李萍萍，陳一鳴，顏士茹，張瑞卿，張海毅*，都紅芳

（1.威海職業(yè)學(xué)院 康養(yǎng)學(xué)院，山東威海 264200；2.威海人生藥業(yè)有限公司，山東威海 264200）

巖藻多糖，也稱巖藻多糖硫酸酯，主要來源于褐藻，是一類含有巖藻糖和硫酸基團(tuán)的多糖。巖藻多糖具有多種生物學(xué)功能，如抗凝血、抗腫瘤、抗血栓、抗病毒、抗氧化和增強(qiáng)機(jī)體免疫機(jī)能等，目前對巖藻多糖的研究已經(jīng)成為研究天然海洋藥物和特殊醫(yī)用食品的熱點(diǎn)和主攻方向[1]。360 Market Updates市場數(shù)據(jù)顯示，全球巖藻多糖市場規(guī)模將從2018年的3 000萬美元增至2025年的3 800萬美元，預(yù)測期間（2019—2025年）的年復(fù)合增長率為3.4%，有望被開發(fā)成為21世紀(jì)的新藥品及保健品原料。褐藻是威海市大量產(chǎn)出的特色海產(chǎn)品，以巖藻多糖作為原料開發(fā)的特醫(yī)食品或藥品具有明顯的市場競爭優(yōu)勢，將會(huì)取得顯著的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益，并有利于促進(jìn)威海市海洋生物及制品創(chuàng)新型集群的轉(zhuǎn)型升級(jí)和發(fā)展，增加該集群在全球海洋產(chǎn)業(yè)中的競爭力和影響力。

通過對天然巖藻多糖及半合成巖藻多糖的研究發(fā)現(xiàn)，多糖羥基的硫酸酯化是決定巖藻多糖生物活性的重要因素，因?yàn)榱u基的硫酸酯化，不僅增加了多糖的溶解性，更為重要的是改變了多糖的構(gòu)象，因此巖藻多糖硫酸基含量的高低，直接體現(xiàn)巖藻多糖功效的好壞[2]。

硫酸根的測定方法主要有比濁法和重量法，但是這些傳統(tǒng)方法操作冗雜，需要多種化學(xué)試劑，雜質(zhì)干擾大，靈敏度、重復(fù)性和準(zhǔn)確度都不理想。巖藻多糖水產(chǎn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《巖藻多糖》（SC/T 3404—2012）[3]中規(guī)定了巖藻多糖硫酸基的檢測方法，該方法屬于重量法，適用于水產(chǎn)行業(yè)巖藻多糖硫酸基檢測。而本研究涉及的巖藻多糖主要作為原料藥進(jìn)行研究，有必要依據(jù)《中國藥典》建立新的硫酸基檢測方法。研究表明，采用離子色譜法檢測多糖硫酸基含量，操作簡單，只需一步灰化操作，靈敏度和準(zhǔn)確度都較高[4-10]。

本研究采用灰化法處理巖藻多糖樣品，采用離子色譜法測定原料藥中硫酸基的含量，并參照《中國藥典》四部“9101分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則”中的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證[11]，為巖藻多糖原料藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供硫酸根檢測實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑及物料

硫酸鈉，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；碳酸鈉，色譜純，北京邁瑞達(dá)科技有限公司；巖藻多糖原料藥，批號(hào)分別為A-2017H-1、A-2017H-2、A-2017H-3，威海人生藥業(yè)有限公司；Dionex IonPacTM AS9-HC陰離子色譜柱，賽默飛世爾科技公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

離子色譜系統(tǒng)，青島普仁儀器有限公司；FA2004B電子分析天平，江蘇迅迪儀器科技有限公司；LK-MA高溫馬弗爐，洛陽高新開發(fā)區(qū)格利斯實(shí)驗(yàn)電爐廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 供試品灰化

準(zhǔn)確稱取供試品1.0000 g，按照《中國藥典》四部通則230[11]規(guī)定的方法進(jìn)行灰化并計(jì)算灰分含量。

1.3.2 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

陰離子色譜柱；以9 mmol/L碳酸鈉為淋洗液，柱溫30 ℃；流速為0.8 mL/min；電導(dǎo)檢測器；進(jìn)樣量20 μL，定量環(huán)進(jìn)樣。以硫酸鈉為系統(tǒng)適用性溶液，兩針進(jìn)樣計(jì)算理論板數(shù)、分離度及拖尾因子。

1.3.3 對照品溶液的制備

取105 ℃烘干的硫酸鈉約1.2700 g，加少量水溶解，溶液轉(zhuǎn)移至1 000 mL量瓶中，搖勻，作為對照品溶液。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密吸取對照品溶液2.0 mL、5.0 mL、10.0 mL、20.0 mL，置于100 mL量瓶中，分別加水稀釋至刻度，搖勻，用0.22 μm的濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得標(biāo)準(zhǔn)溶液。取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL注入色譜儀，記錄色譜圖，以硫酸根離子的峰面積為縱坐標(biāo)，以對照品標(biāo)準(zhǔn)溶液硫酸基質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，回歸計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 樣品處理及檢測

