王瑞博，許定花，劉家勝，張 弓，柯江偉，龔昱斌，李方仲，韓 璐，徐國華，司小偉，沈吉友，邵聰文

（浙江天元生物藥業(yè)有限公司，浙江 杭州 311100）

0 引言

2019年末開始，席卷全球并蔓延至今的嚴重急性呼吸道綜合癥疫情，是由新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）所引起的［1］.疫情發(fā)生后，國內(nèi)外迅速組織開展多種新型冠狀病毒疫苗的研究［1-2］，其中傳統(tǒng)的滅活疫苗由于其安全、不存在散毒的危險、便于貯存和運輸、產(chǎn)生抗體水平高等優(yōu)點，很快進入臨床并用于全球的免疫接種［3］.

新型冠狀病毒滅活疫苗（Inactivated SARS-CoV-2 vaccine）含有病毒的所有抗原，免疫動物后可以產(chǎn)生針對病毒所有蛋白的抗體，從而使機體獲得適應性免疫［4］.其中，病毒表面棘突蛋白（S蛋白）是SARSCoV-2的所有結構蛋白的主要抗原成分，負責誘導宿主免疫反應［5-6］，與疫苗引起中和抗體水平關聯(lián)度很大［7］.而且，靶向S蛋白的抗體可以誘導針對病毒感染的保護性免疫［8］，因此，S蛋白的特異性抗體效價是檢測新冠疫苗保護作用的重要標志.但從當前國內(nèi)研發(fā)進展較快的幾款新冠病毒滅活疫苗動物和臨床試驗數(shù)據(jù)看出，中和抗體數(shù)值偏低，且在免疫效果和免疫時間上可能都存在不足［3，9-10］.因此，必須通過添加佐劑的方式來提高疫苗的免疫效果.

CpG是一類合成的、含有1個或多個非甲基化的單鏈DNA，可通過DC細胞的吸附和內(nèi)吞作用，被細胞質(zhì)內(nèi)膜上TLR9受體識別，引發(fā)天然免疫和獲得性免疫應答，從而介導對病毒和細菌的清除，增強免疫效果［11］.CpG還能協(xié)同刺激抗原特異性B細胞和T細胞分化，有效地激活獲得性免疫，并刺激B細胞分泌IL-6、IL-10等細胞因子和表達MHCⅡ、B7-1、B7-2等表面分子，阻止B細胞的凋亡，增強特異性抗體的分泌［12］；同時，CpG還能直接激活單核細胞、巨噬細胞和樹突細胞，引起這些細胞分泌IL-12、TNFα等Th1樣為主的細胞因子，增強細胞免疫的效果［13］.國外已有Dynavax公司的CpG佐劑乙肝疫苗上市銷售.

本文擬在當前鋁佐劑新型冠狀病毒滅活疫苗的基礎上，添加CpG佐劑制成雙佐劑新冠滅活疫苗，可以有效地提高當前血清效價和中和抗體水平，并降低抗原用量，降低生產(chǎn)成本，提高疫苗產(chǎn)率以及未來全球新冠疫苗的使用覆蓋率，造福人類.

1 材料

1.1 主要試劑及材料

Vero細胞，購買于ATCC，編號CCL-81；COVID-19新型冠狀病毒毒株（毒株號：ZJU-CV）由浙江大學傳染病診治國家重點實驗室分離；β-丙內(nèi)酯購買于SERVA；核酸酶購買于Merck；氫氧化鋁為自制；CpG佐劑來源于南京華普生物技術股份有限公司；BALB／C小鼠購買于北京維通利華實驗動物技術有限公司；純化后的滅活病毒原液，公司自制；新冠重組S1蛋白，購自北京義翹神州生物技術有限公司；陰性血清，取自免疫前的動物.

1.2 儀 器

冰箱購自海爾集團有限公司，型號為HYC-390；電熱恒溫培養(yǎng)箱購自美國STIK集團公司，型號為CTHI-250B；純化層析系統(tǒng)購自GE，型號為AKTA Pure；酶標儀購自美谷分子（Molecular Devices），型號為VersaMax.

2 方法

2.1 滅活疫苗原液的制備

從液氮罐中取出相應數(shù)量的Vero細胞，復蘇并置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)傳代，直至達到生產(chǎn)規(guī)模細胞數(shù)量.然后在P3操作區(qū)進行生產(chǎn)用病毒液的制備，在接種前用MEM培養(yǎng)液將毒種稀釋至相應梯度，然后加入到細胞工廠，混勻完畢后旋緊蓋子，放入35℃培養(yǎng)箱培養(yǎng).當病變達到50%～80%后，收集培養(yǎng)上清并按1∶4 000比例加入β-丙內(nèi)酯滅活20h.滅活完畢后，取樣在Vero細胞盲傳，以細胞病變法檢查病毒，結果應均為陰性.

轉到普通潔凈操作區(qū)進行超濾濃縮30到50倍，添加核酸酶消化Vero細胞DNA，然后用純化層析系統(tǒng)純化，收獲樣品溶液第一峰到收集瓶中.除菌過濾，取樣進行蛋白含量和抗原含量測定，加入人血白蛋白至0.3%～0.5%，即為原液.

