王蕾，曾鳳梅，張麗珠，李小永，柳玉紅

(深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院產(chǎn)科，廣東 深圳 518101)

0 引言

胎膜早破(PROM)是妊娠常見(jiàn)的并發(fā)癥，發(fā)生率超過(guò)20%。感染是胎膜早破的主要原因[1]。絨毛膜羊膜炎是早產(chǎn)的常見(jiàn)原因，可能導(dǎo)致不良的新生兒結(jié)局，包括神經(jīng)發(fā)育后遺癥[2]。絨毛膜羊膜炎已被標(biāo)記為以感染或炎癥或兩者兼有為特征的多種疾病，其次是母親及其新生兒的臨床實(shí)踐[3]。早產(chǎn)在臨床中顯示是圍產(chǎn)期增加死亡人數(shù)及長(zhǎng)期發(fā)病率的主要原因。最近一項(xiàng)對(duì)871例妊娠的前瞻性研究發(fā)現(xiàn)，患有組織學(xué)絨毛膜羊膜炎的人，早產(chǎn)的發(fā)生率幾乎是沒(méi)有絨毛膜羊膜炎的人的兩倍[4]。本文檢測(cè)了胎膜早破產(chǎn)婦胎膜中的MMP-13及TLR2在單核細(xì)胞中的表達(dá)，同時(shí)探究其在宮內(nèi)感染中預(yù)測(cè)的價(jià)值，進(jìn)而提高患者生活質(zhì)量。為早期診斷宮內(nèi)感染患者診斷提供可靠、全面的醫(yī)學(xué)依據(jù)，同時(shí)也有利于臨床上的規(guī)范診療，具有巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

將2020年6月至2021年3月期間在我院進(jìn)行住院的胎膜早破產(chǎn)婦40例及足月無(wú)早破初產(chǎn)婦30例，根據(jù)病理檢查有無(wú)絨毛膜羊膜炎將產(chǎn)婦分為感染組,28例及非感染組12例。其中感染組別產(chǎn)婦28例，年齡23～36歲，平均年齡為(28.9±2.5)歲，孕周為(35.2±0.9)周，非感染組別產(chǎn)婦12例，年齡22～36歲，平均年齡為(28.1±2.2)歲，孕周為(37.8±1.4)周，對(duì)照組為正常產(chǎn)婦30例，年齡23～37歲,年齡(27.8±2.2)歲，孕周為(39.4±1.1)周，兩組一般資料比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

納入標(biāo)準(zhǔn)：符合以下標(biāo)準(zhǔn)的人被納入本次研究中，有明確的妊娠年齡，單胎，28-36個(gè)孕周，和(或)存在早期羊膜囊破裂，生殖和泌尿道感染。入選的產(chǎn)婦均無(wú)高血壓、心臟病、糖尿病、肝炎、腫瘤等病史。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)?；颊呒捌浼覍僦橥獠⒑炇鹜鈺?。診療過(guò)程嚴(yán)格遵循倫理原則，確?；颊唠[私和安全。將患者分為感染組和非感染組。對(duì)照組：孕齡，單胎，無(wú)子宮收縮，37周內(nèi)無(wú)分娩。

排除標(biāo)準(zhǔn)：病理性妊娠，例子妊娠期高血壓病癥、妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積病癥、前置胎盤、胎盤早剝、糖尿病、甲亢等內(nèi)外科疾病。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

臨床診斷絨毛膜羊膜炎：母體發(fā)熱、母體及/或胎兒心動(dòng)過(guò)速、母體白細(xì)胞增多、子宮壓痛、惡臭或膿性羊水。高倍鏡下中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)>5例，實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)：白細(xì)胞計(jì)數(shù)>15×109/L，中性粒細(xì)胞百分比>0.80，胎盤培養(yǎng)陽(yáng)性，胎膜炎性表現(xiàn)病理檢查，如有以上兩種情況，診斷為感染。