取1.3.1遺留的殘?jiān)s20 mg，精密稱定，加水溶解，濾過，濾液轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，用0.22 μm的濾膜過濾，取續(xù)濾液20 μL注入色譜儀，同法測定，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中相當(dāng)于硫酸基的含量。

1.3.6 精密度試驗(yàn)

取硫酸根離子對照品溶液（50 mg/L），連續(xù)進(jìn)樣6次。

1.3.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取批號(hào)為A-2017H-2的巖藻多糖供試品，平行制備6份供試品溶液，進(jìn)樣測定。

1.3.8 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

取批號(hào)為A-2017H-2的巖藻多糖供試品灰分約10 mg，精密稱定，用水溶解并定容至100 mL容量瓶中，搖勻。用該方法的測定條件檢測硫酸基本底值，并進(jìn)行50%、100%、150%加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)處理3個(gè)平行重復(fù)。

1.3.9 供試品測定

取批號(hào)為A-2017H-1、A-2017H-2、A-2017H-3的巖藻多糖供試品照1.3.5項(xiàng)下方法進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

以硫酸鈉（50 mg/L）為系統(tǒng)適用性溶液，兩針進(jìn)樣計(jì)算理論板數(shù)（按硫酸根離子峰計(jì)算）、分離度及拖尾因子,結(jié)果見表1。其中，分離度遠(yuǎn)大于1.5，可以看出氯離子和硫酸根離子得到了很好的分離（圖1），完全消除了重量法中氯離子的干擾。根據(jù)系統(tǒng)適用性試驗(yàn)結(jié)果，確定采用該方法測定巖藻多糖硫酸基含量的系統(tǒng)相關(guān)參數(shù)，硫酸基理論板數(shù)按硫酸根離子峰計(jì)算應(yīng)不低于5 000，硫酸根離子峰與相鄰峰間分離度大于1.5，拖尾因子在0.95～1.25。

表1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)結(jié)果

圖1 硫酸根離子色譜圖

2.2 精密度試驗(yàn)

取硫酸根離子對照品溶液（50 mg/L），連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果見表2。由表2數(shù)據(jù)計(jì)算可得，峰面積測量值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.7%，保留時(shí)間RSD為0.01%，表明儀器精密度良好。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.3 線性關(guān)系試驗(yàn)

硫酸根離子在0～200 mg/L濃度范圍內(nèi)與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，結(jié)果見圖2。線性方程為y=76 926x+107 499（n=5），相關(guān)系數(shù)R2=0.9999。

圖2 硫酸根標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取批號(hào)為A-2017H-2的巖藻多糖供試品，平行制備6份供試品溶液，進(jìn)樣測定,結(jié)果見表3。由表3數(shù)據(jù)計(jì)算可得，供試品溶液平均硫酸根離子含量為14.8%，RSD為1.8%，表明該方法重復(fù)性良好。

表3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.5 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果見表4。加標(biāo)回收率均在96%～101%范圍內(nèi)，平均回收率為98.8%，RSD值為1.7%，表明該方法準(zhǔn)確度較高。

表4 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.6 供試品測定

取3批巖藻多糖原料藥供試品進(jìn)行硫酸基含量測定，結(jié)果見表5。每批供試品測定相對偏差均小于5%，樣品測定結(jié)果穩(wěn)定。

表5 供試品含量測定結(jié)果

3 結(jié)論

本文采用灰化法處理巖藻多糖樣品，采用離子色譜法測定原料藥中硫酸基的含量，以《中國藥典》為依據(jù)建立方法，并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。該方法可以快速有效地檢測巖藻多糖供試品中硫酸基含量，無干擾，結(jié)果穩(wěn)定，準(zhǔn)確度和精密度良好，是一種測定巖藻多糖硫酸基含量的理想方法。

與巖藻多糖水產(chǎn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SC/T 3404—2012規(guī)定的重量法相比，本研究采用的離子色譜法有效消除了氯離子的干擾，而且可以對氯離子進(jìn)行定量分析。同時(shí)，該方法不需要加入任何化學(xué)試劑，經(jīng)濟(jì)環(huán)保，只需一步灰化操作，簡單可行，大大縮短檢驗(yàn)時(shí)間，提高檢測效率。通過將樣品灰化后進(jìn)行檢測消除了有機(jī)物對硫酸根離子檢測的干擾，拓寬了檢測方法的應(yīng)用范圍。該方法已成功應(yīng)用于巖藻多糖原料藥硫酸基的檢測，為巖藻多糖原料藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供參考，為當(dāng)前巖藻多糖市場上的產(chǎn)品提供質(zhì)量控制依據(jù)。