王樂，王京璐，李智英，田夢緣

(邵陽學院 基礎醫(yī)學院，湖南 邵陽，422000)

新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)以發(fā)熱、乏力、干咳為主要癥狀。目前COVID-19并未找到特效藥，主要以隔離治療和對癥治療為主。根據臨床數據表明，中藥治療COVID-19效果較好，患者的治愈率與中藥參與率呈正相關[1]，中藥在COVID-19防治中有不可替代的作用。

中成藥喜炎平注射液作為《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第八版)》推薦治療重型病癥中“氣營兩燔證”使用[2]。喜炎平注射液是由蕨科植物穿心蓮中所提取的活性成分穿心蓮內酯，通過磺化生成的穿心蓮內酯磺酸鹽滅菌水溶液，具有良好水溶性[3]，臨床上主要用于抗病毒、抗炎抗菌、抗腫瘤、免疫調節(jié)等[4]。

網絡藥理學是融合了多學科的新興產物，包含了多種數據庫檢索、計算機模擬、網絡分析、數據分析、網絡拓撲分析等方法，以組學和大數據為基礎，構建網絡模型，探索藥物與疾病之間的關聯，并分析闡明了藥物與相關疾病的相互作用關系[5]。本文通過網絡藥理學技術與分子對接研究喜炎平注射液的物質基礎及其治療COVID-19的可能作用機制，同時也為COVID-19的治療和喜炎平注射液的深入研究提供思路。

1 材料與方法

1.1 數據庫及軟件

中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺(TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php)；UniProt數據庫(https://www.uniprot.org/downloads)；PubChem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)；Swiss Target Prediction數據庫(http://old. swisstargetprediction. ch/)；SEA數據庫(http://sea.bkslab.org/)；GeneCards數據庫(https://www.genecards.org/)；Venny繪圖網站(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)；STRING數據庫(https://string-db.org/)；PDB數據庫(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)；Cytoscape3.7.2；OpenBabel-3.1.1軟件；軟件運行環(huán)境：PYMOL&AutoDock tools 1.5.6 & AutoDock Vina 1.1.2操作系統(tǒng)。

1.2 喜炎平注射液主要活性成分篩選及潛在靶點預測

本課題以“穿心蓮”為檢索詞在TCMSP數據庫中獲取喜炎平注射液的化學成分，以口服生物利用度(OB)≥30%，類藥性(DL)≥0.18作為篩選條件對在TCMSP中獲得的化合物進行篩選，得到喜炎平注射液的活性成分。再利用TCMSP對活性成分進行靶標預測，在UniProt數據庫中將靶標蛋白對應Gene Symbol(除去非人源、未經驗證和重復的靶點)，將篩選的化合物在Pubchem中檢索活性成分14-去氧-12-甲氧基穿心蓮內酯(14-deoxy-12-methoxyandrographolide)與14-去氧穿心蓮內酯(14-deoxyandrographolide)的SMLILES，并且在Swiss Target Prediction，SEA數據庫中進行14-deoxy-12-methoxyandrographolide與14-deoxyandrographolide的潛在靶點預測，綜合TCMSP，Swiss Target Prediction和SEA數據庫篩選結果，獲取穿心蓮活性成分對應的潛在作用靶點。14-去氧-11-氧代-穿心蓮內酯與穿心蓮內酯-19-β-D-葡萄糖甙無SMLILES，無法檢索出其潛在靶點預測，故舍去。

1.3 疾病靶點搜集與潛在治療靶點的獲取

以“novel coronavirus pneumonia”作為關鍵詞，檢索Gene Cards數據庫，去除重復，獲得COVID-19相關靶點。

1.4 獲取疾病和藥物交集靶點

使用Venny繪圖網站，將喜炎平注射液潛在作用靶點映射到novel coronavirus pneumonia相關靶點中，制作Venny圖。將兩者的交集作為喜炎平注射液治療COVID-19的潛在作用靶點。

