康甲超，蒙潔，陳冬梅，王勇，吳萍民，王晶

(甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅 蘭州 730000)

衰老是人體必經(jīng)的一個自然過程，其不僅在組織器官，而且在細胞水平也可引起機體功能的變化，大量研究表明衰老與細胞自噬密切相關[1-2]。細胞自噬是機體為了適應不同環(huán)境而做出的有效內(nèi)部調(diào)節(jié)，適度的自噬可以有效延緩衰老、改善衰老相關疾病[3]；然而，自噬是一個降解過程，過度的自噬對機體有害，任何過度的自噬都可能導致細胞死亡[4-5]。黨參Codonopsispilosula(Franch.) Nannf.具有益氣補中，延緩衰老的功效[6]，并且有研究發(fā)現(xiàn)黨參可以抑制腦組織細胞自噬水平以減輕腦缺血再灌注損傷[7]。前期課題組研究發(fā)現(xiàn)黨參對衰老肺組織具有保護作用，研究中通過對各組肺組織基因芯片分析，發(fā)現(xiàn)基因Bnip3在肺組織衰老后和高劑量黨參干預后均發(fā)生差異改變[8]。BNIP3是一種僅有BH3的自噬蛋白，既能誘導細胞自噬，又能誘導細胞死亡[9]。為了進一步了解自噬蛋白BNIP3對衰老肺組織的作用以及黨參的干預功效，本實驗采用D-半乳糖復制小鼠衰老模型，通過檢測各組小鼠肺組織中自噬蛋白BNIP3和基因Bnip3的表達量，以期發(fā)現(xiàn)黨參對衰老肺組織在自噬方面的保護機制。

1 材料

1.1 動物

SPF級昆明種小鼠100只，雌雄各半，2月齡，體質(zhì)量(18±2)g，甘肅中醫(yī)藥大學科研實驗動物中心提供，動物合格證號SCXK(甘)2015-0002。飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學SPF級動物房，室溫20～25 ℃，自然光照，攝食和自由飲水。所有實驗程序和方案均按照甘肅中醫(yī)藥大學動物倫理委員會(編號：2017-106)的指導方針執(zhí)行。

1.2 藥物

黨參，采自甘肅岷縣，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學中藥資源教研室杜弢教授鑒定為白條黨參。取黨參100 g，分2次煎煮，第1次加10倍量水煎煮1 h，第2次加6倍量水煎煮1 h，合并2次提取液，過濾，濃縮成含原藥材0.5 g/mL的水煎劑，置4 ℃冰箱保存，黨參水提物每5 d制備1次。

1.3 主要試劑

D-半乳糖購于美國Sigma公司，批號：24895207，臨用前用生理鹽水配制成12 g/L備用；引物均由Invitrogen公司提供；Trizol試劑購于Invitrogen公司，貨號15596-026；SYBR熒光染液購于美國應用生物系統(tǒng)公司，貨號4367659；快速定量RT試劑盒購于中國天根生化科技有限公司，貨號KR106-02；兔抗BNIP3抗體(1∶150)購于中國索萊寶公司，貨號K004134p；兔SP試劑盒(兔鏈霉卵白素-生物素法檢測系統(tǒng))購于中杉金橋，貨號SP9001-6；DAB顯色試劑盒購于中杉金橋，貨號ZL1-9018-3。

1.4 主要儀器

透射電子顯微鏡JEM-1230，購于日本捷歐路科貿(mào)有限公司；離心機5415D，購于德國艾本德公司；PCR7500系統(tǒng)，購于美國應用生物系統(tǒng)公司；凝膠成像系統(tǒng)UVP I-D001，購于博奧生物集團有限公司；光學顯微鏡，購于日本奧林巴斯公司。

2 方法

2.1 分組

將100只SPF級昆明種小鼠隨機分為正常對照組、模型組和黨參低、中、高劑量組，每組20只，雌雄各半。

2.2 造模及給藥

依照龔國清等人的造模方法造模[10]，采用頸背部皮下注射D-半乳糖溶液復制衰老模型，給藥劑量為每日每只小鼠50 g/L D-半乳糖溶液，注射量為0.025 mL/g。造模的同時黨參低、中、高劑量組給予5、10、15 g/kg黨參溶液灌胃，灌胃體積為每日每只小鼠0.025 mL/g，正常對照組和衰老模型組給予等量生理鹽水灌胃，以上造模連續(xù)42 d。

2.3 透射電子顯微鏡

于末次給藥2 h后，用10%水合氯醛麻醉動物，頸椎脫臼法處死小鼠，分別將取得的正常對照組、模型組和黨參低、中、高劑量組小鼠肺組織沖洗干燥后切成約1～3 mm/片，然后將其放入預先冷卻的2.5%戊二醛溶液中，在4 ℃下固定過夜，用PBS沖洗3次，1%鋨酸染色，脫水，浸泡，包埋，聚合后將肺切成70 nm片狀，重新染色后觀察正常對照組、模型組和高劑量黨參組肺組織細胞超微結構的變化。

2.4 RT-PCR方法

采用Trizol試劑提取正常對照組、模型組和高劑量黨參組總RNA，mRNA定量檢測采用SYBR熒光染料法進行。采用兩端不同的引物進行逆轉(zhuǎn)錄，經(jīng)逆轉(zhuǎn)后cDNA模板在上下游引物引發(fā)下進行定量PCR檢測，mRNA表達量均以GAPDH為內(nèi)參基因，數(shù)據(jù)采用2-△△CT方法計算基因相對表達量。見表1。

