徐英杰，尹羽薇，趙海燕*，付新，董清平，孫羽佳，張宇馳

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001；3.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

骨性關節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)是一種以關節(jié)軟骨退行性變和繼發(fā)性骨質(zhì)增生為主要病理特征的慢性骨關節(jié)疾病，本病沒有明顯的種族和地域差異，在超過50歲以上人群中，僅次于心血管疾病排名第二[1]。本病是老年人膝關節(jié)疼痛、活動不便的主要原因之一，隨著社會老齡化進程不斷加劇，本病的發(fā)病率及發(fā)病絕對人數(shù)與日俱增[2]。在前期實驗證實中藥貼膜能夠有效治療膝關節(jié)骨性關節(jié)炎的基礎上[3]，本實驗應用免疫組化和Western blot兩種方法，檢測運用不同方法治療兔膝骨性關節(jié)炎模型后關節(jié)軟骨下骨BMP-2含量表達的變化，以期進一步揭示中藥貼膜干預膝骨性關節(jié)炎關節(jié)退變的作用機理。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

成年新西蘭兔50只，3～4月齡，體質(zhì)量2.5～3 kg，由黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK黑2015-003。

1.2 實驗藥物

中藥貼膜主要成分為元胡、川芎、骨碎補、續(xù)斷、冰片等，由黑龍江中醫(yī)藥大學實驗實訓中心在原中藥超微粉[4]基礎上制備而成。玻璃酸鈉注射液：上海景峰制藥股份有限公司生產(chǎn)(國藥準字 H20000643)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物模型制備

將白兔普通飼養(yǎng)1周以適應環(huán)境，并經(jīng)過一般觀察無異常后，采用Hulht法，建立兔右膝關節(jié)骨性關節(jié)炎模型[5]。

1.3.2 動物分組及給藥方法

將造模成功的實驗動物隨機分為中藥貼膜組、玻璃酸鈉組、傳統(tǒng)中藥組、模型對照組，每組10只，另取10只健康白兔作為空白對照組。按照分組采用如下方法治療：①空白對照組給予正常飼養(yǎng)不做治療；②中藥貼膜組給予中藥貼膜外敷治療，1次/日，12 h/次，共治療6周；③玻璃酸鈉組于術后1周開始行右膝關節(jié)腔內(nèi)玻璃酸鈉注射治療，劑量為0.25 mL/次，1次/周，連續(xù)治療5周；④傳統(tǒng)中藥組采用普通粉碎方法粉碎中藥(藥物組成與中藥貼膜組相同)加入促透劑外敷治療，1次/日，12 h/次，共治療6周；⑤模型組給予醫(yī)用橡皮膏外敷治療，1次/日，12 h/次，共治療6周。

1.3.3 免疫組化觀察關節(jié)軟骨下骨中 BMP-2含量

治療結束后，所有動物采用空氣栓塞法處死，無菌條件下取股骨內(nèi)側切口打開膝關節(jié)腔，切取右膝關節(jié)上下各1cm 厚軟骨下骨質(zhì)的標本。采用免疫組織化學法觀察各組標本關節(jié)軟骨下骨中BMP-2，具體操作步驟如下：①石蠟切片常規(guī)脫水，二甲苯脫蠟，酒精梯度水化；②3% H2O2去離子水孵育5～10 min；③PBS 2 min內(nèi)3次沖洗；④滴加一抗，37 ℃孵育1～2 h，PBS 2 min內(nèi)3次沖洗；⑤按照一抗的來源，分別滴加BMP-2血清單克隆抗體，37 ℃孵育30 min，PBS 2 min內(nèi)3次沖洗；⑥D(zhuǎn)AB染色，蒸餾水充分沖洗；⑦酒精脫水,二甲苯透明，封片劑封片。

