王彥平，張保朝，聞公靈，劉義鋒，汪 寧，孫 軍，茹 睿

腦梗死是因腦部血液循環(huán)障礙引起的局限性腦組織缺血、壞死或軟化，可引起顱內(nèi)高壓、腦疝、昏迷，嚴重者可致死亡[1]。隨著溶栓及介入治療的不斷發(fā)展，腦梗死的死亡率下降，但多數(shù)病人仍遺留不同程度的認知功能障礙、失語、偏癱等神經(jīng)功能缺失癥狀，不僅影響病人的生活質(zhì)量，而且造成了一定的社會負擔[2]。因此，如何減少腦梗死后的神經(jīng)功能缺失，改善認知功能障礙成為醫(yī)學研究熱點。石菖蒲是具有開竅益智、鎮(zhèn)靜安神作用的中草藥，在心腦血管疾病中有廣泛應用[3]。研究表明，石菖蒲中含有的揮發(fā)油、有機酸等成分具有抗氧化損傷、鎮(zhèn)靜、抗驚厥等作用，可保護癲癇大鼠腦神經(jīng)細胞，改善認知功能障礙[4-5]。目前雖有研究證實石菖蒲有神經(jīng)保護作用，但關(guān)于其在腦梗死中的應用及相關(guān)機制研究較少。本研究通過線栓法阻斷大腦中動脈建立腦梗死模型，觀察石菖蒲對腦梗死大鼠認知功能障礙及神經(jīng)細胞凋亡的影響，以期為腦梗死藥物治療研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 無特定病原體(SPF)級雄性SD大鼠60只，4周齡，體質(zhì)量180～220 g，購自廣東省實驗動物監(jiān)測所，生產(chǎn)許可證號：SCXK(粵)2018-0044，使用許可證號SYXK(粵)2016-0122。自然光線下飼養(yǎng)，12 h晝夜節(jié)律，溫度22～25 ℃，相對濕度50%～60%，自由進食水，實驗前適應性飼養(yǎng)1周。

1.2 實驗藥物、主要試劑和儀器

1.2.1 藥物 石菖蒲(北京同仁堂藥店，批號160503)，尼莫地平注射液(西南藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，國藥準字H20064494)。

1.2.2 實驗試劑 兔抗大鼠糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)，磷酸化GSK-3β(p-GSK-3β)，β-連環(huán)蛋白(β-catenin)，p-β-catenin，促凋亡基因(B apoptosis cell matrixgene，Bax)，半胱天冬酶3(caspase-3，Casp3)多克隆抗體(美國Santa cruz公司)，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)。

1.2.3 實驗儀器 OLYMPUS顯微鏡(日本奧林巴斯公司)，Leitz1515型組織切片機(德國Leitz公司)，3550 UV酶標儀、7500實時熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)儀購自美國Bio-rad公司，Morris水迷宮(安徽淮北正華生物儀器設備有限公司)。

1.3 腦梗死模型制備 采用改良Z-Longa線栓法造成大腦中動脈閉塞制作腦梗死模型，6 mL/kg 1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，仰臥位固定于手術(shù)臺上，頸部消毒備皮，沿正中線切開左側(cè)頸部皮膚，逐層分離各層組織，暴露頸總動脈、頸外動脈，結(jié)扎頸外動脈遠心端，微動脈夾夾閉頸內(nèi)動脈和頸總動脈，于頸外動脈靠近頸總動脈分叉處剪一小口，將線栓自頸總動脈插入至顱內(nèi)方向，深度18～20 mm至出現(xiàn)阻力，結(jié)扎線栓口下方，松開微動脈夾[6]。術(shù)后6 h實施Z-Longa評分法評價大鼠神經(jīng)功能缺損情況，評分范圍1～6分，1～3分為模型制作成功[7]。

1.4 分組及干預 60只大鼠適應性飼養(yǎng)1周后稱重，隨機分為假手術(shù)組、模型組、陽性對照組、石菖蒲低劑量組、石菖蒲高劑量組，每組12只。除假手術(shù)組外均以改良Z-Longa線栓法阻斷大腦中動脈制作腦梗死模型，假手術(shù)組術(shù)中僅暴露頸總動脈、頸外動脈、頸內(nèi)動脈，不阻斷大腦中動脈，其余方法相同。造模期間假手術(shù)組、石菖蒲高劑量組、陽性對照組各死亡1只，模型組及石菖蒲低劑量組各死亡2只，剔除死亡大鼠后，假手術(shù)組11只、模型組10只、陽性對照組11只、石菖蒲低劑量組10只、石菖蒲高劑量組11只進入后續(xù)實驗。

