商春爽，田苗，張福利

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

糖耐量低減(Impaired glucose tolerance，IGT)是一個(gè)可以逆轉(zhuǎn)的階段，是中藥有效防治2型糖尿病的重要階段，所以越來越多的醫(yī)者更加注重中醫(yī)藥復(fù)方調(diào)治IGT，認(rèn)為復(fù)方的多重療效與IGT的復(fù)雜多樣的病機(jī)趨同。臨床IGT患者多體型肥胖，相關(guān)臨床研究表明IGT患者伴有不同程度的內(nèi)臟脂肪沉積、浸潤，如肝臟、胰腺等，這與導(dǎo)師張福利教授認(rèn)為濕熱蘊(yùn)脾，三焦失運(yùn)的病機(jī)相契合，臨證多用化瘀溫膽湯加減以分消走泄。前期研究表明，化瘀溫膽湯能夠有效改善IGT大鼠糖脂代謝紊亂，減低肝臟的脂肪沉積以降低氧化應(yīng)激水平[1]。然而多項(xiàng)臨床觀察與實(shí)驗(yàn)研究證明胰腺脂肪浸潤亦是誘發(fā)2型糖尿病的危險(xiǎn)因素，與胰島素抵機(jī)制抗密切相關(guān)[2-3]。故而筆者通過觀察化瘀溫膽湯干預(yù)高脂高糖飼料誘導(dǎo)的IGT大鼠的相關(guān)血糖、胰島素指標(biāo)及胰腺組織的脂質(zhì)沉積與浸潤情況，探究化瘀溫膽湯對(duì)IGT大鼠IR與胰腺脂肪浸潤的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

70只SD雄性大鼠，SPF級(jí)，購買于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體質(zhì)量(180±20)g，合格證號(hào)：SCXK(黑)2018006，實(shí)驗(yàn)室溫度20～25 ℃，相對(duì)濕度50～70%。隨機(jī)選取10只做空白組，另外60只用于IGT模型大鼠制備，隨機(jī)抽取30只IGT成模大鼠，分為模型組、化瘀溫膽湯組、二甲雙胍組各10只[1]。TG(Cke30371)ELISA試劑盒、INS(Cke30973)試劑盒均購于Thermo公司。蘇木色染液，由南京建成生物工程研究所提供。

1.2 藥品與儀器

化瘀溫膽湯：法半夏10 g，枳實(shí)10 g，陳皮15 g，茯苓7.5 g，澤瀉15 g，酒白芍15 g，葛根15 g，黃芩7.5 g，三七7.5 g，生姜5 g，大棗5 g，甘草5g[1]。以上藥材均購于北京同仁堂藥店。根據(jù)前期正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行煎煮：蒸餾水完全浸泡60 min，加6倍水量，煎煮40 min/次，連續(xù)煎煮3次，然后將3次藥液混合，濃縮以備灌胃使用。鹽酸二甲雙胍：規(guī)格：0.5 g，由中美上海施寶貴制藥有限公司生產(chǎn)。SORVALL ST8/8R低溫離心機(jī)、MULTISKAN FC 酶標(biāo)儀、HM340E石蠟切片機(jī)、HistoStar石蠟包埋機(jī)均購于Thermo公司。JPS-5血糖儀購于怡成超越公司。

1.3 IGT模型大鼠的制備方法

除了空白組以外，其余大鼠給予高脂高糖飼料喂養(yǎng)20周，自由攝食飲水[1]。高脂高糖飼料中蔗糖、豬油、蛋黃粉之間的比例大約是2∶1∶1，3種成分共占總飼料重量的45%，另外還包括0.5%膽固醇，59.5%大鼠普通飼料。模型制備第20周末進(jìn)行空腹血糖(Fasting plasma glucose，F(xiàn)PG)與糖耐量試驗(yàn)(Intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT)，測(cè)定葡萄糖注射后2 h血糖(Two hours plasma glucose，2hPG)水平。依據(jù)前期模型制備成功標(biāo)準(zhǔn)篩選IGT模型大鼠[4]。

1.4 給藥方法

化瘀溫膽湯組給予中藥湯劑，1.25 g/mL，二甲雙胍組給予藥粉懸濁液，5 mg/mL；空白組和模型組大鼠給予2 mL/100 g生理鹽水，灌胃給藥4周，給藥期間繼續(xù)各組原飼料喂養(yǎng)[4]。

1.5 FPG、2hPG與體質(zhì)量測(cè)定方法

在第20、21、25周末20時(shí)，禁食禁水，12 h后稱重，進(jìn)行尾部末端消毒，剪尾取血，滴于試紙，測(cè)FPG，血糖儀讀數(shù)并記錄；然后腹腔注射給予大鼠50%葡萄糖溶液，2 g/kg。2 h后測(cè)定血糖值(2 h PG)。

