楊海雁，于喆源

（張掖市質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，甘肅張掖 734000）

甘油是一種重要的輕化工原料，具有吸濕性強(qiáng)、粘度高、冰點(diǎn)低等特點(diǎn)[1-2]。據(jù)報(bào)道，甘油作為原料有2 000多種用途，應(yīng)用于十多個(gè)行業(yè)，其中在食品工業(yè)中通常作乳化劑、甜味添加劑、保濕物質(zhì)等，在醫(yī)藥工業(yè)中用于溶劑和潤(rùn)滑劑，在國(guó)防工業(yè)中用以制備硝化甘油、生產(chǎn)炸藥或添加到燃料中作為抗凍劑[3-4]。按生產(chǎn)方式不同，甘油主要分為天然甘油、化學(xué)合成甘油、微生物發(fā)酵甘油3種。近年來研究發(fā)現(xiàn)，在特定的培養(yǎng)條件下，許多微生物，包括細(xì)菌、酵母、霉菌、原生動(dòng)物和藻類等均能合成甘油[5-6]，其中利用耐高滲透壓酵母發(fā)酵生產(chǎn)甘油的方法研究較為廣泛。該方法的主要特點(diǎn)是酵母可在較高糖濃度及有氧條件下生長(zhǎng)發(fā)酵，不需要加入轉(zhuǎn)向劑，糖的轉(zhuǎn)化率可高達(dá)60%[7-8]。本文通過優(yōu)化產(chǎn)甘油絲酵母的啟動(dòng)子，使得產(chǎn)甘油假絲酵母更加高效的表達(dá)，從而增加甘油的產(chǎn)量，產(chǎn)生更大的經(jīng)濟(jì)效益。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌JM109、產(chǎn)甘油假絲酵母WL2002-5，由本實(shí)驗(yàn)室保存；Tryptone、Yeast Extract，購(gòu)自O(shè)xoid公司；YPD培養(yǎng)基，購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；T-Vector pMD19（simple）、Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶，購(gòu)自大連Takara公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MJ Mini型PCR儀，美國(guó)伯樂（Bio-Rad）公司；HITACHICR22G型低溫高速離心機(jī)，日本HITACHI公司；Electroporator 2510型電轉(zhuǎn)儀，德國(guó)Eppendorf公司；GelDoc-It310型UVP凝膠成像儀，英國(guó)UVP有限公司；DYCZ-40D型瓊脂糖凝膠水平電泳儀，北京六一廠；BK-FL型熒光顯微鏡，重慶奧特光學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)pCAMBIA1302質(zhì)粒中GFP編碼基因設(shè)計(jì)引物STL1、STL2，為了利于將PCR片段連接到質(zhì)粒pGAPZB上，在上游引物STL2的5’端添加EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，在下游引物STL2的5’端添加SacⅡ酶切位點(diǎn)[9-11]；利用DNAMAN進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，序列如表1所示。

表1 引物序列

1.3.2 PCR體系及反應(yīng)條件

PCR體系具體的材料組成見表2，反應(yīng)條件[12]見表3。

表2 PCR體系組成

表3 PCR反應(yīng)條件

1.3.3 菌體收集

將實(shí)驗(yàn)室保存的產(chǎn)甘油假絲酵母野生菌株在YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)23 h，轉(zhuǎn)接后制作感受態(tài)，用“電轉(zhuǎn)化”和“一步法”將質(zhì)粒pET-STL1-gfp-zeocinrDNA、pET-STL2-gfp-zeocin-rDNA轉(zhuǎn)入到產(chǎn)甘油假絲酵母感受態(tài)中，涂布含有zeocin的YPD平板，在30 ℃烘箱中培養(yǎng)36 h，挑取一部分菌落在YPD培養(yǎng)基中30 ℃，200 r/min搖瓶培養(yǎng)36 h，收集在顯微鏡下有熒光的菌體。

1.3.4 綠色熒光蛋白的檢測(cè)

挑取重組產(chǎn)甘油假絲酵母單菌落接種于10 mL YPD培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min 振蕩過夜，然后1∶100的接種量分別接種于50 mL YPD培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)至OD600值約為0.9，置于4 ℃冰箱中數(shù)小時(shí)至過夜，室溫下8 000 r/min離心1 min，收集菌體沉淀，用PBS緩沖液洗滌3次后，重懸于100 μL PBS緩沖液中。取5～10 μL菌液涂片，在Olympus BX50熒光顯微鏡下觀察，同時(shí)用SONY 3CCD的Color Video Camera 拍照[13-15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)粒構(gòu)建流程圖

質(zhì)粒構(gòu)建的過程如圖1所示。

圖1 質(zhì)粒構(gòu)建流程

2.2 STL1、STL2啟動(dòng)子PCR電泳圖

PCR擴(kuò)增完成后，使用瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，結(jié)果如圖2所示。圖2顯示STL1、STL2啟動(dòng)子PCR條帶明亮、邊界清晰，表明兩條啟動(dòng)子擴(kuò)增成功。

2.3 熒光顯色

將質(zhì)粒pET-STL1-gfp-zeocin-rDNA、pET-STL2-gfp-zeocin-rDNA轉(zhuǎn)入到產(chǎn)甘油假絲酵母感受態(tài)中，經(jīng)培養(yǎng)后，接種到含10%、20%、30%、40%、50%葡萄糖的YPD中，利用熒光顯微鏡觀察不同滲透壓下熒光強(qiáng)弱，結(jié)果如圖3和圖4所示。

圖3 目的菌株（STL1）和野生菌熒光蛋白圖

圖4 目的菌株（STL2）和野生菌熒光蛋白圖

圖3、圖4表明將目的基因電轉(zhuǎn)入產(chǎn)甘油假絲酵母中，通過涂含有zeocin的YPD平板，得到穩(wěn)定的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，在有梯度的YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)，進(jìn)行熒光觀察，顯示有熒光，說明STL1、STL2啟動(dòng)子在產(chǎn)甘油假絲酵母中誘導(dǎo)顯色基因gfp進(jìn)行了表達(dá)，表示試驗(yàn)取得了成功；且根據(jù)與野生菌株熒光強(qiáng)度對(duì)比，表明STL1、STL2啟動(dòng)子轉(zhuǎn)入后，產(chǎn)甘油假絲酵母生命力得到加強(qiáng)。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)利用PCR擴(kuò)增技術(shù)，將釀酒酵母的PSTL啟動(dòng)子轉(zhuǎn)入產(chǎn)甘油假絲酵母中，達(dá)到了優(yōu)化產(chǎn)甘油假絲酵母啟動(dòng)子的目的，使得產(chǎn)甘油假絲酵母更高效的表達(dá)，產(chǎn)生了更高的經(jīng)濟(jì)效益。