石菖蒲以雙蒸水浸泡4 h，水煎3次，每次煎煮120 min，混勻3次濾液，濃縮至1 g/mL，置于4 ℃冰箱備用。按照人與動物等效劑量換算，在神經(jīng)功能缺損評價后石菖蒲低劑量組即以石菖蒲藥液0.6 g/kg灌胃，石菖蒲高劑量組以1.8 g/kg灌胃，陽性對照組以尼莫地平1 mg/kg灌胃，假手術(shù)組和模型組以生理鹽水10 mL/kg灌胃，每天1次，連續(xù)30 d。觀察藥物干預完成后大鼠的精神狀態(tài)、行走時肢體動作等行為學狀態(tài)。

1.5 水迷宮實驗評價大鼠認知功能 行為學觀察后實施水迷宮實驗，Morris水迷宮水池劃分為4個象限，在任意象限中心水面下1.5 cm處放置一平臺，距池壁20 cm，水中加入二氧化硅隱蔽平臺，水池周圍粘貼三角形圖片為參照線索，依次從4個象限入水點將大鼠面向池壁放入水中，記錄爬上平臺時間(逃避潛伏期)，超過60 s未找到平臺則引導大鼠爬上平臺，于平臺上停留20 s，逃避潛伏期為60 s。4個入水點每天各訓練1次，每一象限訓練間隔時間為20 min，隱蔽平臺實驗連續(xù)5 d，記錄第5天各組大鼠逃避潛伏期。第6天撤去平臺，任選1個入水點將大鼠面向池壁放入水中，記錄60 s內(nèi)穿越平臺位置次數(shù)、目標象限停留時間百分比。

1.6 Tunel染色觀察梗死周邊組織神經(jīng)細胞凋亡情況 水迷宮實驗結(jié)束后每組隨機選取5只大鼠，以4%多聚甲醛經(jīng)頸總動脈灌流固定，取左側(cè)視交叉前后2 mm腦組織，常規(guī)石蠟包埋、切片，厚度4 μm，Tunel染色觀察梗死周邊組織神經(jīng)細胞凋亡情況，陽染細胞核可見棕黃色顆粒。于顯微鏡下任選5個視野計數(shù)Tunel陽性細胞數(shù)。

1.7 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)檢測梗死周邊腦組織GSK-3β、β-catenin、Bax、Casp3 mRNA表達 各組剩余大鼠中選取5只，1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后開胸，胸穿針自左心室刺入，灌入4 ℃生理鹽水，快速取出梗死半球腦組織，置于液氮中，保存于-80 ℃。腦組織在液氮中研磨，Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，瓊脂糖凝膠電泳法鑒定產(chǎn)物，實施實時熒光定量PCR，按照試劑盒說明書設定反應體系，反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性10 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參基因，按照2-△△CT計算目的基因的相對表達量。引物序列詳見表1。

表1 引物序列

1.8 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin、p-β-catenin、Bax、Casp3蛋白相對表達量 取-80 ℃保存的梗死灶腦組織，冰上裂解，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，100 ℃水浴10 min，制備蛋白上樣液，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，加入封閉液室溫搖床2 h，加入封閉液稀釋一抗(1∶500)，4 ℃搖床孵育過夜，加入封閉液稀釋二抗(1∶2 000)，常溫孵育1 h，暗室中曝光、顯影及定影。采用Image J軟件分析圖像進行灰度值分析，以目的蛋白灰度值與內(nèi)參GAPDH灰度值比值表示蛋白相對表達量，并計算p-GSK-3β/GSK-3β、p-β-catenin/β-catenin。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠行為學觀察 假手術(shù)組精神狀態(tài)良好，活動正常，無異常表現(xiàn)。模型組精神狀態(tài)不佳，活動量減少，對側(cè)肢體無力，行走時向?qū)?cè)傾斜、旋轉(zhuǎn)追尾，抬頭困難，豎毛，提尾倒立時身體向?qū)?cè)彎曲，重者癱瘓，無法自立性行走。陽性對照組存在抬頭困難、豎毛、身體向?qū)?cè)旋轉(zhuǎn)追尾等表現(xiàn)，神經(jīng)功能損傷較模型組輕。石菖蒲低劑量組與陽性對照組行為學表現(xiàn)相同。石菖蒲高劑量組有輕度對側(cè)肌張力升高、豎毛、身體向?qū)?cè)傾斜等表現(xiàn)，神經(jīng)功能損傷較石菖蒲低劑量組輕。