1.5 藥物-疾病-靶點網絡的構建

利用1.4中所獲取的治療靶點與對應的藥物通過Cytoscape制作出“藥物-疾病-靶點”網絡圖，使有效活性成分與疾病核心靶點關系達到可視化。

1.6 蛋白質相互作用(protein-protein interaction，PPI)網絡的構建

將1.4所得到的靶點導入STRING數據庫中，種屬選擇“Homo sapiens”，置信度得分設置為0.4，構建PPI網絡，并將文件“string_interactions.tsv”導入Cytoscape進行網絡拓撲學分析，通過度(Degree)值大于平均值來篩選核心靶點。

1.7 GO富集分析和KEGG通路分析

利用RStudio的GO_barplot.R和GO_ALL_barplot_count_P.adjust.R腳本對治療靶點進行GO富集分析；利用RStudio的KEGGenrich.R和KEGG_bubblePlot.R腳本對治療靶點進行KEGG通路分析。

1.8 分子對接

利用AutoDock tools 1.5.6對喜炎平注射液中對應的活性成分以及關鍵靶點進行半柔性對接，驗證相互作用的活性[6]，并篩選對接打分結果。將活性成分跟與COVID-19相關的SARS-CoV-2 3CL和ACE2進行半柔性對接，驗證相互作用的活性，給對接結果進行打分。

具體步驟：(1)從PubChem數據庫中下載活性成分的3D結構文件(SDF格式)，用OpenBabel-3.1.1軟件將SDF格式轉化成mol2格式，并使用AutoDock tools 1.5.6將mol2格式轉化為pdbqt格式。(2)從PDB數據庫中下載核心靶點的相關結構蛋白(篩選條件設為“Homo sapiens”“X-RAY DIFFRACTION”“Protein”)，利用PYMOL將靶蛋白的pdb格式去水分子，將蛋白質的配體與靶蛋白質分離。利用AutoDock tools 1.5.6將已分離出蛋白質的配體的靶蛋白質與配體的pdb格式轉換成pdbqt格式，并確定對接盒子的配體中心與大小。(3)利用vina腳本將活性成分與靶蛋白質進行對接，并通過對接結果進行打分和作圖。

2 結果

2.1 喜炎平注射液活性成分和潛在靶點

通過TCMSP檢索穿心蓮，按條件篩選出的活性成分共24個，其中4個活性成分(表1)與穿心蓮內酯有關，其預測靶標數量共17個。在Pubchem中檢索活性成分14-deoxy-12-methoxyandrographolide與14-deoxyandrographolide的SMLILES，并且在Swiss Target Prediction，SEA數據庫中進行潛在靶點預測，綜合TCMSP，Swiss Target Prediction和SEA數據庫篩選結果，獲取穿心蓮活性成分14-deoxy-12-methoxyandrographolide與14-deoxyandrographolide的對應潛在作用靶點140個(已去除重復項)。

表1 穿心蓮主要活性成分基本信息

2.2 COVID-19的潛在靶點

通過GeneCards數據庫收集到novel coronavirus pneumonia的潛在靶點438個(已去除重復項)。

2.3 疾病和藥物交集靶點

使用Venny繪圖網站，將喜炎平注射液潛在作用靶點140個映射到novel coronavirus pneumonia相關靶點438個中，制作Venny圖(圖1)。將兩者19個交集靶點作為喜炎平注射液治療COVID-19的潛在作用靶點。

黑色區(qū)域代表預測的藥物靶點；灰色區(qū)域代表疾病靶點

2.4 藥物-疾病-靶點網絡

利用1.4中所獲取的治療靶點與對應的藥物通過Cytoscape構建網絡。制作出藥物-疾病-靶點網絡圖(圖2)。

圖2 喜炎平注射液治療COVID-19藥物-疾病-靶點網絡圖

2.5 PPI網絡

將19個靶點導入STRING數據庫中，將文件“string_interactions.tsv”導入Cytoscape制作PPI網絡，見圖3(A)，圖中19個潛在靶點存在著66條相互作用。利用NetworkAnalyzer進行拓撲學分析，圖中節(jié)點的灰度深淺程度與Degree值呈正相關，灰度越深Degree值越大，見圖3(B)。網絡中節(jié)點Degree平均值為7.33，介值(betweenness centrality，BC)平均值為0.044 117 647。通過Degree值>7.33(平均值)且介值>0.044 117 647(平均值)來篩選核心靶點，見表2。

