王 洋, 王瑩瑩, 張 政, 馮國棟, 周 宇, 牛向麗

(合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230601)

蛋白質(zhì)作為大多數(shù)基因編碼的最終產(chǎn)物,負責(zé)細胞內(nèi)主要生物過程。它們可以單獨行使功能,更多的是與其他蛋白質(zhì)通過相互作用,彼此之間密切協(xié)調(diào)建立復(fù)雜的關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò),共同維持生物體的正常生命活動。因此,蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的闡明是生物學(xué)的一個重要研究內(nèi)容。目前,蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的實驗檢測方法有多種,其中20世紀90年代興起的酵母雙雜交技術(shù),仍是研究蛋白質(zhì)互作的有效手段之一[1]。這種技術(shù)是基于真核生物轉(zhuǎn)錄因子具有2個可分離的結(jié)構(gòu)域，即DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(binding domain,BD)和激活結(jié)構(gòu)域(activating domain,AD)。DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域負責(zé)轉(zhuǎn)錄因子識別結(jié)合于特定基因組DNA序列,而激活結(jié)構(gòu)域則促進所識別特定基因的轉(zhuǎn)錄。通過檢測蛋白質(zhì)之間的相互作用,可以使BD、AD結(jié)構(gòu)域接近而激活下游報告基因的表達[2],由此利用報告基因的表達檢測與某一蛋白質(zhì)(誘餌)發(fā)生相互作用的蛋白質(zhì)(獵物)[3]。在過去的幾十年中,酵母雙雜交技術(shù)不僅用于檢測已知蛋白質(zhì)間的互作,還被應(yīng)用于篩選各種基因文庫,通過從酵母文庫中批量篩選獲得與已知蛋白互作的未知蛋白,極大降低了大規(guī)模庫篩選的成本和人力[4-5],進而用于探究蛋白質(zhì)之間的作用網(wǎng)絡(luò)及其所調(diào)控的生命活動。

番茄抗病蛋白Pto由抗病基因P.s.pv.tomato編碼,作為識別、防御病原菌的一種重要抗性蛋白,可以識別病原菌注入植物體內(nèi)的效應(yīng)蛋白,觸發(fā)下游防御反應(yīng),在番茄的抗病機制中發(fā)揮重要作用[6-7]。在之前的研究中,通過使用酵母雙雜交技術(shù)檢測到與Pto互作的蛋白質(zhì),并命名為Pti (Pto interaction protein)[8-9]。其中Pti4/5/6編碼蛋白質(zhì)具有轉(zhuǎn)錄因子特性,可以特異結(jié)合于病程相關(guān)PR基因的啟動子GCC box元件[10],被認為可能做為下游基因參與Pto所介導(dǎo)抗病途徑。有研究表明,Pti4的表達可以由生物和非生物脅迫引起,受乙烯、水楊酸、創(chuàng)傷和病原菌誘導(dǎo),而Pti5僅由病原微生物,如番茄斑點病致病菌丁香假單胞桿菌番茄致病變種DC3000(Pseudomonassyringaepv.tomatoDC3000，PstDC3000)誘導(dǎo)特異表達[11]。此外,還有報道認為Pti5通過上調(diào)PR基因使植物表現(xiàn)出對蚜蟲的抗性[12]。已有報道均表明,Pti基因可能在番茄防御免疫、生長發(fā)育等多個過程中發(fā)揮作用,然而近年來對Pti基因的研究較少,對植物體內(nèi)Pti的互作蛋白也所知甚少。因此,本文以正常生長番茄野生型葉片、接種丁香假單胞桿菌番茄致病菌株P(guān)stDC3000的感病株系prf3[13]、抗性株系PtoR[14]的葉片構(gòu)建酵母雙雜交cDNA文庫,通過篩選文庫Pti5互作蛋白信息,以利于后續(xù)對Pti作用機制的深入研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 植物材料

本研究所用野生型番茄品種AC+、PtoR、prf3來自于美國康奈爾大學(xué)THOMPSON植物研究所,由本實驗室繁育保存,種植于合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院的人工氣候培養(yǎng)室。