2.2 各組逃避潛伏期、穿越平臺次數(shù)、目標象限停留時間百分比比較 逃避潛伏期、穿越平臺次數(shù)、目標象限停留時間百分比組間比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001)；與假手術(shù)組比較，模型組、陽性對照組、石菖蒲干預組逃避潛伏期延長，穿越平臺次數(shù)與目標象限停留時間百分比均減少，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，陽性對照組和石菖蒲干預組逃避潛伏期縮短，穿越平臺次數(shù)與目標象限停留時間百分比增加，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與陽性對照組和石菖蒲低劑量組比較，石菖蒲高劑量組逃避潛伏期縮短，穿越平臺次數(shù)與目標象限停留時間百分比增加，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；陽性對照組與石菖蒲低劑量組逃避潛伏期、穿越平臺次數(shù)、目標象限停留時間比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。詳見表2。

表2 各組逃避潛伏期、穿越平臺次數(shù)、目標象限停留時間百分比比較(±s)

2.3 各組神經(jīng)元凋亡情況比較 假手術(shù)組、模型組、陽性對照組、石菖蒲低劑量組、石菖蒲高劑量組凋亡神經(jīng)細胞數(shù)分別為(6.20±1.32)個、(40.40±4.52)個、(33.60±3.20)個、(32.60±3.85)個、(15.40±2.80)個。神經(jīng)細胞凋亡數(shù)組間比較，差異均有統(tǒng)計學意義(F=205.667，P<0.001)；與假手術(shù)組比較，模型組、陽性對照組、石菖蒲干預組凋亡細胞數(shù)更多，差異均有統(tǒng)計學意義(t值分別為23.907、25.870、21.567、9.986，P均<0.05)；與模型組比較，陽性對照組和石菖蒲干預組凋亡細胞數(shù)更少，差異均有統(tǒng)計學意義(t值分別為4.127、4.078、15.230，P均<0.05)；與陽性對照組比較，石菖蒲高劑量組凋亡細胞數(shù)更少，差異有統(tǒng)計學意義(t=13.790，P<0.05)；陽性對照組與石菖蒲低劑量組凋亡細胞數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學意義(t=0.290，P=0.773)。Tunel染色結(jié)果見圖1。

圖1 大鼠梗死灶周圍組織神經(jīng)細胞凋亡情況

2.4 各組GSK-3β、β-catenin、Bax、Casp3 mRNA相對表達情況 各組GSK-3β、β-catenin mRNA相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。各組Bax、Casp3 mRNA相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。與假手術(shù)組比較，模型組Bax、Casp3 mRNA相對表達量更高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，陽性對照組和石菖蒲干預組Bax、Casp3 mRNA相對表達量更低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與陽性對照組和石菖蒲低劑量組比較，石菖蒲高劑量組Bax、Casp3 mRNA相對表達量更低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；陽性對照組與石菖蒲低劑量組Bax、Casp3 mRNA相對表達量比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。詳見表3。

表3 各組GSK-3β、β-catenin、Bax、Casp3 mRNA相對表達量比較(±s)

2.5 各組p-GSK-3β/GSK-3β、p-β-catenin/β-catenin比值及Bax、Casp3蛋白相對表達量比較 各組p-GSK-3β/GSK-3β、p-β-catenin/β-catenin比值及Bax、Casp3蛋白相對表達量比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。與假手術(shù)組比較，模型組p-GSK-3β/GSK-3β、p-β-catenin/β-catenin比值及Bax、Casp3蛋白相對表達量更高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，陽性對照組和石菖蒲干預組p-GSK-3β/GSK-3β、p-β-catenin/β-catenin比值及Bax、Casp3蛋白相對表達量更低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與陽性對照組和石菖蒲低劑量組比較，石菖蒲高劑量組p-GSK-3β/GSK-3β、p-β-catenin/β-catenin比值及Bax、Casp3蛋白相對表達量更低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；陽性對照組與石菖蒲低劑量組p-GSK-3β/GSK-3β、p-β-catenin/β-catenin比值及Bax、Casp3蛋白相對表達量比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。詳見表4、圖2。

表4 各組p-GSK-3β/GSK-3β、p-β-catenin/β-catenin比值及Bax、Casp3蛋白相對表達量比較(±s)

圖2 各組Western Blot檢測GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin、p-β-catenin、Bax、Casp3蛋白相對表達量

3 討 論

腦梗死的發(fā)生機制是血液成分改變，出現(xiàn)動脈粥樣硬化及血栓，血管狹窄或阻塞引起腦部供血障礙，腦組織發(fā)生急性缺血、缺氧，梗死病灶腦細胞因缺血、缺氧而水腫、壞死，并生成大量自由基，造成神經(jīng)細胞凋亡，出現(xiàn)認知功能障礙、偏癱等神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)[8]。在腦梗死的治療中，如何抑制梗死病灶周邊缺血半暗帶的神經(jīng)細胞凋亡，阻止病情的進一步發(fā)展是改善神經(jīng)功能障礙的重要措施[9]。中藥在治療腦梗死方面有悠久的歷史，并積累了豐富的經(jīng)驗，且隨著現(xiàn)代醫(yī)學的發(fā)展，其優(yōu)勢逐漸被臨床認知。石菖蒲為有醒腦開竅作用的中草藥，在心腦血管疾病的治療中有廣泛應用，為腦梗死的藥物治療研究提供了新的方向。