1.2 方法

禁食8h以上后，早晨采集靜脈血3mL和edta 抗凝1mL。收集單核細(xì)胞，檢測(cè) toll 樣受體2的表達(dá)。其余送實(shí)驗(yàn)室測(cè)定CRP。胎盤娩出后，嚴(yán)格無(wú)菌操作，取出大于4cm 的胎膜大小約為2cm×2cm×1cm。經(jīng)過(guò)濃度為10%的甲醛穩(wěn)定，將胎膜送病理檢查。(1)TLR2的檢測(cè)① 采集2份50μL EDTA抗凝的外周血標(biāo)本，浸入5mL流動(dòng)管底；② 加入5μL人CD14/PE抗體進(jìn)行單核細(xì)胞校準(zhǔn)，2.5μL人TLR4/FITC抗體與全血混合檢測(cè)TLR2表達(dá)；③ 另一管用5μL CD14/PE抗體進(jìn)行單核細(xì)胞校準(zhǔn)。將5μL IgG2a/FITC抗體的同源對(duì)照品加入流式細(xì)胞儀底部，與全血混合。細(xì)胞在室溫黑暗中培養(yǎng)20分鐘；④ 在兩個(gè)試管中分別加入250μL optilyse C?；旌虾?，試管避光10分鐘，以溶解紅細(xì)胞，直到液體變透明；⑤ 將LML-PBS洗滌液加入兩管后，輕輕混合，然后將樣品管放入離心機(jī)中，以1500rpm分離5分鐘，然后丟棄上清液；⑥ 向細(xì)胞沉淀中加入2mL PBS洗液，然后在1500rpm下丟棄上清液5min；⑦ 加入500μL PBS洗液后，輕輕混合，用上流式細(xì)胞儀檢測(cè)；⑧ 結(jié)果：TLR2蛋白在單核細(xì)胞表面有表達(dá)。⑨ 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。(2)血清MMP-13水平檢測(cè)：采用雙抗體夾心ABC酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和thermo multiskan MK3自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)血清MMP-13水平，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作。采集兩個(gè)觀察者的切片在顯微鏡下觀察，根據(jù)黃色反映的陽(yáng)性強(qiáng)度及面積來(lái)判斷結(jié)果，若陽(yáng)性細(xì)胞的陽(yáng)性強(qiáng)度分為無(wú)著色、淡黃色、棕黃色和棕褐色，則分別對(duì)應(yīng)計(jì)分為0、1、2、3分，最后應(yīng)用免疫組織化學(xué)積分計(jì)算總和。

1.3 觀察指標(biāo)及診斷標(biāo)準(zhǔn)

胎膜早破合并感染組、胎膜早破無(wú)感染組和對(duì)照組母外周靜脈血中TLR2水平及mmp-13比較.

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 25.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用(±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率(%)表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 每組孕婦血清及羊水MMP-13水平比較

結(jié)果顯示感染組母體血清及羊水的MMP-13表達(dá)水平均顯著高于非感染組，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。具體數(shù)據(jù)詳見(jiàn)表1。

表1 感染者及非感染者的MMP-13水平對(duì)比情況(±s，ng/L)

表1 感染者及非感染者的MMP-13水平對(duì)比情況(±s，ng/L)

組別 例數(shù) MMP-13血清 羊水感染組 28 382±105 95±28非感染組 12 153±80 68±25 t 6.744 2.881 P 0.000 0.007

2.2 三組產(chǎn)婦靜脈血收集的單核細(xì)胞表面TLR2蛋白水平的對(duì)比

結(jié)果顯示胎膜早破合并感染組外周血TLR2細(xì)胞顯著高于胎膜早破非感染組及正常對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而無(wú)絨毛膜羊膜炎者TLR2細(xì)胞與正常對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 三組產(chǎn)婦靜脈血收集的單核細(xì)胞表面TLR2 蛋白水平的對(duì)比(±s，%)

表2 三組產(chǎn)婦靜脈血收集的單核細(xì)胞表面TLR2 蛋白水平的對(duì)比(±s，%)

組別 例數(shù) TLR2感染組 28 12.2±4.52非感染組 12 1.98±0.25對(duì)照組 30 2.12±0.26 t 5.362 P 0.001

