孫愛平

（愛科（天津）生物技術有限公司，天津 300308）

牦牛是我國青藏高原特有的牛種，全世界90%的牦牛生活在青藏高原及其周邊地區(qū)，總數(shù)量在1 500萬頭左右。人們在將牦牛肉加工成食品的同時，會將牦牛皮制作成皮革，每年牦牛皮的產(chǎn)量約在180萬張[1]。但是由于牦牛皮周邊的脂肪層較厚，牦牛皮的彈性纖維與脂肪含量都高于一般的牛皮，再加上牦牛皮表面粗糙，部位與部位之間皮質也存在鮮明的差異，與市場上常見的黃牛皮產(chǎn)品相比，牦牛皮幾乎沒有任何的價格優(yōu)勢。這就意味著，如果不能及時找到有效地將牦牛皮變成經(jīng)濟制品的方式，牦牛皮的應用會受到更多的影響和限制。

近年來，膠原蛋白已經(jīng)成為了愛美人士的必備品，無論是化妝品還是食品中都能夠看到膠原蛋白制品的身影[2]。膠原蛋白是一種結締組織中非常重要的結構蛋白質，廣泛分布在皮膚、骨、腱等部位，并起到支撐和保護機體器官的功能。以牦牛皮為原料進行膠原蛋白的制備，不僅可以提升牦牛皮的經(jīng)濟價值，也可以促進對牦牛相關產(chǎn)品的有效開發(fā)利用，避免出現(xiàn)資源浪費。

膠原蛋白提取有多種方式，包括酸法、堿法、熱水法、酶法等[3]。但在實踐應用的過程中發(fā)現(xiàn)，酸水解會破壞膠原蛋白中的色氨酸，而且產(chǎn)率較低，堿水解則會產(chǎn)生消旋作用。與之相比，酶法的運用對膠原蛋白的破壞性更小，而且可以維持所得膠原蛋白的活性，其中堿性蛋白酶的提取率和提取效果均較好[4]。本文利用堿性蛋白酶對牦牛皮膠原蛋白進行提取并對其工藝參數(shù)進行優(yōu)化研究，為牦牛皮的高效利用提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 主要材料

新鮮牦牛皮，西藏金哈達牦牛皮業(yè)有限公司；氯化鈉、硫酸、檸檬酸、氫氧化鈉、無水乙酸鈉，分析純，國藥集團化學試劑有限公司；對二甲氨基苯甲醛、高氯酸、異丙醇、羥脯氨酸，分析純，阿拉丁試劑；堿性蛋白酶，南寧東恒華道生物科技有限責任公司。

1.1.2 主要儀器

XL-2A馬弗爐，杭州卓馳儀器有限公司；SKD-48S2消化爐，上海沛歐分析儀器有限公司；KN580全自動凱氏定氮儀，濟南阿爾瓦儀器有限公司；UV765紫外可見分光光度計，渡揚精密儀器（上海）有限公司；FZG-4真空冷凍干燥機，南京同皓干燥設備有限公司。

1.2 牦牛皮膠原蛋白的制備工藝

1.2.1 工藝流程

牛皮預處理→測定組分→定量加入燒瓶→調節(jié)pH→加入堿性蛋白酶→浸提→收集濾液→鹽析→離心取沉淀→凍干→得到固體膠原蛋白。

1.2.2 操作要點

（1）牛皮預處理。新鮮耗牛皮拔除表面牛毛，刮除皮下結締組織和脂肪后切成5 mm×5 mm左右大小的碎塊，浸泡于濃度為2%的純堿溶液中攪拌脫脂2 h，用清水沖洗多次后瀝干搗碎備用[5]。

