申萌萌，周雨玫，吳彥輝，趙秀萍，劉雁峰*

（1.北京中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院，北京 100700）

自噬是缺氧、營養(yǎng)缺乏、饑餓等因素誘導下，真核細胞在精細調(diào)控機制下將細胞內(nèi)不必要的或受損的成分清除，為細胞提供能量和營養(yǎng)的復雜過程[1]。自噬在維持子宮內(nèi)膜正常生理功能、參與病理疾病方面都有重要作用[2]。研究證實，子宮內(nèi)膜自噬在胚胎著床過程中必不可少，并與妊娠早期的子宮內(nèi)膜蛻膜化有關(guān)[3]。中醫(yī)藥作為重要的輔助治療手段能提高反復體外受精—胚胎移植失敗患者的子宮內(nèi)膜容受性，尤其是補腎活血中藥[4-5]。二補助育湯[6]是國家名老中醫(yī)肖承悰教授治療子宮內(nèi)膜容受性低的臨床經(jīng)驗方，前期研究表明，該方藥能糾正反復體外受精—胚胎移植失敗患者血栓前狀態(tài)、增加子宮內(nèi)膜血供等以改善子宮內(nèi)膜容受性，從而提高臨床妊娠率[7-8]。本實驗從自噬角度進一步探討二補助育湯的作用機制。

1 實驗材料

選擇SPF 級7 ～8 周齡ICR 雌性小鼠24 只，未交配過，體質(zhì)量（23±2） g；有生育能力的雄性小鼠，體質(zhì)量（25±2） g。由北京維通利華實驗技術(shù)有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2012-0001。二補助育方由骨碎補、巴戟天、桑寄生、續(xù)斷、補骨脂、川牛膝等組成，該方藥購置于北京中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院顆粒藥房（北京康仁堂藥業(yè)有限公司生產(chǎn)）。將顆粒加入0.5%羧甲基纖維素鈉中加熱溶解，制備成含生藥濃度3 g/mL 的濃縮液，置于4 ℃冰箱保存。補佳樂（戊酸雌二醇）購于北京中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院藥房，批號H20080108（DELPHARM Lille S.A.S.制藥），規(guī)格每片1 mg 。用0.5%羧甲基纖維素鈉制成濃度為0.03 mg/mL 的溶液。米非司酮購于北京中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院藥房，批號H10950003，規(guī)格每片25 mg，制備成濃度為0.68 mg/mL 的油劑。Anti-Beclin1（3495T；美國CST 公司）；Anti-LC3B（ab48394；英國abcam 公司）；2.5%戊二醛；透射電鏡（日本HITACHI H-7650）；垂直電泳槽（美國Bio-Rad 公司）；穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（美國Bio-Rad 公司）；半干轉(zhuǎn)電轉(zhuǎn)印儀（美國Bio-Rad 公司）。

2 實驗方法

2.1 分組 每日16:00 將雌雄小鼠以2:1 合籠，次日早晨發(fā)現(xiàn)陰栓記為妊娠第一天（pd1）。妊娠小鼠按照隨機數(shù)字表分為4 組，空白組、模型組、補佳樂組、二補助育湯組，每組6 只。

2.2 模型建立 pd4 早上9:00 空白組皮下注射麻油0.1 mL，余組注射米非司酮油劑0.1 mL。

2.3 給藥方法 pd1 起空白組和模型組每日灌服0.5%羧甲基纖維素鈉0.2 mL，余組予相應藥物溶液0.2 mL，連續(xù)5 d。

2.4 樣本采集 pd5 下午脫頸處死各組小鼠，計數(shù)胚胎著床數(shù)目；每組取2 只小鼠，將子宮組織投入2.5%戊二醛，備透射電鏡檢測；另4 只小鼠一角子宮組織投入4%多聚甲醛固定，備光鏡觀察；另一角子宮組織保存于-80 ℃，備WB 檢測。