1.1.2 菌株與載體

丁香假單胞桿菌菌株P(guān)stDC3000,大腸桿菌E.coli菌株DH5α、KC8,酵母菌株EGY48,pEG202、pJG4-5載體。以上菌株和載體均由本實驗室保存。

1.1.3 試劑與藥品

質(zhì)粒提取試劑盒、Oligotex mRNA Kit,均購于Qiagen;Trizol、反轉(zhuǎn)錄酶,均購于Invitrogen;DNA連接酶購于NEB;限制性內(nèi)切酶、DNA聚合酶,均購于Takara;5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷(X-gal)、聚乙二醇3350 (PEG3350)、鮭魚精DNA (carrier DNA),均購于Sigma-Aldrich;酵母氮源(yeast nitrogen base without amino acid)、各種氨基酸,均購于生工生物工程(上海)股份有限公司;葡萄糖(glucose,Glu)、棉籽糖(raffinose,Raf)、半乳糖(galactose,Gal)、醋酸鋰(LiAc)等均為國外原裝進口或國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 番茄葉片酵母雙雜交cDNA文庫的構(gòu)建

分別取正常生長未處理野生型番茄植株葉片、以真空滲透法接種PstDC3000的感病株系prf3及抗性株系PtoR的葉片,液氮研磨提取總RNA。采用瓊脂糖凝膠電泳、NanoDrop 2000檢測所提RNA的質(zhì)量濃度和質(zhì)量。使用Oligotex mRNA Kit試劑盒分離純化mRNA,并按RNA質(zhì)量濃度將不同處理條件的葉片樣品等量混合,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA用于文庫構(gòu)建。

參考Clontech公司提供的酵母雙雜交文庫構(gòu)建方法,將合成的雙鏈cDNA加5’接頭,均一化處理后,利用同源重組法將已純化的雙鏈cDNA與酶切后pJG4-5載體連接,連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞。

取轉(zhuǎn)化菌液10 μL作為母液,稀釋100倍后取出10 μL涂布于氨芐青霉素抗性的培養(yǎng)板。待單克隆長出后統(tǒng)計個數(shù),用于計算文庫容量,具體計算公式為：

文庫容量=每皿平均克隆數(shù)/涂布體積×稀釋倍數(shù)×轉(zhuǎn)化體積。

挑取單克隆,依據(jù)載體特異引物(PJG4-5-F:CCAGCCTCTTGCTGAGTGGAGATG、PJG4-5-R:AAGCCGACAACCTTGATTGGAG)進行聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴增,通過瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物,鑒定陽性率及插入片段大小。

1.2.2Pti5酵母雙雜交載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化

根據(jù)番茄Pti5基因(U89256)編碼區(qū)序列設(shè)計引物SP5F(TCCCCGCGGATGGTTC CAACTCCTCAAAGT)、SP5R(CATGGGCCC TTAACATCTTGATTCAAATACATCATT),分別引入SacⅡ、ApaⅠ酶切位點。以番茄葉片cDNA為模板進行PCR擴增,將預(yù)期大小的條帶經(jīng)膠回收后連接于pEG202載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌,涂布于固體培養(yǎng)基板,待單克隆長出后提取質(zhì)粒,經(jīng)酶切鑒定、測序,構(gòu)建pEG202-Pti5釣餌(bait)載體。然后利用PEG/LiAc法將pEG202-Pti5載體轉(zhuǎn)化EGY48酵母感受態(tài),并進行PCR菌落鑒定,保存陽性轉(zhuǎn)化酵母單克隆。