1.6 血清Fins含量的測(cè)定

應(yīng)用大鼠腹主動(dòng)脈采血法采集第25周末大鼠血液，離心分層，取得血清，參照試劑盒檢測(cè)說明測(cè)定各組大鼠血清Fins含量[1]。

1.7 胰腺組織TG含量的測(cè)定

第25周末進(jìn)行OGTT后，處死，剖開腹腔完全暴露胰腺并摘取，部分置于-195 ℃的液氮中，組織勻漿進(jìn)行TG含量的測(cè)定。

1.8 胰腺組織HE染色

取材同1.7，部分胰腺組織用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，顯微鏡下觀察。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 各組大鼠血糖水平的比較

在21周末，與空白組比較，模型組、化瘀溫膽湯組、二甲雙胍組FPG、2 h PG都明顯升高(P<0.01)，但各組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；在25周末，與空白組比較，其余3組FPG、2hPG皆明顯升高(P<0.01)，與模型組比較，化瘀溫膽湯組FPG(P<0.05)、2 h PG(P<0.01)水平都得以下降，二甲雙胍組中的FPG(P<0.01)、2 h PG(P<0.05)亦是都下降，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且二者間無顯著差異(P>0.05)，見表1。

表1 各組大鼠FPG、2 h PG的比較

2.2 各組大鼠血清Fins含量、HOMA-IR與體質(zhì)量的比較

與空白組比較，其余3組Fins含量、HOMA-IR結(jié)果及體質(zhì)量變化(P<0.01)，都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；和模型組比較，中西藥治療組Fins下降(P<0.05)、HOMA-IR減小(P<0.01)、體質(zhì)量減輕(P<0.01，P<0.05)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；且二者間無顯著差異(P>0.05)，見表2。

表2 各組大鼠血清Fins含量、HOMA-IR、體質(zhì)量的比較

2.3 各組大鼠胰腺組織中TG含量的比較

與空白組比較，其余3組TG含量顯著增加(P<0.01)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；和模型組比較，經(jīng)化瘀溫膽湯治療后的大鼠TG水平下降(P<0.01)，二甲雙胍組TG下降(P<0.05)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；且二者間無顯著差異(P>0.05)，見表3。

表3 各組大鼠胰腺組織TG含量的比較

2.4 化瘀溫膽湯對(duì)IGT大鼠胰腺組織形態(tài)學(xué)的作用

由圖1可以看出，空白組中胰腺組織結(jié)構(gòu)比較完整，胰島相對(duì)規(guī)則，沒有脂肪變性及炎性浸潤。模型組中胰島結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出明顯的不規(guī)則，可以看出腺胞體積明顯變大、并且數(shù)量減少，只能看到少量的腺胞；可見的腺胞里面出現(xiàn)大量、滿視野的脂肪空泡，小葉間隔也出現(xiàn)明顯增寬，間質(zhì)當(dāng)中也可見明顯的脂肪浸潤；化瘀溫膽湯組與二甲雙胍組胰島與腺胞結(jié)構(gòu)完整，與模型組比較脂肪浸潤減少，小葉間脂肪空泡變小，見圖1。

圖1 各組大鼠胰腺組織HE染色(×400)