1.3.4 Western blot測定關節(jié)軟骨下骨中 BMP-2含量表達

將各組實驗動物右膝關節(jié)軟骨下骨組織取出后迅速放入液氮中冷凍，按以下步驟操作：

①提取組織總蛋白:解凍標本，放入研缽，將其研碎。將研碎的骨組織放入勻漿器中，按照每20 mg組織加入100 μL RIPA裂解液。RIPA裂解液在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使其終濃度為1 mmol/L。在冰上勻漿，直至充分裂解。充分裂解后，4 ℃，14 000 r/min離心5 min，取上清保存于-70 ℃冰箱中。②蛋白質(zhì)的定量:加2 μL超純水于超微量紫外分光光度儀上，進行調(diào)零。擦去超純水，加提取的蛋白質(zhì)樣品取2 μL，測出蛋白質(zhì)濃度。③蛋白質(zhì)電泳:配置10%分離膠。沿玻片用吸管加入模具中，等待凝膠聚合。加濃縮膠于分離膠之上，待濃縮膠聚合約30 min后，放置在電泳槽內(nèi)，加入電泳液。按照4∶1比例(加樣緩沖液)混合樣品，在100 ℃條件下加熱約10 min，短暫離心。連接電源，100 V約90 min，至溴酚蘭到達分離膠底部。卸下玻板，小心撬開玻板，取出凝膠。④轉(zhuǎn)印:浸潤PVDF膜，切比PVDF膜略小的濾紙40張，潤濕濾紙，移開轉(zhuǎn)移裝置安全蓋和陰極，按順序鋪潤濕濾紙20張，鋪PVDF膜，鋪凝膠，鋪潤濕濾紙20張，放置好陰極，安裝轉(zhuǎn)印裝置，連好連接線，打開電源，25 V轉(zhuǎn)印2.5～3 h，轉(zhuǎn)膜后小心取出PVDF膜。⑤免疫檢測:在放有轉(zhuǎn)印后PVDF膜的表面皿中加封閉液，液面必須過膜，搖床上輕搖60 min，棄去封閉液，TBST洗膜3次，每次5 min，棄去TBST，搖床上溫和搖動2 h后，4 ℃過夜，棄去一抗，TBST洗3次，每次5 min，棄去TBST，將膜放入一個可封口的塑料袋中加二抗，搖床上溫和搖動4 h，棄去二抗，TBST洗3次，共30 min，按照DAB顯色試劑盒說明配置好顯色液，將PVDF膜放入顯色液中顯色，待條帶顯色清晰后用蒸餾水終止反應。

1.3.5 統(tǒng)計學處理方法

免疫組化結果參照前期實驗所用的形態(tài)計量學研究方法研究[6]，BMP-2的表達量用細胞分數(shù)表示。蛋白印跡結果用凝膠成像分析系統(tǒng)取圖，并分析密度，結果以目標條帶的密度與內(nèi)參條帶的密度之比表示。

2 實驗結果

2.1 免疫組化測定兔膝關節(jié)軟骨下骨BMP-2表達結果

表1 免疫組化測定兔膝關節(jié)軟骨下骨BMP-2表達結果

結果顯示，空白對照組膝關節(jié)軟骨下骨中BMP-2表達較高，模型組膝關節(jié)軟骨下骨中BMP-2表達明顯減低，與空白對照組性比較，P<0.01。玻璃酸鈉組BMP-2表達較模型組高(P<0.01)，但低于傳統(tǒng)中藥組和中藥貼膜組(P<0.01)。中藥貼膜組BMP-2表達量在各治療組中相對最高，與空白對照組接近。

2.2 Western blot測定兔膝關節(jié)軟骨下骨BMP-2蛋白表達結果

表2 Western blot測定兔膝關節(jié)軟骨下骨BMP-2蛋白表達結果

檢測結果顯示，空白對照組BMP-2蛋白表達量在各組中最高，模型組BMP-2蛋白表達量較空白對照組明顯降低(P<0.01)，為空白對照組的0.29倍，玻璃酸組BMP-2蛋白表達量為空白對照組的0.42倍，較模型組增高(P<0.01)。傳統(tǒng)中藥組及中藥貼膜組BMP-2蛋白表達量均較玻璃酸鈉組高(P<0.05)。

3 討論

中藥貼膜由骨碎補、續(xù)斷、元胡、川芎、冰片等各等分組成。方中以骨碎補為君，活血續(xù)傷，補腎強骨，《開寶本草》謂其“主破血止血，補傷折”。續(xù)斷補腎強筋，療傷續(xù)折為臣藥，以助骨碎補補腎續(xù)傷之力。《本草匯言》曰：“續(xù)斷，補續(xù)血脈之藥也。大抵所斷之血脈非此不續(xù)；所傷之筋骨非此不養(yǎng)；所滯之關節(jié)非此不利”。元胡活血，行氣，止痛?！侗静菥V目》言元胡“能行血中氣滯，氣中血滯，故專治一身上下諸痛”；川芎活血行氣，祛風止痛。《本草匯言》曰:“川芎味辛性陽，氣善走竄而無陰凝粘滯之態(tài)，隨入血分，有能去一切風，調(diào)一切氣之功”；冰片開竅通絡，《醫(yī)林纂要》曰“能透骨熱”，“亦能生肌止痛”。以上3味共為佐藥。方中諸藥合用，共奏補腎通絡，續(xù)筋強骨，祛風活血之功。

