魏 洪，姚夢(mèng)瑋，遲茜文，翁梓靖，龍金宇，陳光賢

（1.貴州醫(yī)科大學(xué)，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心感染與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州省織金縣美味鮮竹蓀產(chǎn)業(yè)有限公司，貴州 畢節(jié) 551700）

竹蓀（Dictyophora indusiata(Vent.ex Pers)Fisch）又名竹笙、竹菌等，是寄生在枯竹根部的一種隱花菌類(lèi)，營(yíng)養(yǎng)豐富、香味濃郁、味道鮮美，被人們稱(chēng)為“雪裙仙子”。目前全球竹蓀屬共分12 個(gè)種，我國(guó)有7 個(gè)[1]，其中可藥食兼用的有長(zhǎng)裙竹蓀、短裙竹蓀、紅托竹蓀和刺托竹蓀等。竹蓀富含蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖、多酚、黃酮和維生素等多種活性物質(zhì)[2-4]，具有抗炎[5-7]、調(diào)節(jié)免疫力[8-10]、抗腫瘤[11-12]和抗氧化[13-15]等作用。

紅托竹蓀是貴州特色優(yōu)勢(shì)品種，由菌托、子實(shí)體、菌裙和菌蓋組成，目前竹蓀品質(zhì)鑒定主要針對(duì)其子實(shí)體。菌托作為竹蓀的主要副產(chǎn)物，占全株鮮質(zhì)量的40%～60%。關(guān)于其主要營(yíng)養(yǎng)成分分析鮮見(jiàn)報(bào)道，Zhuang 等[16]研究了紅托竹蓀菌蓋和菌托中蛋白質(zhì)、多糖含量和氨基酸組成，結(jié)果顯示烘干菌托中蛋白質(zhì)含量占15.55%，多糖占77.08%，含17 種氨基酸；梁亞麗等[17]對(duì)紅托竹蓀及竹蓀蛋各部位的主要營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)竹蓀菌托富含多糖和氨基酸等多種生物活性成分。目前，對(duì)林下仿野生栽培紅托竹蓀營(yíng)養(yǎng)成分的報(bào)道較少，且不同種植方式的紅托竹蓀菌托不同部位成分的對(duì)比研究也鮮見(jiàn)報(bào)道。鑒于此，本研究以大棚和林下栽培的紅托竹蓀菌托為原料，測(cè)定了紅托竹蓀菌托菌皮、膠質(zhì)體、連接膜（膠質(zhì)體與孢子體的隔膜）這3 個(gè)部位[18]的蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖、多酚和黃酮的含量，比較了兩種種植方式下紅托竹蓀菌托主要成分含量的差異，為竹蓀栽培技術(shù)的優(yōu)化提供數(shù)據(jù)支持，也為開(kāi)發(fā)竹蓀的利用價(jià)值，拓展紅托竹蓀副產(chǎn)物菌托的合理利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮紅托竹蓀：貴州省織金縣美味鮮竹蓀產(chǎn)業(yè)有限公司提供。

福林酚，分析純，北京索萊寶科技有限公司；苯酚，分析純，成都金山化學(xué)試劑有限公司；硫酸，分析純，重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司；對(duì)硝基苯酚，分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；乙酰丙酮，分析純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；三氯化鋁，分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水乙酸鈉、無(wú)水乙醇，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；亞硝酸鈉，分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司；甲醛，分析純，成都金山化學(xué)試劑有限公司；乙酸，分析純，江蘇強(qiáng)盛化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-600 恒溫水箱，金壇市城西富城實(shí)驗(yàn)儀器廠(chǎng)；101-3A 電熱鼓風(fēng)干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司；SC-2556 低速離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；循環(huán)水式多用真空泵，鄭州科豐儀器設(shè)備有限公司；UV-1200 紫外分光光度計(jì)，Macy 儀器有限公司；AKD1-ii-0 超純水儀，深圳市華南高科水處理設(shè)備有限公司；LA8080 氨基酸自動(dòng)分析儀，日本株式會(huì)日立高新技術(shù)科學(xué)；FA2204N 電子天平（精度0.1 mg），上海菁海儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的處理