2.2 不同配方滅活疫苗半成品及成品的制備

在無菌操作間A級層流下，配制半成品原液：新冠單價抗原總蛋白的終濃度為2、4、8μg／mL，人血白蛋白的終濃度為0.3%～0.5%，氫氧化鋁（自制）終濃度為450μg／mL，CpG佐劑終濃度為5、20、40、80 μg／mL，然后分裝至無菌西林瓶中，0.5mL／瓶，即為成品.所有樣品配方分組及規(guī)格見表1.

表1 新冠滅活疫苗成品配方規(guī)格Tab.1 Formulation of COVID－19 inactivated vaccine

2.3 動物免疫及處理

選取18～20 g的BALB／C小鼠（購買于維通利華），按照表1配制分組進行實驗，每組8只，雌雄各半；每組按設計的免疫程序，在D0和D14天分別以腹腔注射免疫小鼠，每次注射0.5mL.按實驗設計時間，分別在D0、D6、D13、D21和D28采血并分離血清，所有血清檢測全病毒和S1蛋白特異性IgG，以及病毒中和抗體；按統(tǒng)計學計算每組動物血清IgG和病毒中和抗體幾何平均效價（GMT值）.

2.4 免疫動物特異性抗體水平檢測

先用包被液稀釋純化后的滅活病毒原液和S1重組蛋白抗原，包被到酶標板中，2～8℃過夜.次日，用TPBS（含吐溫-20的PBS溶液）清洗3遍，加入封閉液（含10%脫脂奶粉的PBS溶液）在37℃下封閉1h.然后用TPBS清洗3遍，加入用封閉液稀釋成不同比例的新冠病毒實驗血清（取自2.3中的不同組免疫小鼠）或陰性血清（取自免疫前的小鼠），37℃下結合1h.TPBS清洗3遍后，加入用封閉液以1∶4 000稀釋后的酶標二抗，37℃下結合1h.TPBS清洗3遍后，加入顯色液在室溫下顯色3～5min，然后加入終止液終止反應.

酶標儀下，在450 nm波長處讀值.以每個96孔板中的陰性孔讀數(shù)平均值的2.1倍作為Cutoff值判斷陰陽性，從而確定每個血清樣品的效價.

2.5 中和抗體檢測

在P3潔凈操作區(qū)內(nèi)，取毒種一支接種到準備好的Vero細胞中，置35℃培養(yǎng)箱培養(yǎng).當細胞發(fā)生病變感染率≥80%則可收集.收集后進行病毒滴度的測定，用培養(yǎng)基維持液稀釋至200 TCID50／50μL，備用.將待測血清樣本用無血清MEM培養(yǎng)基作連續(xù)1∶10稀釋，然后過濾除菌，同時取陰性對照小鼠血清同法作系列濃度稀釋為陰性對照.取96孔培養(yǎng)板，按縱向（A-G）每孔加入50μL稀釋的待測血清和50μL 200 TCID50的病毒液，每個血清濃度設3個復孔.輕柔混勻血清和病毒液，37℃孵育1 h.

將傳代培養(yǎng)的Vero細胞消化吹散后，用培養(yǎng)液將細胞濃度調(diào)準至2×105／mL.取100μL細胞加入至上述含病毒／血清混合物的培養(yǎng)板孔中并混勻，放置于35°C細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng).接種后第4天觀察細胞病變（CPE）情況，第6天最終判定結果.判定結果是需滿足：抗體本身無明顯細胞毒性；正常細胞對照成立；病毒對照CPE達++++.以能抑制細胞不受100 TCID50的新型冠狀病毒感染所致的細胞病變效應的血清最高稀釋度，為該血清樣本的抗病毒中和活性或效價.

3 結果

3.1 不同配方規(guī)格新冠疫苗成品的制備

配制好的雙佐劑新冠滅活疫苗成品從抗原含量上來說，分為低（組4-8）、中（組9-13）、高（組14-18）三個劑量，組合低、中、高、超高劑量的CpG佐劑，用以在動物上評價佐劑的劑量影響.同時，配方組還設計了佐劑對照組（組1-3）.

3.2 不同配方新冠疫苗免疫動物后特異性抗體效價

最先檢測了D21的血清樣品，發(fā)現(xiàn)佐劑對照組的全病毒效價很高，背景影響較大，所以，其他天血清僅做了S1蛋白特異性抗體水平的檢測.各組配方疫苗在D06天就產(chǎn)生了S1蛋白特異性的抗體，然后逐漸增高.由于在D28天就終止了免疫實驗，所以無法確定D28的抗體水平是否為最高.結果見圖1.

在D28天（圖1d）的結果中，與單獨鋁佐劑組相比（組4、9），低、中劑量抗原組在添加CpG后，S1蛋白抗體效價遠大于單獨鋁佐劑組，效價水平可以達到200 000以上，但超高劑量CpG組（組8、13）下的效價水平反而比其他CpG劑量組要低.而在高劑量抗原下，超高劑量CpG組抗體效價水平又有所恢復（組18）.