石菖蒲是天南星科菖蒲屬植物石菖蒲的根塊莖，屬于芳香開竅類中藥，具有醒神益智、開竅醒腦、理氣活血、燥濕化痰等功效，主治因中風、牙關(guān)緊閉、眼合及手足拘攣癥[10]。石菖蒲的主要有效成分為揮發(fā)油β-細辛醚和丁香酚，有鎮(zhèn)靜、抗驚厥、抗抑郁、降血脂、抑制血小板聚集、抗菌、抗腫瘤、抗炎、抗氧化等多種作用[11]。章程鵬等[12]研究顯示，石菖蒲能夠修復睡眠剝奪引起的大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細胞損傷，減輕炎癥反應，改善大鼠的記憶功能。體外實驗證實，石菖蒲能減少脂多糖誘導的人腦神經(jīng)膠質(zhì)細胞中一氧化氮濃度，抑制過氧化損傷，達到腦保護作用[13]。本研究結(jié)果顯示，干預后模型組大鼠精神狀態(tài)差，活動量少，且有行走時向?qū)?cè)傾斜，有旋轉(zhuǎn)追尾、抬頭困難、豎毛、癱瘓等顯著的神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)。陽性對照組及石菖蒲低劑量組神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)較模型組輕，石菖蒲高劑量組神經(jīng)功能缺損狀態(tài)較低劑量組輕；與模型組比較，陽性對照組和石菖蒲干預組的逃避潛伏期更短、神經(jīng)細胞凋亡數(shù)更少，穿越平臺次數(shù)與目標象限停留時間百分比增加；與陽性對照組及石菖蒲低劑量組比較，石菖蒲高劑量組的逃避潛伏期更短、神經(jīng)細胞凋亡數(shù)更少，穿越平臺次數(shù)與目標象限停留時間百分比增加，說明石菖蒲可減輕腦梗死大鼠神經(jīng)功能損傷，抑制神經(jīng)細胞凋亡，改善認知功能障礙。

神經(jīng)細胞凋亡是造成腦梗死認知功能障礙的主要原因，GSK-3β/β-catenin信號通路在神經(jīng)細胞凋亡中發(fā)揮重要的轉(zhuǎn)導作用[14]。β-catenin是一種多功能蛋白，通過與細胞骨架的相互作用協(xié)助細胞對細胞外信號做出反應[15]。GSK-3β是β-catenin上游的關(guān)鍵酶，GSK-3β的磷酸化可使β-catenin的降解復合體失活，使β-catenin磷酸化，易位進入細胞核，與T細胞因子/淋巴增強因子結(jié)合，誘導細胞損傷及凋亡[16]。朱明等[17]研究發(fā)現(xiàn)，GSK-3β/β-catenin信號通路的激活可使大鼠海馬神經(jīng)元細胞形態(tài)發(fā)生改變，造成認知功能障礙。Darshit等[18]研究發(fā)現(xiàn)抑制GSK-3β/β-catenin信號通路的激活可上調(diào)GAP43、Ngn1和NeuroD2基因轉(zhuǎn)錄，維持神經(jīng)元存活。Casp3是細胞凋亡信號通路中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)位點，Casp3的激活可進一步激活下游信號調(diào)節(jié)因子促進細胞凋亡[19]。Bax是細胞主要的凋亡基因，可通過增加線粒體膜及細胞膜脂質(zhì)雙分子層的通透性，促進促凋亡因子進入細胞線粒體，誘導細胞凋亡[20]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，陽性對照組、石菖蒲干預組p-GSK-3β/GSK-3β、p-β-catenin/β-catenin比值，Bax、Casp3 mRNA及蛋白相對表達量降低；與陽性對照組及石菖蒲低劑量組比較，石菖蒲高劑量組p-GSK-3β/GSK-3β、p-β-catenin/β-catenin比值，Bax、Casp3 mRNA及蛋白相對表達量降低，提示石菖蒲可抑制腦梗死大鼠認知功能障礙、阻止神經(jīng)細胞凋亡，其機制可能與抑制GSK-3β/β-catenin信號通路的激活有關(guān)。

綜上所述，石菖蒲能改善腦梗死大鼠的認知功能障礙，抑制神經(jīng)細胞凋亡，其機制可能與抑制GSK-3β/β-catenin信號通路的激活有關(guān)，為與石菖蒲相關(guān)的治療腦梗死認知功能障礙的藥物研發(fā)提供依據(jù)。