兩種新鮮竹蓀（大棚栽培和林下栽培），分別在23 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至子實(shí)體出蓀、菌裙撒開(kāi)，快速分離子實(shí)體與菌托，子實(shí)體烘干保存。菌托分為3 個(gè)部分：菌皮、膠質(zhì)、連接膜（膠質(zhì)體與孢子體的隔膜）。菌皮和連接膜用干燥箱烘干、粉碎，過(guò)40 目篩，保存?zhèn)溆?；膠質(zhì)進(jìn)行勻漿，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

（1）菌皮、連接膜和膠質(zhì)蛋白質(zhì)的提取

各稱(chēng)取菌皮和連接膜0.2 g、膠質(zhì)5 g，分別移入250 mL 定氮瓶中，加入硫酸銅0.1 g、硫酸鉀1 g 和硫酸5 mL，加熱至內(nèi)容物全部碳化，保持瓶?jī)?nèi)液體微沸，至液體呈藍(lán)綠色澄清透明后，繼續(xù)加熱0.5 h。冷卻至室溫，加入20 mL 水，得到提取液。菌皮和連接膜提取液移入100 mL容量瓶中，加水至刻度，得到消化液；吸取5.00 mL 消化液于100 mL 容量瓶?jī)?nèi)，膠質(zhì)提取液全部移入100 mL 容量瓶中；分別加對(duì)硝基苯酚溶液，搖勻后加氫氧化鈉溶液中和至黃色，再加乙酸溶液至溶液無(wú)色，用水稀釋至刻度，混勻備用。

（2）測(cè)定蛋白質(zhì)含量

參考GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》[19]中的第二法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。

1.3.3 多糖含量測(cè)定

（1）菌皮和連接膜的多糖提取

稱(chēng)取樣品2.0 g，加入60 mL、95 ℃蒸餾水提取2 h，抽濾，濾渣重復(fù)上述操作。合并兩次濾液，進(jìn)行濃縮，加入3 倍體積95%乙醇，4 ℃冷凍過(guò)夜，4 000 r/min 離心10 min，棄上清，得到沉淀，將沉淀加水復(fù)溶，定容至150 mL，得到竹蓀多糖水提液。取1 mL 竹蓀多糖水提液稀釋30 mL，得到多糖待測(cè)液。

（2）膠質(zhì)的多糖提取

稱(chēng)取膠質(zhì)5.0 g，勻漿，將pH 值調(diào)至4，然后將膠質(zhì)在-20 ℃冷凍1 h，于20 ℃下使其完全解凍，反復(fù)進(jìn)行10 次，于60 ℃提取5 h，抽濾，濾液濃縮至一定體積，加入4 倍體積95%乙醇，4 ℃冷凍過(guò)夜，4 000 r/min 離心10 min，棄上清，得到沉淀，將沉淀加水復(fù)溶，定容至100 mL，得到竹蓀多糖水提液。取10 mL 竹蓀多糖水提液稀釋至100 mL，得到多糖待測(cè)液[20]。

（3）測(cè)定多糖含量

參照NY/T 1676—2008《食用菌中粗多糖含量的測(cè)定》[21]測(cè)定多糖含量。

1.3.4 多酚含量測(cè)定

（1）菌皮、連接膜和膠質(zhì)樣品處理

稱(chēng)取菌皮或連接膜0.2 g、膠質(zhì)1 g，分別置于離心管中，加入70 ℃預(yù)熱的70%甲醇水溶液5 mL，混勻，70 ℃水浴浸提30 min（隔10 min 攪拌1 次），冷卻至室溫后3 500 r/min 離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至試管。殘?jiān)僦貜?fù)以上操作提取1 次。合并兩次提取液定容至10 mL，搖勻，過(guò)濾，待用。取菌皮或連接膜提取液1 mL 稀釋到10 mL，搖勻備用；膠質(zhì)提取液不進(jìn)行稀釋。