3 討論

基質(zhì)金屬蛋白酶是一類鋅依賴蛋白水解酶，負(fù)責(zé)切割多種ECM蛋白。它們主要分為膠原酶(MMP-1，-8，-13和-18)，明膠酶(MMP-2和-9)，膜型MMP(MMP-14，-15，-16，-17，-24和-25)和 其 他(MMP-7，-12，-19，-20，-23，-26和-28)。MMP是具有高度保守的信號(hào)肽，前肽域和催化域的多域蛋白[5]。除MMP-7，-23和-26外，所有MMP還包含富含脯氨酸的鉸鏈區(qū)和C端血紅素樣結(jié)構(gòu)域。由于MMP-13在OA中起著至關(guān)重要的作用，它已成為研究人員關(guān)注的熱點(diǎn)。如果能夠檢測(cè)或合成能夠阻斷MMP-13轉(zhuǎn)錄調(diào)控途徑中特定步驟，抑制其合成或與MMP-13結(jié)合以抑制其生長(zhǎng)的物種，則或許能夠治療OA它的活動(dòng)[6]。這種物質(zhì)稱為MMP-13抑制劑。結(jié)果顯示感染組母體血清及羊水的MMP-13表達(dá)水平均顯著高非感染組，MMP-13在感染細(xì)組中的表達(dá)顯著高于宮體部，研究表明胎膜宮頸部的結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜且宮體部薄弱，可推測(cè)出MMP-13在胎膜宮頸部的高度表達(dá)影響了產(chǎn)婦部分膠原降解速度，使其速度加快，進(jìn)而破壞底膜，加速了細(xì)胞凋亡，韌性降低最終導(dǎo)致宮頸部胎膜破裂，MMP-13的表達(dá)水平與孕周之間呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明表達(dá)水平越高，胎膜破裂時(shí)間越早，感染率越高。MMP-13可調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)含量和胎膜結(jié)構(gòu),引起胎膜結(jié)構(gòu)弱化,從而導(dǎo)致胎膜早破[7-8]。MMP-9在孕中期含量甚微,但在破膜、分娩及宮內(nèi)感染的羊水中明顯升高。

Toll樣受體2(Toll-like receptor 2，TLR2)作為脂多糖的跨膜信號(hào)受體，啟動(dòng)革蘭氏陰性菌的天然免疫應(yīng)答，是天然免疫和獲得性免疫之間的重要橋梁[9]。TLRs在急性炎癥、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞凋亡中起重要作用[10]。大多數(shù)研究集中在TLR-2和TLR-4上。本文比較了感染組和非感染組別的TLR-2mrna水平，結(jié)果表明，TLR-2mrna在感染組別早期顯著升高，提示機(jī)體激活了TLR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，產(chǎn)生炎癥介質(zhì)，胎膜早破宮內(nèi)感染早期誘導(dǎo)抗感染防御機(jī)制及免疫應(yīng)答的研究。巨噬細(xì)胞作為TLR2蛋白的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子，在免疫細(xì)胞的促炎癥反應(yīng)中起重要作用，主要作用于革蘭氏陰性菌。其意義體現(xiàn)在胎膜早破后導(dǎo)致新生兒出現(xiàn)宮內(nèi)感染早期機(jī)體已經(jīng)通過(guò)激活TLR信號(hào)傳導(dǎo)途徑，出現(xiàn)了炎癥介質(zhì)，誘導(dǎo)抗感染防御機(jī)制及免疫應(yīng)答反應(yīng)。早期羊膜囊破裂可以增加宮內(nèi)感染的速度和范圍。機(jī)體對(duì)感染產(chǎn)生免疫反應(yīng)，使單核巨噬細(xì)胞聚集，并在病原菌的作用下誘導(dǎo)TLR2的表達(dá)，起到抗感染的作用。

綜上所述，血MMP-13及TLR2在單核細(xì)胞中的表達(dá)與胎膜早破發(fā)生之間有著密切關(guān)聯(lián),均顯示高表達(dá)，可為后續(xù)臨床預(yù)測(cè)提供支持。作為感染標(biāo)記物在預(yù)測(cè)宮內(nèi)感染時(shí)有重要意義，在臨床中增加了一項(xiàng)可靠指標(biāo)。