1.2.3 Pti5互作蛋白的篩選

以帶有pEG202-Pti5質(zhì)粒的酵母細胞制備感受態(tài)。將制備的酵母感受態(tài)細胞、carrier DNA與所構(gòu)建文庫的質(zhì)?；旌稀⒎盅b后,均勻涂布于三缺(-His/-Trp/-Ura)固體培養(yǎng)基,28 ℃培養(yǎng)至單克隆生長。將菌體用涂布棒刮下、收集,加等量甘油保存。取少量上述轉(zhuǎn)化菌液進行培養(yǎng),梯度稀釋后分別涂布于四缺(-His/-Trp/-Ura/-Leu)固體培養(yǎng)基,待單克隆生長后轉(zhuǎn)移至新的四缺固體培養(yǎng)基,再挑取酵母細胞單克隆至三缺固體培養(yǎng)基封閉,最后將酵母單克隆轉(zhuǎn)至含X-gal的固體顯色培養(yǎng)基,觀察LacZ及Leu報告基因的表達情況,若出現(xiàn)藍色克隆即為陽性克隆。將陽性克隆提取質(zhì)粒,電轉(zhuǎn)化E.coli菌株 KC8。菌落PCR鑒定為陽性克隆用于測序。將經(jīng)測序獲得的靶標基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進行Blast比對分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄葉片酵母雙雜交cDNA文庫分析

本文分別提取正常生長未處理的野生型番茄植株葉片、PstDC3000接種處理的感病株系prf3及抗性株系PtoR的葉片RNA,如圖1所示。瓊脂糖凝膠電泳顯示,RNA條帶清晰,核糖體條帶清晰完整。RNA質(zhì)量濃度均大于280 ng/μL,A260/A280為2.03～2.06,顯示RNA質(zhì)量良好,可用于mRNA分離和反轉(zhuǎn)錄。

圖1 番茄葉片樣品RNA

反轉(zhuǎn)錄雙鏈cDNA加5’接頭、均一化處理后連接pJG4-5載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞。取10 μL轉(zhuǎn)化菌液稀釋100倍后取10 μL涂布于帶有氨芐青霉素的培養(yǎng)板。培養(yǎng)皿平均生長克隆數(shù)為250個,計算文庫容量為1.25×107CFU。隨機挑取24個克隆,以載體特異性引物進行PCR擴增,電泳結(jié)果顯示均有擴增產(chǎn)物,插入片段平均長度大于1 000 bp。結(jié)果表明,所構(gòu)建番茄葉片酵母雙雜交文庫質(zhì)量可用于后續(xù)篩選實驗。

2.2 Pti5酵母雙雜交載體構(gòu)建結(jié)果分析

以番茄葉片cDNA為模板,經(jīng)PCR擴增得到483 bp預(yù)期大小的產(chǎn)物,純化后,經(jīng)SacⅡ、ApaⅠ酶切、膠回收,連接于同樣酶切的pEG202載體,并轉(zhuǎn)化大腸桿菌。將轉(zhuǎn)化單克隆提取質(zhì)粒,進行酶切鑒定、測序,獲得pEG202-Pti5釣餌載體,如圖2所示。

圖2 pEG202-Pti5載體酶切鑒定

將pEG202-Pti5載體轉(zhuǎn)化酵母菌株感受態(tài)EGY48,對酵母單克隆進行PCR菌落鑒定。陽性酵母單克隆于X-gal顯色培養(yǎng)基上劃線28 ℃生長24 h。酵母克隆呈正常生長狀態(tài),表明Pti5的轉(zhuǎn)入并未對酵母細胞產(chǎn)生毒性,也未顯示自激活活性。

2.3 Pti5互作蛋白篩選結(jié)果分析

參照酵母雙雜交文庫篩選操作步驟,以pEG202-Pti5轉(zhuǎn)化酵母細胞制備感受態(tài),轉(zhuǎn)入文庫質(zhì)粒,在培養(yǎng)板上可以看到大量共轉(zhuǎn)化克隆生長,如圖3a所示。

收集共轉(zhuǎn)化克隆涂布至四缺固體培養(yǎng)基,再轉(zhuǎn)移至三缺固體培養(yǎng)基,最后將酵母單克隆移至X-gal顯色培養(yǎng)基,觀察報告基因的表達情況。28 ℃培養(yǎng)24 h后發(fā)現(xiàn)有藍色克隆出現(xiàn),即為陽性克隆,如圖3b所示。