（2）測(cè)定多酚含量

參照GB/T 8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類(lèi)含量的檢測(cè)方法》[22]測(cè)定多酚含量。

1.3.5 黃酮含量測(cè)定

精確稱(chēng)量菌皮和連接膜各0.2 g、膠質(zhì)10 g，分別加90%乙醇30 mL，在70 ℃水浴中回流提取2 h，過(guò)濾，用90%乙醇定容至50 mL，得到待測(cè)液。吸取上述待測(cè)溶液1 mL 于試管中，加入90%乙醇2.0 mL，搖勻，再加入0.1 mol/L 氯化鋁溶液2 mL，震蕩混勻，最后加入乙酸-乙酸鈉緩沖溶液3 mL，用90%乙醇定容至10 mL，搖勻，靜置30 min，于波長(zhǎng)417 nm 處測(cè)定吸光度值[23-24]。

1.3.6 氨基酸含量測(cè)定

稱(chēng)取適量樣品于10 mL 離心管中，加入0.02 mol/L鹽酸溶解并定容。對(duì)樣品進(jìn)行凈化處理，然后采用氨基酸自動(dòng)分析儀檢測(cè)17 種游離氨基酸的含量[25]。

1.4 統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS 22.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，組間比較大棚和林下菌托各部位成分含量差異采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，組內(nèi)比較菌皮、膠質(zhì)和連接膜成分含量差異采用配對(duì)t 檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌皮、連接膜及膠質(zhì)

23 ℃恒溫培養(yǎng)竹蓀后，分離菌托菌皮、連接膜及膠質(zhì)，見(jiàn)圖1。菌托菌皮表面呈粉紅色或黑色，可能是部分生長(zhǎng)基質(zhì)附著于菌皮所致，見(jiàn)圖1a；連接膜呈灰白色，表面有一層黏性物質(zhì)，可能與膠質(zhì)相連接所致，見(jiàn)圖1b；膠質(zhì)呈淡粉色透明黏液，見(jiàn)圖1c。

圖1 竹蓀菌托菌皮、連接膜及膠質(zhì)Fig.1 The bacteria pellicle,connecting membrane and gelatin of Dictyophora indusiata

2.2 蛋白質(zhì)含量

表1 顯示了林下和大棚菌托三個(gè)部位的蛋白質(zhì)含量。由表知，與林下相比，大棚菌皮蛋白質(zhì)含量（25.516 g/100 g）和連接膜蛋白質(zhì)含量（22.708 g/100 g）均顯著高于林下，膠質(zhì)蛋白質(zhì)含量（0.144 g/100 g）顯著低于林下。大棚、林下兩種栽培方式的膠質(zhì)蛋白質(zhì)含量分別為0.144 g/100 g、0163 g/100 g，遠(yuǎn)低于菌皮和連接膜的蛋白質(zhì)含量（P＜0.05）。結(jié)果表明兩種栽培方式的菌皮和連接膜含有豐富的蛋白質(zhì)，其中大棚栽培方式下蛋白質(zhì)更優(yōu)。兩種栽培方式的蛋白質(zhì)含量與梁亞麗等[17]所報(bào)道的竹蓀菌托總蛋白質(zhì)含量（22.88 g/100 g）接近，但膠質(zhì)的蛋白質(zhì)含量遠(yuǎn)低于菌皮和連接膜，其可能原因是測(cè)定所用材料為新鮮膠質(zhì)，對(duì)多糖、多酚、黃酮和氨基酸的測(cè)定也發(fā)現(xiàn)類(lèi)似的趨勢(shì)，推測(cè)膠質(zhì)烘干后蛋白質(zhì)、多糖、多酚等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量應(yīng)與菌皮和接連膜相近。