(A)共同靶點PPI網絡網 (B)核心靶點子網絡

表2 喜炎平注射液治療COVID-19的核心靶點表

2.6 GO和KEGG富集分析

從生物過程(biological process，BP)、細胞組成(cellular component，CC)、分子功能(molecular function，MF)3個功能分別進行GO富集，各組分排名前10名條目見圖4。通路涉及細胞對脂多糖的反應(cellular response to lipopolysaccharide)和細胞對細菌起源分子的反應(cellular response to molecule of bacterial origin)，表明喜炎平注射液的靶點主要與抗炎抗菌有關。

圖4 潛在靶點的GO富集分析

KEGG富集通路分析，得到136條通路，取排名前20條通路制作氣泡圖(圖5)、成分靶點通路圖(圖6)。結果顯示，喜炎平注射液主要通過調節(jié)人類巨細胞病毒感染、新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)、甲型流感、TNF等信號通路起到治療COVID-19的作用。

圖5 潛在靶點的KEGG富集分析

“V”形節(jié)點為信號通路；圓形節(jié)點為潛在靶點；三角形節(jié)點為穿心蓮的有效活性成分

2.7 分子對接

根據2.5的PPI中所分析得到的核心靶點MAPK1，EGFR，MAPK14，JAK1與活性成分14-deoxy-12-methoxyandrographolide，14-deoxyandrographolide進行分子對接，將活性成分14-deoxy-12-methoxyandrographolide，14-deoxyandrographolide與COVID-19相關的基因靶點SARS-CoV-2 3CL和ACE2進行分子對接，見表3。

從表3中數據可知，核心靶點均有較好的結合能，其中，以JAK1的結合效果最佳，具體對接圖見圖7。分子對接結果表明，喜炎平注射液中的活性成分有較好的抗菌抗炎作用，在COVID-19治療中起了一定的作用。

表3 分子對接結果

(A)1～6依次為14-deoxy-12-methoxyandrographolide與SARS-CoV-2 3CL，ACE2，MAPK14，EGFR，MAPK1，JAK1對接; (B)1～6依次為14-deoxyandrographolide與SARS-CoV-2 3CL，ACE2，MAPK14，EGFR，MAPK1，JAK1對接

3 討論

COVID-19以發(fā)熱、乏力、干咳為主要癥狀，重癥患者多在發(fā)病1周后出現呼吸困難和/或低氧血癥，或快速進展為急性呼吸窘迫綜合征、膿毒癥休克、難以糾正的代謝性酸中毒和凝血功能障礙及多器官功能衰竭。喜炎平注射液是一種穿心蓮制劑，穿心蓮味苦，性寒，具有解熱、降溫、免疫調節(jié)、抗炎、抗腫瘤等作用，主要對癥治療COVID-19的重癥癥狀。

在本研究中，通過對網絡藥理學和分子對接研究喜炎平注射液治療COVID-19的機制，發(fā)現COVID-19重型病癥中“氣營兩燔證”可通過注射中成藥喜炎平注射液進行對癥治療，更加確定了中藥在治療COVID-19中的可行性。