現(xiàn)代研究證實延胡索提取物中延胡索甲素、延胡索乙素、延胡索丑素都有明顯的止痛作用[7]；川芎提取物中川芎嗪可促進骨折患者的骨折愈合和血腫的吸收[8]；骨碎補提取物中主要成分柚皮苷在骨性關節(jié)炎動物模型治療過程中，具有抑制關節(jié)軟骨細胞凋亡作用[9]；續(xù)斷皂苷為續(xù)斷提取物，其中含有使骨損傷愈合作用的活性組分，具有促進骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化的作用，從而起到增強骨痂形成，改善骨小梁局部微觀結構，促進骨形成的作用[10]；冰片為近乎純粹的右旋龍腦具有良好的抗炎和透皮吸收作用[11]。

關節(jié)軟骨和軟骨下骨在骨性關節(jié)炎病變過程中存在既相互獨立，又相互作用的關系。治療骨性關節(jié)炎時即要注重關節(jié)軟骨退變，同時也應該預防軟骨下骨的發(fā)病，調(diào)節(jié)關節(jié)軟骨與軟骨下骨的相互生物力學作用機制，糾正關節(jié)軟骨的整體生物化學環(huán)境和代謝條件。RADIN等[12]認為，軟骨下骨異常在骨性關節(jié)炎發(fā)病機制中的引發(fā)重要作用，較薄的關節(jié)軟骨層使其不能再分散下肢所受的應力，能量的沖擊負荷應力致使軟骨下骨骨小梁發(fā)生微骨折。這些骨折的修復繼而會導致骨硬度的增加，致使關節(jié)局部吸收肢體傳導沖擊能力的減弱，關節(jié)軟骨表面暴露的應力增大。FLOREA等[13]通過建立兔骨性關節(jié)炎模型并通過CT評估造模成功后膝關節(jié)軟骨下骨結構改變，發(fā)現(xiàn)骨性關節(jié)炎動物模型軟骨下骨變薄，骨小梁數(shù)量減少，蛋白聚合含量降低。

目前軟骨下骨與骨性關節(jié)炎的微觀結構變化的詳細發(fā)病機制雖然還沒有完全明確，但因為軟骨下骨與關節(jié)軟骨之間的密切解剖關系，決定了關節(jié)的軟骨下骨在骨性關節(jié)炎發(fā)病過程中起重要作用。研究顯示發(fā)生骨性關節(jié)炎病理改變時，軟骨下骨處于高轉(zhuǎn)化狀態(tài)、局部代謝加強、局部骨質(zhì)疏松形成，極易發(fā)生軟骨下骨微損傷，且微損傷的修復作用降低，關節(jié)異常負荷使軟骨下骨發(fā)生形變以緩沖所增加的應力，同時亦導致骨小梁微細骨折。反復微損傷啟動骨重塑過程加快，最終導致的軟骨下骨增厚和密度增高，軟骨下骨質(zhì)變硬，使軟骨和軟骨下骨硬度差增大，此時局部外力作用異常會使關節(jié)軟骨所受的應力作用變大，導致關節(jié)軟骨退變[14]。因此，調(diào)節(jié)關節(jié)軟骨下骨的代謝速度，改善軟骨下骨的病變，應納為治療骨性關節(jié)炎的重要目標，并可能成為治療骨性關節(jié)炎的新的途徑。

本實驗結果顯示，模型組兔膝關節(jié)軟骨下骨中BMP-2蛋白表達含量明顯降低，成為早期骨性關節(jié)炎軟骨下骨生成能力下降的原因，軟骨下骨新骨生成能力下降導致早期骨性關節(jié)炎軟骨下骨的局限性骨質(zhì)疏松，增大了關節(jié)軟骨的負荷應力，從而加重了關節(jié)軟骨的退變。各治療組經(jīng)過治療后，都在提高關節(jié)軟骨下骨BMP-2蛋白表達起到了一定的作用，其中臨床常用的玻璃酸鈉對關節(jié)軟骨下骨BMP-2生成能力雖有一定的提高，但低于傳統(tǒng)中藥組和中藥貼膜組，表明我們所采用的中藥組方在促進軟骨下骨新骨生成能力優(yōu)于玻璃酸鈉。中藥貼膜組促進BMP-2能力較傳統(tǒng)中藥組強，證實應用提取的中藥成分制備成貼膜后，可以對骨性關節(jié)炎軟骨下骨退變干預作用起到更好的效果。因此，中藥貼膜在早期骨性關節(jié)炎治療過程中，對提高關節(jié)軟骨下骨BMP-2表達起到良好的干預作用，在避免早期骨性關節(jié)炎關節(jié)軟骨下骨退變起到積極作用，繼而從另一方面達到對關節(jié)軟骨的保護作用。