2.5 觀察指標 1）胚胎著床位點數(shù)：于pd5 下午脫頸處死小鼠，記錄各組胚胎平均著床位點數(shù)。胚胎平均著床位點數(shù)=總胚泡數(shù)目/該組妊娠小鼠數(shù)目。2）光鏡下子宮內(nèi)膜形態(tài)學觀察：石蠟包埋小鼠子宮組織，切片（4 μm），分別用二甲苯、梯度乙醇脫蠟、脫水，蘇木素染色8 min；經(jīng)水洗、鹽酸乙醇化后用伊紅染色1 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，置于光鏡下觀察。3）透射電鏡觀察子宮內(nèi)膜細胞中自噬小體表達：0.1 mol/L 磷酸緩沖液共漂洗3 次（每次15 min），放置于新餓酸溶液中進行固定2 h；用0.1 mol/L 磷酸緩沖液進行沖洗3 次，用50%、70%、90%、100%乙醇逐級脫水（每次10 min），使用環(huán)氧樹脂包埋，然后定位，制成超薄切片，醋酸雙氧鈾染色；最后置于HITACH H-7650 透射電子顯微鏡下觀察。4）WB 方法檢測小鼠子宮內(nèi)膜組織中LC3-Ⅱ、Beclin-1 蛋白的表達：研磨樣本組織，提取蛋白，BCA 法測定蛋白定量。配制10% SDSPAGE 分離膠溶液；加入5%濃縮膠。上樣，每張膠上加入10 μL 的Marker。半干電轉(zhuǎn)移儀將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上。5% TBS-T 脫脂奶粉封閉，室溫振蕩60 min。一抗4 ℃封閉過夜，二抗37 ℃震蕩60 min。ECL 顯影。IPP 軟件分析目的條帶。

2.6 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 20.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，均數(shù)±標準差（±s）表示計量資料，用ONE-WAY ANOVA 進行組間比較，LSD 法兩兩比較。正態(tài)分布或方差齊性不滿足時，用非參數(shù)檢驗。

3 實驗結(jié)果

3.1 平均著床位點數(shù) 模型組平均著床位點數(shù)明顯低于空白組（P＜0.05）。補佳樂、二補助育湯組平均著床位點數(shù)較模型組增高，但無顯著差異（P＞0.05）。見表1。

表1 各組小鼠妊娠第5 天平均著床位點數(shù)（± s，n = 6）

表1 各組小鼠妊娠第5 天平均著床位點數(shù)（± s，n = 6）

注：Kruskal-Wallis H 檢驗，與空白組比較，# P ＜0.05

組別 平均著床位點數(shù)空白組 10.33±1.63模型組 3.83±2.79#補佳樂組 6.67±4.37中藥組 5.83±5.08

3.2 光鏡下子宮內(nèi)膜形態(tài) 空白組子宮內(nèi)膜間質(zhì)疏松，腺體和血管表達豐富。模型組子宮內(nèi)膜發(fā)育不良，間質(zhì)致密，腺體和血管少。補佳樂組和二補助育湯組子宮內(nèi)膜間質(zhì)中腺體和血管較模型組豐富（見圖1）。

圖1 光鏡下子宮內(nèi)膜形態(tài)（×200）

3.3 小鼠子宮內(nèi)膜細胞中自噬小體的表達 各組小鼠子宮內(nèi)膜細胞中均可見自噬小體表達?？瞻捉M表面蘑菇樣凸起的胞飲突表達豐富，細胞內(nèi)可見少量自噬小體；模型組部分細胞有破壞、壞死，細胞表面絨毛豐富，但胞飲突表達少，細胞內(nèi)自噬小體較其他組多。補佳樂組和二補助育湯組細胞內(nèi)自噬小體表達雖多于空白組，但較模型組少（見圖2）。

圖2 小鼠子宮內(nèi)膜細胞中自噬小體的表達

3.4 小鼠子宮內(nèi)膜中LC3-Ⅱ、Beclin-1 蛋白的表達 與空白組比較，模型組LC3-Ⅱ、Beclin-1 蛋白水平均低于空白組，其中LC3-Ⅱ較空白組有顯著差異（P＜0.05）。補佳樂組和二補助育湯組LC3-Ⅱ表達高于模型組，但無顯著差異（P＞0.05）。二補助育湯組Beclin-1蛋白水平高于模型組和補佳樂組（P＜0.05）（見圖3，表2）。

