郭嘉鵬，羅微，章慧，劉梁，趙玲，劉華英，陳新*

（1.武漢輕工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北武漢 430023；2.湖北來鳳騰升香料化工公司，湖北恩施 445000）

來鳳鳳菊（Dendranthema indicumvar.aromaticum）為菊科菊屬植物，民間常用于感冒、咽喉腫痛和目赤腫痛等疾病的治療。其花、莖、葉中化學(xué)成分豐富，多為揮發(fā)油、黃酮、萜等脂溶性成分，抗氧化、抗菌、抗炎等藥理活性顯著。近年來，眾多學(xué)者對(duì)來鳳鳳菊的揮發(fā)油、黃酮類等成分進(jìn)行了相關(guān)研究[1]。

現(xiàn)代藥理研究表明，植物多糖毒副作用小、無耐藥性，具有多種生物活性，主要包括促進(jìn)免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、抗炎及抗衰老等[2]，但目前有關(guān)來鳳鳳菊莖葉多糖的研究報(bào)道還甚少。

植物多糖色素往往影響其結(jié)構(gòu)和生物活性的研究，也不利于進(jìn)一步的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用，有關(guān)植物多糖脫色純化方法的研究已有不少報(bào)道[3-6]。植物多糖的脫色純化方法主要有活性炭法[7]、雙氧水法[8]、樹脂吸附法[9-10]、離子交換法[11]等。目前，植物多糖的脫色和純化研究主要集中在藥用真菌方面，而關(guān)于來鳳鳳菊莖葉多糖脫色和純化的研究還鮮見報(bào)道。本文利用不同色譜材料對(duì)來鳳鳳菊莖葉多糖進(jìn)行脫色和純化研究，以便為來鳳鳳菊莖葉多糖的應(yīng)用基礎(chǔ)研究和產(chǎn)業(yè)化開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料

來鳳鳳菊，產(chǎn)自湖北省恩施州來鳳縣。

1.1.2 儀器及試劑

AUWl20D分析天平，日本島津；PerkinElmer Lambda 950紫外可見分光光度計(jì)，PERKINELMER公司；HPD-100、D101、AB-8、HPD-400、ADS-7、DM130樹脂，山東優(yōu)索化工科技有限公司；Buchi R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士Buchi公司；DEAE-52纖維素，上海源葉生物；化學(xué)試劑均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 來鳳鳳菊莖葉多糖制備

將粉碎的來鳳鳳菊莖葉，以料液比1∶40（g∶mL）的比例加入蒸餾水，超聲提取60 min，加入無水乙醇沉淀多糖，最終醇沉濃度為70%，置入冰箱過夜，抽濾后以無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌脫水，30 ℃真空干燥，得到來鳳鳳菊莖葉粗多糖。

1.2.2 來鳳鳳菊莖葉多糖脫色評(píng)價(jià)指標(biāo)

取來鳳鳳菊莖葉粗多糖，加蒸餾水溶解配制成1 mg/mL的來鳳鳳菊莖葉多糖溶液，分別通過樹脂和纖維素等填料進(jìn)行柱層析，于450 nm處測(cè)吸光度計(jì)算脫色率，苯酚-硫酸法于490 nm處檢測(cè)并計(jì)算多糖含量。

脫色率按照式（1）計(jì)算：

式（1）中：OD1為脫色前吸光度，OD2為脫色后吸光度。

多糖保留率按照式（2）計(jì)算：

式（2）中：M前為脫色前多糖總量，M后為脫色后的多糖總量。

1.2.3 樹脂材料篩選

HPD-100、HPD-400、D101、DM130、AB-8、ADS-7、DEAE-52纖維素7種材料分別稱取1.0 g，置于具塞錐形瓶中，分別加入1.0 mg/mL的來鳳鳳菊莖葉多糖樣品溶液15 mL，恒溫33 ℃，180 r/min振蕩，吸附18 h。離心，取上清液，分別計(jì)算脫色率和多糖保留率，確定最佳脫色樹脂材料。

1.2.4 DEAE-52纖維素層析純化效果研究

（1）DEAE-52離子交換柱的處理。①DEAE-52（Cl-）纖維素：蒸餾水浸泡溶脹，加水除去懸浮顆粒；0.5 mol/L的NaOH浸泡1 h，水洗，再以0.5 mol/L的HCl浸泡1 h，水洗，使DEAE-纖維素轉(zhuǎn)換為Cl-型，再用蒸餾水進(jìn)行裝柱。②DEAE-52（OH-）纖維素：按①項(xiàng)操作至0.5 mol/L的NaOH浸泡1 h，使DEAE-纖維素轉(zhuǎn)換為OH-型，水洗，再用蒸餾水進(jìn)行裝柱。③DEAE-52（HCO3-）纖維素：按①項(xiàng)操作，最后以0.5 mol/L的NaHCO3浸泡1 h，使DEAE-纖維素轉(zhuǎn)換為HCO3-型，水洗，再用蒸餾水進(jìn)行裝柱。