表1 林下和大棚菌托三個(gè)部位蛋白質(zhì)含量Table 1 Protein content of three parts of Dictyophora rubrovolvata tray of understory and greenhouse 單位：mg/g

2.3 多糖含量

表2 顯示了林下和大棚菌托三個(gè)部位的多糖含量。由表知，與林下相比，大棚菌皮多糖含量（26.388 mg/g）和連接膜多糖含量（26.243 mg/g）顯著低于林下（分別為40.407 mg/g 和40.291 mg/g），而膠質(zhì)多糖含量（2.414 mg/g）顯著高于林下（1.983 mg/g）。大棚和林下兩種栽培方式下菌托的膠質(zhì)多糖含量分別為2.414 mg/g 和1.983 mg/g，遠(yuǎn)低于相應(yīng)菌皮和連接膜的（P＜0.05），見(jiàn)表2?？梢?jiàn)兩種栽培方式的菌皮和連接膜均含有多糖，林下種植多糖含量高于大棚。本研究中兩種栽培方式的菌皮和連接膜多糖均低于徐耀[26]所報(bào)道的竹蓀菌托總多糖含量（10.89%），也低于梁亞麗等[17]所報(bào)道的竹蓀菌托多糖含量（117.2 mg/g），其原因可能是他們所測(cè)定的是烘干菌托，而本研究直接采用了新鮮菌托，推測(cè)烘干后多糖含量應(yīng)該會(huì)高于整個(gè)菌托烘干后的多糖含量

表2 林下和大棚菌托三個(gè)部位多糖含量Table 2 Polysaccharide content in three parts of Dictyophora rubrovolvata tray of understory and greenhouse 單位：mg/g

2.4 多酚含量

表3 顯示了林下和大棚菌托三個(gè)部位的多酚含量。由表知，與林下相比，大棚菌皮多酚含量（7.87 mg/g）、連接膜多酚含量（8.20 mg/g）和膠質(zhì)多酚含量（0.107 mg/g）均顯著低于林下；且兩種栽培方式下膠質(zhì)的多酚含量分別為0.107 mg/g 和0.114 mg/g，遠(yuǎn)低于菌皮和連接膜的?？梢?jiàn)菌托的菌皮和連接膜多酚含量高于膠質(zhì)，且林下種植的多酚含量高于大棚。兩種栽培方式的菌皮和連接膜多酚含量都高于梁亞麗等[17]所報(bào)道的竹蓀菌托多酚含量（4.92 mg/g），一方面可能是由于本試驗(yàn)測(cè)定的是新鮮菌托，另一方面是因?yàn)槎喾佣啻嬖谟谥参锏那o、葉、皮、籽之中[27]，而菌皮和連接膜的結(jié)構(gòu)與植物的葉和皮等相似，所以多酚含量較高。

表3 林下和大棚菌托三個(gè)部位多酚含量Table 3 Contents of polyphenols in three parts of Dictyophora rubrovolvata tray of understory and greenhouse 單位：mg/g

2.5 黃酮含量

表4 顯示了林下和大棚菌托三個(gè)部位的黃酮含量。由表知，與林下相比，大棚菌皮的黃酮含量（1.392 mg/g）、連接膜的黃酮含量（1.056 mg/g）和膠質(zhì)的黃酮含量（0.054 2 mg/g）均顯著低于林下；大棚和林下兩種栽培方式的膠質(zhì)多酚含量分別是0.054 2 mg/g、0.057 9 mg/g，遠(yuǎn)低于菌皮和連接膜的（P＜0.05）。表明菌托的菌皮和連接膜富含黃酮。本實(shí)驗(yàn)所報(bào)道的大棚菌皮、連接膜和林下菌皮的黃酮含量與梁亞麗[17]所報(bào)道的相差不大。

