of polysaccharide fromon zebrafish model with type 2 diabetic and osteoporosis

CAO Yu-jia1, WANG Kai2, WANG Zi-li1, BIAN Jin-huan3, AN Li-you3, XU Shu-wen2, GONG Zhu-nan1,3

1. School of Food and Pharmaceutical Engineering, Nanjing Normal University, Nanjing 210046, China 2. Anhui Academy of Science and Technology, Hefei 230031, China 3. School of Life Sciences, Nanjing Normal University, Nanjing 210046, China

To study the effect of polysaccharide from(PSP) on type 2 diabetes and osteoporosis in juvenile zebrafish.A zebrafish juvenile type 2 diabetes model with osteoporosis was established with streptozotocin and prednisolone, which were divided into control group, model group, metformin + etidronate disodium group and PSP (60, 120, 240 μg/mL) groups, the effect of drugs on early developmental toxicity of zebrafish was investigated; Kit was used to determine the sugar content of juvenile fish tissues in each group; Alizarin red staining method was used to investigate the mineralized area and bone mineral density in bones of zebrafish in each group; qRT-PCR was used to detect osteoporosis-related genes Runx family transcription factor 2b (), Sp7 transcription factor (), type I collagen α2 (), cysteine-rich acidic secreted protein () and vitamin D receptor b () mRNA expressions in zebrafish.Microinjection of streptozotocin and immersion of prednisolone increased the sugar concentration of juvenile fish tissues, reduced the mineralized area and bone density of skull. Compared with model group, PSP significantly up-regulated mRNA expression levels of,,,andin zebrafish juvenile type 2 diabetes mellitus with osteoporosis model (< 0.05, 0.01, 0.001).PSP has a good hypoglycemic and anti-osteoporosis effect on zebrafish juvenile with type 2 diabetes and osteoporosis.

zebrafish;Hua; polysaccharide; type 2 diabetes; osteoporosis

R285.5

A

0253 - 2670(2021)21 - 6545 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.21.012

2021-04-13

安徽省博士后研究人員科研活動經(jīng)費資助項目（2020A396）；安徽省2020年度中央引導地方科技發(fā)展專項項目（202007d06020007）

曹語珈（1997—），女，碩士研究生，研究方向為藥理學。Tel: 13814780060 E-mail: caoyujiaguodong@hotmail.com

許舒雯，研究員。E-mail: shuwne_xu@163.com

龔祝南，教授，碩士生導師。E-mail: gongzhunan@njnu.edu.cn

#共同第一作者：王 凱（1987—），男，碩士，助理研究員，研究方向為數(shù)據(jù)分析、科研管理。Tel: 17730201081 E-mail: woyun_2002@163.com

[責任編輯 李亞楠]