（2）DEAE-52離子交換柱分離層析。取來鳳鳳菊莖葉粗多糖溶解，配制成粗多糖水溶液，用不同離子型DEAE-52纖維素柱層析分離，用蒸餾水和NaCl溶液（0.05 mol/L、0.20 mol/L、0.50 mol/L）梯度洗脫。分別在280 nm、450 nm和490 nm跟蹤檢測(cè)洗脫液中多糖、色素和蛋白含量，繪制曲線，確定最佳分離方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 樹脂材料選擇

來鳳鳳菊莖葉多糖色素含量較高，會(huì)影響多糖在后期使用中的效果。圖1表明，7種樹脂對(duì)來鳳鳳菊莖葉多糖色素的吸附率有較大差異。離子交換型的DEAE-52纖維素脫色效果要優(yōu)于其他6種極性、非極性樹脂，其脫色率可達(dá)91.84%；同時(shí)多糖保留率相對(duì)較高，可達(dá)91.66%。

圖1 不同樹脂靜態(tài)脫色情況圖

綜上所述，優(yōu)選DEAE-52纖維素為來鳳鳳菊莖葉多糖脫色純化的最優(yōu)樹脂，進(jìn)行后面的層析純化效果實(shí)驗(yàn)。

2.2 DEAE-52纖維素層析純化效果比較

2.2.1 DEAE-52（OH-）纖維素純化結(jié)果

從圖2（a）可看出，蒸餾水和NaCl溶液梯度洗脫OH-型DEAE-52纖維素層析柱，得到了4個(gè)較明顯的洗脫峰，這4個(gè)洗脫峰所占的比例不同，其中中性多糖集中于第1個(gè)洗脫峰，峰高最高；第2、3個(gè)洗脫峰較小，表示糖含量較少；第4個(gè)洗脫峰主要為色素和蛋白。實(shí)驗(yàn)表明，OH-型DEAE-52纖維素層析柱對(duì)來鳳鳳菊莖葉多糖組分的分離有一定效果，但峰形較差，分離度較低。

2.2.2 DEAE-52（Cl-）纖維素純化結(jié)果

從圖2（b）可看出，分別用蒸餾水和NaCl溶液梯度洗脫Cl-型的DEAE-52纖維素層析柱，得到了5個(gè)較明顯的洗脫峰，各洗脫峰峰形集中，且分離度較好，說明Cl-型DEAE-52層析柱分離效果優(yōu)于OH-型，雖然第1個(gè)洗脫峰多糖含量高，但有一個(gè)明顯肩峰，對(duì)稱性不好，分離度有待進(jìn)一步提升。

2.2.3 DEAE-52（HCO3-）纖維素純化結(jié)果

從圖2（c）可看出，分別用蒸餾水和NaCl溶液梯度洗脫HCO3-型的DEAE-52纖維素層析柱，得到了7個(gè)較明顯的洗脫峰，第1個(gè)洗脫峰（蒸餾水段）最大，糖含量高；各峰分離度、峰形均優(yōu)于Cl-型和OH-型的DEAE-52纖維素，分辨率較高；色素和蛋白主要在第6、7峰。實(shí)驗(yàn)證明HCO3-型DEAE-52纖維素對(duì)來鳳鳳菊莖葉多糖具有更好的純化效果。

3 結(jié)論與討論

圖2 DEAE-52纖維素層析洗脫曲線圖

樹脂吸附去除色素和雜質(zhì)，是一種目前廣泛應(yīng)用的現(xiàn)代分離手段，不同樹脂的脫色機(jī)理不同，因此，對(duì)性質(zhì)不同的純化對(duì)象需要選擇不同類型的樹脂。本試驗(yàn)結(jié)果表明，離子交換型的DEAE-52纖維素去除來鳳鳳菊莖葉多糖色素效果最好，而極性和非極性樹脂脫色效果較差，DEAE-52纖維素是一種適合來鳳鳳菊莖葉多糖純化的樹脂。

樹脂的離子類型對(duì)分離純化的效果影響十分顯著：OH-型的DEAE-52纖維素的分離效果最差，因?yàn)镺H-離子交換能力過強(qiáng)，選擇性較弱；Cl-型離子交換能力較弱，呈中性，不能影響酸性多糖的電荷，選擇能力一般；HCO3-型離子交換能力較強(qiáng)，呈堿性，影響酸性多糖的電荷，分離效果最好，分辨率最高，峰形好，洗脫峰數(shù)最多。對(duì)來鳳鳳菊莖葉多糖純化效果依次為DEAE-52（HCO3-）＞ DEAE-52（Cl-）＞DEAE-52（OH-）。

綜上所述，DEAE-52纖維素對(duì)來鳳鳳菊莖葉多糖具有較好的脫色效果和較低的多糖損失率，脫色率可達(dá)91.84%，多糖保留率可達(dá)91.66%；HCO-3型DEAE-52纖維素層析具有較好的分離純化效果，在工業(yè)化生產(chǎn)高品質(zhì)植物多糖方面有著廣闊的應(yīng)用前景。