表4 林下和大棚菌托三個(gè)部位黃酮含量Table 4 The content of flavonoids in three parts of Dictyophora rubrovolvata tray of understory and greenhouse 單位：mg/g

2.6 氨基酸含量及種類(lèi)

2.6.1 氨基酸含量

表5 顯示了林下和大棚菌托三個(gè)部位總氨基酸和必需氨基酸含量。由表知，與林下相比，大棚菌皮、連接膜、膠質(zhì)總氨基酸和必需氨基酸總含量都高于林下菌托相應(yīng)各部位的（P＞0.05）。大棚和林下兩種栽培模式下膠質(zhì)的總氨基酸分別為0.027 46 g/100 g、0.004 08 g/100 g，必需氨基酸分別為0.002 22 g/100 g，0.001 63 g/100 g，遠(yuǎn)低于菌皮和連接膜的。

表5 林下和大棚菌托三個(gè)部位總氨基酸和必需氨基酸含量Table 5 Contents of total amino acids and essential amino acids in three parts of Dictyophora rubrovolvata tray of understory and greenhouse

2.6.2 氨基酸種類(lèi)

表6 顯示了林下和大棚菌托三個(gè)部位的氨基酸種類(lèi)及含量。由表知，大棚和林下的菌皮、連接膜都測(cè)出了15 種氨基酸，且都含有蘇氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、賴(lài)氨酸、異亮氨酸、亮氨酸這6 種必需氨基酸。大棚膠質(zhì)一共測(cè)出7 種氨基酸，其中必需氨基酸有蘇氨酸、纈氨酸和賴(lài)氨酸；林下膠質(zhì)一共測(cè)出5 種氨基酸，其中必需氨基酸有蘇氨酸和纈氨酸。大棚菌皮、連接膜、膠質(zhì)以下林下菌皮和膠質(zhì)都測(cè)出了天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、纈氨酸這5 種氨基酸，見(jiàn)表6。其中天冬氨酸和谷氨酸是鮮味氨基酸[25]，是竹蓀味道的主要影響因素。

表6 林下和大棚菌托三個(gè)部位氨基酸種類(lèi)及含量Table 6 Amino acid types and contents of three parts of Dictyophora rubrovolvata tray of understory and greenhouse 單位：g/100 g

3 結(jié)論

在本研究中，兩種栽培模式下紅托竹蓀菌托的3 個(gè)部位（菌皮、膠質(zhì)和連接膜）都含有蛋白質(zhì)、多糖、多酚、黃酮和氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。除蛋白質(zhì)和氨基酸外，林下其他主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)均高于大棚。可見(jiàn)不同種植方式下紅托竹蓀菌托主要營(yíng)養(yǎng)成分含量不同，關(guān)于竹蓀菌托開(kāi)發(fā)應(yīng)用可根據(jù)不同栽培方式下的優(yōu)勢(shì)物質(zhì)而定。

相比菌皮和連接膜，膠質(zhì)各主要成分均較低，可能是由于膠質(zhì)是用新鮮樣品測(cè)量的，含水量過(guò)高，而菌皮和連接膜是用烘干后的粉末測(cè)定，導(dǎo)致新鮮膠質(zhì)各種成分含量都偏低；相比其他主要成分，多糖在菌托內(nèi)占比最高，大棚菌皮和連接膜分別為26.388 mg/g 和26.243 mg/g；林下則分別為40.407 mg/g 和40.291mg/g，也就是說(shuō)多糖可作為竹蓀菌托的重點(diǎn)開(kāi)發(fā)應(yīng)用成分。因此后續(xù)有必要繼續(xù)探討干燥后菌托膠質(zhì)其主要成分含量和竹蓀菌托各主要成分總含量，為竹蓀菌托產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)；同時(shí)探討竹蓀菌托多糖提取方法，為解決廢棄菌托資源浪費(fèi)問(wèn)題，提升竹蓀附加值提供支持。