圖1 免疫后小鼠血清中新冠病毒特異性抗體效價Fig.1 Titers of SARS－CoV－2 specific antibodies in mouse serum after immunization

3.3 不同配方新冠疫苗中和抗體效價

通過滅活疫苗體外細胞效力試驗來檢測血清中的中和抗體水平，各組幾何平均效價（GMT值）具體結果見表2.各組配方疫苗在D13天才產(chǎn)生了較低水平的中和抗體，然后逐漸增高.在D21天就已經(jīng)達到了較高的水平，同樣由于在D28就終止了免疫實驗，無法確定是否為最高.

表2 新冠滅活疫苗中和抗體效價Tab.2 Neutralization titer of COVID－19 inactivated vaccine

在D28天的結果中，低劑量抗原下，添加CpG后（組5、6、7、8），中和效價水平明顯高于單獨鋁佐劑組（組4），但不同劑量CpG組差別不大，效價均達到了600以上.中劑量抗原下，整體結果與低劑量抗原組相似，但水平略高，效價均達到了1000以上；但超高CpG劑量組（組13）水平反而低于其他組（組9、10、11、12）.而在高劑量抗原下，添加CpG后，中和抗體效價水平（組15、16、17、18）反而低于單獨鋁佐劑組（組14）.

4 討論

本文評價了一種雙佐劑新冠病毒滅活疫苗免疫原性，由于氫氧化鋁是常用的佐劑類型，因此實驗設計中固定了氫氧化鋁的濃度，只改變CpG的濃度來進行研究.而中和抗體效價檢測方法設計中，根據(jù)新冠病毒培養(yǎng)的特性，個別參數(shù)上稍做了調(diào)整，如本研究使用的病毒培養(yǎng)溫度為35°C，是由于此溫度下可降低Vero細胞的增值速度，利于新冠病毒的擴增；血清標本未做滅活處理，是想綜合評價免疫血清的效果，避免補體去除后，無法參與抗原核抗體結合過程，造成結果的偏頗；實驗中使用200TCID50的病毒進行實驗，而非一般使用100TCID50的病毒，原因是200TCID50的病毒可以保證100%的病變；觀察天數(shù)選擇上，發(fā)現(xiàn)第6天和第7天并無區(qū)別，因此選擇第6天為最終判定結果.

在檢測滅活疫苗特異性抗體效價時，本想選用滅活病毒原液作為包被抗原，但由于滅活病毒原液在制備過程中添加了人血白蛋白等原料，盡管在后期純化工序去除了大部分非病毒成分的雜蛋白，但仍有少量殘余.這些異源物質(zhì)在動物實驗中也會引起顯著的免疫應答效應，使得背景值過高，影響特異性抗體水平的判定.因此，只能通過檢測病毒S蛋白特異性抗體水平來評價疫苗的免疫原性，而S蛋白上的受體結合區(qū)（Receptor-Binding Domain，RBD）作為宿主細胞表面結合的關鍵靶點位于S1亞單位中［14-15］，且成本造價也遠低于重組S蛋白.實際上，市售的許多檢測試劑盒中，對于S蛋白含量測定所提供的標準品均為重組的S1亞基蛋白.因此，本實驗中最終選取了S1重組蛋白作為直接包被抗原來檢測病毒S蛋白特異性抗體.后期若能獲得完全不含人血白蛋白的純化滅活病毒抗原，則可進一步對結果進行優(yōu)化.

與單獨鋁佐劑疫苗組相比，添加CpG之后，小鼠血清中的新冠病毒特異性抗體效價以及中和抗體滴度都有明顯的提高，特別是在低、中抗原含量下就能達到很好的免疫效果，這對延長血清中抗體的持續(xù)時間，提高疫苗的有效保護時間都有很大的意義.但也可以看出，過量的CpG佐劑可能會抑制免疫效應，該結果與聶杰等的結果［16］類似，在相同抗原劑量下，低劑量CpG均表現(xiàn)出更優(yōu)的免疫效果；但zhang等的結果［17］則正好相反，高劑量CpG組獲得較低劑量組更為顯著的免疫增強效果.這可能與CpG的不同免疫方式有關，而且說明CpG與抗原之間有量效關系.后續(xù)需要進一步研究CpG佐劑與抗原之間相互作用的機理，進而闡明其抑制免疫效應的原因.

5 結論

通過以上實驗和分析，可以得到如下結論：

1）利用CpG佐劑的“增強效應”，可以使新冠病毒滅活抗原在較低的劑量下，就能產(chǎn)生較高水平的S蛋白特異性抗體效價及中和抗體效價.該特性在實際生產(chǎn)中可以有效降低單劑新冠抗原的使用量，提高單位產(chǎn)能.

2）通過不同配方組別中和抗體效價的分析，選擇出優(yōu)選新冠滅活疫苗的配方組，即新冠病毒抗原總蛋白含量2～4μg／mL，CpG含量為5～40μg／mL，鋁含量450μg／mL.此外，CpG佐劑的優(yōu)勢還表現(xiàn)在可同時誘導細胞免疫，提高疫苗的保護效果.因此，下一步計劃在大鼠模型上開展細胞免疫、安全性評價等一系列工作.