圖3 Pti5互作蛋白的篩選

挑取陽性克隆于液體培養(yǎng)基培養(yǎng)、抽提酵母質(zhì)粒,然后將質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化E.coli菌株 KC8,菌落PCR鑒定后,提取陽性克隆質(zhì)粒用于PCR擴增,結(jié)果如圖4所示。

根據(jù)陽性克隆插入片段大小及酶切情況,去除重復(fù)克隆。將陽性克隆質(zhì)粒進行測序。測序比對結(jié)果顯示,初步獲得了3個可能的靶標互作基因:TCP transcription factor (NM-001246881)、serine/threonine-protein kinase BUD32 (NM-001328538)和RNA-binding protein(XM-004242427)。

圖4 陽性克隆PCR鑒定

3 討 論

植物抗蟲、抗病基因及其作用機制一直是植物功能基因研究及遺傳改良的重要問題。番茄作為我國廣泛栽培的一類果蔬類經(jīng)濟作物,其營養(yǎng)豐富,又是目前研究細菌性病害的一種常見模式植物[15]。

番茄細菌性斑點病是由丁香假單胞菌引起的病害,在世界范圍內(nèi)均有發(fā)病報道,病害發(fā)生后會降低番茄產(chǎn)量、影響其口味[16-17]。番茄抗病基因Pto最早通過圖位克隆從抗病品種中獲得[18],在番茄的抗病機制中發(fā)揮重要作用。Pti作為Pto的互作蛋白,與Pto的互作已經(jīng)在植物表達系統(tǒng)中被驗證[19],但對Pti基因的下游互作蛋白及其可能的作用機制仍缺乏深入了解。因此,本研究使用酵母雙雜交技術(shù)進一步篩選與Pti5相互作用的蛋白質(zhì),以探討Pti在番茄免疫防御中的作用途徑。

通過選擇不同組織、不同發(fā)育階段以及不同條件處理的生物材料,提取RNA由反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,形成特定條件下功能基因克隆的集合,用于構(gòu)建高質(zhì)量cDNA文庫,是篩選互作蛋白的前提和保障[20-22]。本研究基于Pti基因在番茄抗病防御方面的功能,選取不同處理條件下、不同抗病、感病植株樣品用于構(gòu)建cDNA文庫,以盡量使文庫包含抗病途徑中的相關(guān)基因。經(jīng)檢測該文庫容量、插入片段大小及陽性率均符合文庫要求,可用于Pti及其他抗病基因互作蛋白的篩選與后續(xù)機制研究。

本文在文庫構(gòu)建基礎(chǔ)上進一步以Pti5為誘餌蛋白進行了互作蛋白篩選,初步獲得了3個可能與Pti5互作的轉(zhuǎn)錄因子。Pti5是一個約20 kDa的小分子量蛋白,它很有可能通過與其他轉(zhuǎn)錄因子形成復(fù)合體而對目標基因進行轉(zhuǎn)錄調(diào)控。經(jīng)過比對分析,靶標互作基因TCP transcription factor (NM-001246881)編碼TCP轉(zhuǎn)錄因子,該轉(zhuǎn)錄因子家族為植物所特有,位于植物各種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的樞紐[23],調(diào)控植物的生長發(fā)育及響應(yīng)各種環(huán)境脅迫;serine/threonine-protein kinase BUD32 (NM-001328538) 編碼一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,可能參與植物體響應(yīng)脅迫信號[24];RNA-binding protein (XM-004242427)則編碼RNA結(jié)合蛋白,該類蛋白在基因轉(zhuǎn)錄后表達調(diào)節(jié)中發(fā)揮功能,被認為介導(dǎo)植物對生長素、細胞分裂素等激素有一定的敏感性,并參與細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程[25]。這些轉(zhuǎn)錄因子涉及植物生長發(fā)育、環(huán)境脅迫應(yīng)答等調(diào)控途徑,也與所推測Pti5在番茄中作用機制相吻合。這些篩選靶標蛋白是否在植物體內(nèi)與Pti5相互作用,仍需要后續(xù)在植物表達系統(tǒng)中進一步驗證。此外,由于Pti4/5/6基因具有功能機制的相似性,本文也為其他Pti基因作用機制的研究提供了基礎(chǔ)。