表1 RT-PCR檢測Bnip3引物序列

2.5 免疫組織化學染色

于末次給藥2 h后，用10%水合氯醛麻醉動物，注射量為0.004 mL/g，頸椎脫臼法處死小鼠，分別將取得的正常對照組、模型組和黨參低、中、高劑量組小鼠肺組織固定，制作成蠟塊。二甲苯脫蠟12～15 min，3%的過氧化氫浸泡10 min除去內(nèi)源性過氧化氫酶，封閉血清后滴加一抗、二抗、顯色劑。

2.6 統(tǒng)計學處理

3 結果

3.1 肺組織超微結構觀察

正常對照組Ⅱ型肺泡上皮細胞結構正常，線粒體結構正常；模型組中大量線粒體腫脹，膜結構消失，線粒體結構破壞，Ⅱ型肺泡上皮細胞中的板層小體完全脫落；高劑量黨參組中未見異常改變，肺泡腔、板層小體和線粒體無明顯改變(見圖1)。

3.2 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)

設計兩種不同引物檢測肺組織中基因Bnip3表達量，使用引物一檢測Bnip3相對表達量發(fā)現(xiàn)，Bnip3在衰老后肺組織中表達上調(diào)，在高劑量黨參干預后表達下調(diào)(見表2、圖2A)，使用引物二檢測Bnip3相對表達量發(fā)現(xiàn)，Bnip3在衰老后肺組織中表達上調(diào)，在高劑量黨參干預后表達下調(diào)(見表2、圖2B)差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

3.3 免疫組織化學染色

圖像分析采用Image J軟件，分析各組小鼠肺組織免疫組織化學染色在高倍鏡下三個視野的BNIP3陽性率，結果用均數(shù)±標準差表示，與正常對照組相比，模型組BNIP3陽性率明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與模型組相比，高劑量黨參組BNIP3陽性率明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(表3)。正常對照組中陽性細胞少見，低劑量黨參組陽性細胞多見，中劑量黨參組中陽性細胞少量，高劑量黨參組中陽性細胞少見，模型組陽性細胞多見，陽性率最高，染色結果最深(見圖3)。

注：圖中△所指為板層小體，→所指為腫脹破壞的線粒體。圖1 肺組織透射電鏡觀察

表2 RT-PCR不同引物序列檢測Bnip3相對表達量

注：A,Bnip3表達量(引物一);B,Bnip3表達量(引物二);與正常對照組比較，**P<0.01；與模型組比較,##P<0.01。圖2 RT-PCR方法檢測衰老后及高劑量黨參干預后肺組織中Bnip3相對表達量

注：圖中→所指為陽性細胞。圖3 各組小鼠肺組織免疫組化結果(×400)

表3 黨參水提物對D-半乳糖致衰老小鼠肺組織中蛋白BNIP3表達的影響

4 討論

細胞自噬是一把雙刃劍，研究顯示，肺組織細胞的過低自噬和過度自噬均可引起或加重肺損傷[11]。在本次研究中，模型組肺組織超微結構發(fā)生明顯異常改變，細胞結構被破壞，細胞膜受損，大量胞質(zhì)外流，線粒體腫脹破壞；高劑量黨參干預后肺組織超微結構好轉(zhuǎn)，未見明顯異常。BNIP3定位于線粒體外膜，在細胞缺氧環(huán)境下其表達量明顯增多[12]，對凋亡和線粒體自噬至關重要[13]。BNIP3在細胞死亡和存活中的作用已被廣泛研究[14]，誘導BNIP3過表達可通過線粒體功能障礙促進大多數(shù)細胞類型的死亡[15]，2005年Lemasters[16]首次提出線粒體自噬的概念，主要指在氧化應激、衰老及能量限制等刺激下，細胞內(nèi)的線粒體發(fā)生去極化損傷使線粒體被破壞。通過對模型組和高劑量黨參組超微結構的觀察，發(fā)現(xiàn)黨參具有保護衰老肺組織和肺細胞中線粒體的作用，其機制可能與黨參阻止細胞過度自噬有關。

研究表明BNIP3基因敲除導致細胞凋亡減少，而BNIP3基因過度表達則增加了凋亡細胞的數(shù)量[17]。本研究通過RT-PCR方法檢測小鼠衰老后和高劑量黨參干預后肺組織中Bnip3表達量，發(fā)現(xiàn)衰老后肺組織中Bnip3表達量明顯升高，高劑量黨參干預后明顯降低；通過免疫化學染色技術，觀察各組肺組織中BNIP3陽性率的變化，模型組中BNIP3陽性率最高，高劑量黨參組中BNIP3陽性率明顯下降，與RT-PCR結果一致，再次證明黨參能降低衰老肺組織中BNIP3的表達量，保護衰老肺細胞因BNIP3基因過度表達免受凋亡。

綜上所述，黨參能改善衰老小鼠肺組織的超微結構，保護肺細胞中線粒體免受破壞，黨參對衰老小鼠肺組織的保護作用可能是通過降低BNIP3的過度表達有關。本研究為黨參對細胞自噬影響的藥用開發(fā)提供了一定的理論依據(jù)。