3 討論

隨著社會(huì)的進(jìn)步，人們的飲食結(jié)構(gòu)也逐漸豐盛多樣，生活方式變得過于安逸少動(dòng)，多種因素導(dǎo)致肥胖患者逐年增加，已經(jīng)患有或者可能發(fā)展成IGT或2型糖尿病的潛在人群正在逐漸增大。IGT作為糖尿病前期階段，血糖還沒有偏頗到一定程度，臨床癥狀不突出，不易察覺發(fā)現(xiàn)，很容易被患者忽略，故應(yīng)重視IGT的臨床篩查。本課題組前期研究表明IGT大鼠存在一定程度肝臟脂肪沉積，且化瘀溫膽湯能夠有效改善這種病理變化。鄔云紅[5]研究表明肥胖大鼠同時(shí)存在外周IR與胰島自身IR。宋麗媛[6]研究表明漫長周期高脂誘導(dǎo)的肥胖大鼠伴有胰腺脂肪的炎性浸潤。陸婷[7]研究認(rèn)為胰腺脂肪異位沉積，在男性較為肥胖的患者中對(duì)胰島素抵抗的作用尤為明顯，可能是其發(fā)生進(jìn)展過程中的，獨(dú)立的眾多危險(xiǎn)元素之一，這與本實(shí)驗(yàn)選擇肥胖雄性大鼠做模型是一致的。胰腺脂肪浸潤，最早由Schaeser于1926年提出，是中心型肥胖的表型，是以胰腺內(nèi)脂肪細(xì)胞組織中甘油三酯的積累，胰腺出現(xiàn)脂肪的異位沉積、導(dǎo)致胰島細(xì)胞脂肪變性為特點(diǎn)的一種疾病[8-10]。研究[11]表明肥胖大鼠不僅存在皮下脂肪堆積，亦伴有不同程度的胰腺脂肪沉積，脂肪細(xì)胞分泌過多的炎性因子，如TNF-α、IL-6等導(dǎo)致長期慢性炎癥狀態(tài)，可以激活相對(duì)應(yīng)的炎性信號(hào)通路中的重要轉(zhuǎn)錄因子，使胰島素受體底物的殘基磷酸化，降低胰島素的表達(dá)能力，出現(xiàn)胰島素抵抗，然后加重胰腺的脂肪異位沉積和它的炎性浸潤，彼此形成惡性循環(huán)[12-13]。因此降低胰腺組織的脂肪異位沉積、炎性浸潤，改善炎癥反應(yīng)是改善、逆轉(zhuǎn)IGT IR的有效路徑。二甲雙胍能夠有效改善肥胖大鼠或臨床肥胖、2型糖尿病患者骨骼肌、肝臟等非脂肪組織的脂肪異位沉積[14-15]，因此本研究選擇二甲雙胍為對(duì)照用藥。

本研究通過漫長周期高脂高糖飼料誘導(dǎo)IGT模型大鼠，觀察大鼠體質(zhì)量、FPG、2 h PG、Fins、HOMA-IR，胰腺組織TG水平，通過光鏡觀察胰腺組織形態(tài)學(xué)變化，觀察IGT大鼠胰腺脂肪浸潤程度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組大鼠體質(zhì)量明顯大于治療組，F(xiàn)PG、2 h PG和Fins，以及胰腺組織TG含量、HOMA-IR計(jì)算結(jié)果明顯高于治療組。佐證化瘀溫膽湯與二甲雙胍能有效改善IGT大鼠胰腺脂肪浸潤的情況。

胰腺脂肪異位沉積、炎性浸潤與中醫(yī)學(xué)之濕熱蘊(yùn)脾關(guān)系密切。胰腺在中醫(yī)學(xué)中被稱為脾之副臟，同脾屬土，脾土生于火，而火有不同，其一為三焦相火，太陰濕土有賴于三焦相火的溫化運(yùn)轉(zhuǎn)，得以發(fā)揮消磨腐熟水谷之能。張福利教授結(jié)合當(dāng)代人以濕熱體質(zhì)多見，認(rèn)為IGT患者乃氣機(jī)郁滯，津液代謝失衡，釀生濕熱，困于脾胃，延及三焦，病久由氣及血，形成脾不散精，三焦失運(yùn)，痰濕瘀熱之病機(jī)，與胰腺脂肪浸潤導(dǎo)致由自身發(fā)展到全身胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，也加重了全身糖毒性以及脂毒性的病機(jī)病程相契合。且三焦失運(yùn)，氣機(jī)失調(diào)，濕熱愈加困于脾土與胰島素抵抗反之加重胰腺脂肪的異位沉積與炎性浸潤相符。導(dǎo)師臨證治療IGT或2型糖尿病患者多運(yùn)用化瘀溫膽湯，本方是導(dǎo)師在溫膽湯基礎(chǔ)上化裁而來的自擬方。全方主要由分消氣經(jīng)三焦?jié)駸崤c化瘀通達(dá)血絡(luò)的兩個(gè)組分構(gòu)成，與當(dāng)代人因肥胖而導(dǎo)致的血糖血脂異常病機(jī)相契合。分消走泄三焦?jié)駸?，氣血同治，?jīng)絡(luò)同調(diào)，達(dá)到逆轉(zhuǎn)全身IGT IR之旨，可能是通過降低體重，改善胰腺脂肪浸潤實(shí)現(xiàn)的。本研究探索了大方復(fù)合治法之化瘀溫膽湯的又一作用靶點(diǎn)，成為課題后續(xù)相關(guān)機(jī)制研究的重要前期基礎(chǔ)，也為胰腺脂肪浸潤與腸道菌群相關(guān)相合研究奠定了基礎(chǔ)。明確化瘀溫膽湯作用靶點(diǎn)與效用機(jī)制能夠使其更有效地、廣泛地應(yīng)用于臨床。