（2）牛皮基本組成成分測定。水分含量測定：直接干燥法；灰分含量測定：灼燒重量法；粗蛋白含量測定：凱式定氮法；脂肪含量測定：索氏抽提法。

（3）膠原蛋白的提取。將一定量預處理后的耗牛皮碎塊加入三口燒瓶，控制固液比，用1%的氫氧化鈉溶液調節(jié)體系pH值為9.0后加入一定量的堿性蛋白酶，攪拌浸提[6]。浸提結束后，過濾并收集濾液，在濾液中加入氯化鈉進行鹽析，離心后取沉淀進行透析至無氯離子檢出，將透析后的溶液冷凍干燥得到固體膠原蛋白。

1.3 實驗方法

1.3.1 牦牛皮膠原蛋白提取率的測定

膠原蛋白中含有大量的酪氨酸、脯氨酸、賴氨酸和羥脯氨酸等，而羥脯氨酸為膠原蛋白的特征氨基酸，因此可通過測定羥脯氨酸的含量得到膠原蛋白的含量，按照式（1）計算。

式（1）中：ε為膠原蛋白含量，%；ω為羥脯氨酸含量，%；7.1為陸生動物提取原料系數(shù)；F為稀釋倍數(shù)；T為牦牛皮理論蛋白含量，%。

1.3.2 單因素試驗設計

以浸提固液比、蛋白酶用量、浸提時間、浸提溫度為影響因素設計單因素試驗，以1.3.1中所示膠原蛋白提取率作為實驗結果考察標準，確定最佳試驗條件，從而確定本次正交試驗所采用的牦牛皮膠原蛋白的提取工藝參數(shù)。

1.3.2.1 浸提固液比的確定

在蛋白酶用量為1.5%、浸提時間為12 h、浸提溫度為36 ℃的條件下，設計浸提固液比分別為1∶20（g∶mL）、1∶25（g∶mL）、1∶30（g∶mL）、1∶35（g∶mL）和1∶40（g∶mL），進行牦牛皮膠原蛋白的制備。

1.3.2.2 蛋白酶用量的確定

在浸提固液比為1∶35（g∶mL）、浸提時間為12 h、浸提溫度為36 ℃的條件下，設計蛋白酶用量分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%，進行牦牛皮膠原蛋白的制備。

1.3.2.3 浸提時間的確定

在浸提固液比為1∶35（g∶mL）、蛋白酶用量為1.5%、浸提溫度為36 ℃的條件下，設計浸提時間分別為8 h、10 h、12 h、14 h和16 h，進行牦牛皮膠原蛋白的制備。

1.3.2.4 浸提溫度的確定

牦牛皮的酶解提取膠原蛋白對溫度具有較高的要求，只有處于適宜的溫度環(huán)境中才能夠維持酶的活力，過高或過低都會造成一定的影響。因此，在浸提固液比為1∶35（g∶mL）、蛋白酶用量為1.5%、浸提時間為12 h的條件下，設計浸提溫度分別為34 ℃、35 ℃、36 ℃、37 ℃和 38 ℃，進行牦牛皮膠原蛋白的制備。

1.3.3 正交試驗設計

根據(jù)1.3.2單因素試驗結果，采用L9（34）正交試驗確定最佳提取條件。

2 結果與分析

2.1 牦牛皮的組分

經(jīng)測定，牦牛皮各組分的含量除去水分后，粗蛋白占耗牛皮干重的89.74%，脂肪占耗牛皮干重的5.27%，灰分和其他占比4.99%；對耗牛皮中的膠原蛋白含量進行測定，其質量分數(shù)為26.91%，約占耗牛皮干重的74.98%，約占粗蛋白的84.49%。由此可知，耗牛皮中含有豐富的膠原蛋白[7]。

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 浸提固液比對提取率影響

從圖1可知，隨著浸提固液比的增大，提取率先升高后降低，4號實驗組的牦牛皮膠原蛋白提取率最高。5號在增加了浸提液體積之后提取率反而出現(xiàn)下降，不符合經(jīng)濟要求[8]，所以確定出正交試驗中浸提固液比取4號、3號和2號實驗組，即1∶35（g∶mL）、1∶30（g∶mL）和1∶25（g∶mL）。