通過對喜炎平注射液治療COVID-19的網絡藥理學可知，該藥的核心活性成分為14-deoxy-12-methoxyandrographolide和14-deoxyandrographolide，并對這兩種活性成分進行靶點預測，獲得對應靶點140個，通過與novel coronavirus pneumonia疾病靶點(438個)進行交集，獲得19個喜炎平注射液治療COVID-19的靶點。對這19個交集靶點進行PPI網絡構建，可得到與炎癥相關的核心靶點如MAPK1，EGFR，MAPK14，JAK1。當SARS-CoV-2感染人體后，盡管快速的免疫反應會成為抵抗病毒感染的第一道防線，但過度的炎性反應和受損的宿主免疫防御能力可能會導致組織損傷。尤其是大量的細胞因子和趨化因子釋放，即“細胞因子風暴”，清楚地反映了宿主免疫防御的廣泛失控失調[7]，引起急性呼吸窘迫綜合征與多臟器衰竭，甚至引發(fā)患者死亡。核心靶點絲裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)作為信號從細胞表面轉導到細胞核內部轉導途徑的重要組成部分，是廣泛調控炎癥反應的重要信號轉導通路之一[8]，研究顯示，MAPK成員可通過下調炎癥因子水平來發(fā)揮其抗炎活性[9-10]。在臨床上，與JAK1基因的表達密切相關的烏頭生物堿類藥物用于治療類風濕關節(jié)炎癥[11]。另外，有研究表明，左金方通過下調JAK1相關蛋白的表達來發(fā)揮抗菌作用，減少炎性介質的產生，進而逆轉膿毒癥引起的肺損傷[12]。由此可推測，本研究的核心靶點與炎癥密切相關，對喜炎平注射液治療COVID-19有一定的指導意義。

通過對交集靶點進行GO富集，對BP條目的分析可知，通路涉及細胞對脂多糖的反應和細胞對細菌起源分子的反應，表示喜炎平注射液的靶點可能與抗炎抗菌有關。通過對交集靶點進行KEGG富集分析，前20條中有4條通路與病毒、流感、炎癥有關，如人類巨細胞病毒感染、SARS-CoV-2、甲型流感、TNF信號通路，提示喜炎平注射液可能與抗炎、抗病毒有關，在炎癥反應和免疫調節(jié)中發(fā)揮重要作用，可減輕SARS-CoV-2引起炎性因子釋放和異常增多，減少肝、肺、腎等組織的損傷[13]。其中巨噬細胞與炎癥相關反應的調節(jié)有著密不可分的聯系，有研究表明，喜炎平注射液通過調節(jié)巨噬細胞抑制細胞分泌TNF等炎性因子從而發(fā)揮抗炎作用[14]。在臨床研究中，膿毒癥重癥患者外周血中的TNF-α水平均高于其他患者，由此可見，人體中TNF含量與膿毒癥有較大聯系[15]，喜炎平注射液可通過抑制TNF信號通路來抑制和治療COVID-19引起的炎癥反應和膿毒癥。所以，喜炎平注射液可能通過抑制COVID-19患者體內的炎癥因子風暴、過度的免疫反應等從而發(fā)揮治療COVID-19的功效。

研究發(fā)現，SARS-CoV-2與病毒SARS-CoV有著高達79.5%的同源性，二者受體均為ACE2[16]。ACE2作為SARS-CoV-2細胞內受體是SARS-CoV-2感染并入侵機體的關鍵基因[17]。本研究采用網絡藥理學結合分子對接的方法，從蛋白質相互作用網絡中篩選Degree值、介值均高于平均值的靶點與中藥穿心蓮中的活性成分對接。研究表明，配體與受體結合時所需的結合能越低，發(fā)生作用的可能性越大，結合構象越穩(wěn)定[18]。結合能>-5.0 kcal/moL，說明分子與靶點有較好的結合活性，親和力高；結合能>-0.7 kcal/moL，則說明分子與靶點的結合構型具有強烈的結合活性[19]，親和力強。結果顯示，14-deoxy-12-methoxyandrographolide和14-deoxyandrographolide與SARS-CoV-2 3CL,ACE2核心靶點的結合能均<-5.0 kcal/moL，具有較好的結合活性，與炎癥相關基因JAK1的結合能較其他基因更牢固，故推測活性成分對炎癥有較好療效。

綜上所述，喜炎平注射液可能通過抗病毒、抗炎等相關通路來治療COVID-19。本研究初步確定了喜炎平注射液治療COVID-19的活性成分及其核心靶點的組成，為臨床合理應用提供了一定的理論依據。