圖1 不同浸提固液比對提取率影響試驗

2.2.2 蛋白酶用量對提取率影響

從圖2可以直觀地看出：膠原蛋白提取率隨著蛋白酶用量的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，4號實驗組的蛋白酶用量制備出的牦牛皮膠原蛋白提取率最高。結合經(jīng)濟考量，將5號蛋白酶用量排除參考[9]，確定出正交試驗中蛋白酶用量取4號、3號和2號實驗組，即2.0%、1.5%和1.0%。

圖2 不同蛋白酶用量對提取率影響試驗

2.2.3 浸提時間對提取率的影響

從圖3可以直觀地看出：膠原蛋白提取率隨浸提時間的延長呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，3號實驗組的浸提時間所得牦牛皮膠原蛋白提取率最高。確定出正交試驗中浸提時間取3號、4號和2號實驗組，即12 h、14 h和10 h。

圖3 不同浸提時間對提取率影響試驗

2.2.4 浸提溫度對提取率影響

從圖4中可以直觀地看出：膠原蛋白提取率隨浸提溫度的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，3號實驗組的浸提溫度所得牦牛皮膠原蛋白提取率最高。確定出正交試驗中浸提溫度取3號、2號和1號實驗組，即 36 ℃、35 ℃和 34 ℃。

圖4 不同浸提溫度對提取率影響試驗

2.3 正交試驗結果

通過上述試驗方法及結果，確定出4種單因素的正交試驗水平[10]。分別以浸提固液比（A）、蛋白酶用量（B）、浸提時間（C）和浸提溫度（D）為4個影響因素，使用單因素試驗確定的水平設計正交試驗[11]，見表1。

表1 正交試驗因素水平

如表2所示正交試驗結果可知，4種因素對提取率的影響順序是A＞B＞D＞C，即浸提固液比的影響力最大，蛋白酶用量的影響次之，浸提溫度再次之，最后是浸提時間[12]。其中制備牦牛皮膠原蛋白的最佳條件為A3B2C2D3，即浸提固液比為1∶35（g∶mL），蛋白酶用量為1.5%，浸提時間為12 h，浸提溫度為36 ℃時，提取率最佳。正交試驗最優(yōu)配方與最高提取率組合不一致，以最優(yōu)配方條件進行驗證實驗，結果顯示在最優(yōu)配方條件下膠原蛋白提取率可達68.3%，超過最高提取率組合66.0%，應采用最優(yōu)配方作為最終條件。盡管本次試驗研究配方條件下的膠原蛋白提取率低于70%，但是就前人研究的酶解法提取牦牛皮膠原蛋白的試驗來說，已經(jīng)具備了相對較高的提取率水平，因此本次正交試驗數(shù)據(jù)結果具有參考價值。

表2 正交實驗提取率試驗結果

3 結論

以牦牛皮為原料，先后經(jīng)過牛皮預處理、定量加入燒瓶、調節(jié)pH、加入堿性蛋白酶、浸提、收集濾液、鹽析、離心取沉淀以及凍干等步驟[13]，最終得到牦牛皮的固體膠原蛋白產(chǎn)品。在單因素實驗結果基礎上，以牦牛皮膠原蛋白提取率為考察指標，由正交實驗結果確定制備牦牛皮膠原蛋白的最佳條件是：浸提固液比為1∶35（g∶mL），蛋白酶用量為1.5%，浸提時間為12 h，浸提溫度為36 ℃。

根據(jù)正交實驗所得牦牛皮膠原蛋白制備條件，所得牦牛皮膠原蛋白獲得了較高的提取率水平，在經(jīng)濟層面上也符合最具性價比工藝參數(shù)的要求，具有一定的參考價值，可以在牦牛制品加工生產(chǎn)領域進行推廣和普及。