表2 小鼠子宮內(nèi)膜中LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表達（± s，n = 4）

表2 小鼠子宮內(nèi)膜中LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表達（± s，n = 4）

注：與空白組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05；與補佳樂組比較，▲P ＜0.05

組別 LC3-Ⅱ Beclin-1空白組 0.20±0.07 0.31±0.06模型組 0.07±0.05# 0.20±0.07補佳樂組 0.09±0.05 0.20±0.10二補助育湯組 0.17±0.08 0.34±0.08△▲

圖3 小鼠子宮內(nèi)膜中LC3-Ⅱ、Beclin-1 蛋白表達

4 討論

腎藏精，主生殖，胞絡者系于腎；胞脈上系于心，胞絡胞脈均與胞宮有關(guān)，但兩者非一脈。腎精心血通過胞絡、胞脈下達于胞宮，以維持其行經(jīng)、種子、育胎的功能。因此，肖承悰教授認為腎虛血瘀、心血不足、胞脈不暢是子宮內(nèi)膜容受性低的主要病機，故自擬“補腎氣、通胞脈”的二補助育湯以治之。全方由骨碎補、巴戟天、桑寄生、續(xù)斷、補骨脂、川牛膝等組成，方中補骨脂、骨碎補并稱“二補”。補骨脂有溫補脾腎、固精縮尿之功效；骨碎補具有補腎強骨、活血通絡之效，兩藥合用可補腎助孕、活血通脈，有“補腎、活絡”并用的寓意。巴戟天補腎益精，促進腎氣化生和腎陽鼓動。桑寄生、續(xù)斷為肖承悰常用藥對，二藥合用既可補肝腎又可通經(jīng)絡，使補而不滯，還可固胞安胎。川牛膝活血祛瘀、補肝腎。全方共奏補腎活血通脈之功，促進胞宮胞脈與他臟他經(jīng)間相互聯(lián)系，改善子宮內(nèi)膜微環(huán)境，有助于胚胎著床和發(fā)育。

自噬是真核生物降解、回收細胞內(nèi)生物大分子和受損細胞器的過程[9]，維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，被視為細胞的一種生存防御機制。適度的自噬可維持細胞穩(wěn)態(tài)，異常的自噬則與某些疾病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。研究證實，生理狀態(tài)下子宮內(nèi)膜自噬參與胚胎植入過程，自噬機制異常造成蛻膜化障礙和子宮內(nèi)膜容受性減低，進而影響胚胎著床[10]。

缺氧、激素等諸多因素誘導后，細胞收到自噬信號，Beclin-1 及其復合物在胞漿內(nèi)形成碗狀雙層膜狀結(jié)構(gòu)-隔離膜，是自噬早期階段的標志物之一；隔離膜不斷延伸，包裹細胞內(nèi)受損細胞器、蛋白質(zhì)等，LC3-Ⅱ附著在形成的球狀自噬小體膜上，與自噬小體表達一致，是公認的自噬標記物。本研究中，胚胎著床障礙模型由米非司酮制備，其與孕酮受體競爭性結(jié)合，抑制孕酮作用，造成子宮內(nèi)膜細胞自噬作用增強[11]，細胞中自噬小體表達增多，并有凋亡傾向，該結(jié)果與孫敬霞[12]研究結(jié)果一致。但模型組LC3-Ⅱ、Beclin-1 表達與自噬小體表達不一致，我們考慮與模型組細胞過度自噬誘發(fā)凋亡，出現(xiàn)細胞破壞、死亡有關(guān)。補佳樂組和二補助育湯組子宮內(nèi)膜細胞的自噬作用較模型組減弱，說明補佳樂和二補助育湯能調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜自噬，維持細胞穩(wěn)態(tài)，利于胚胎著床。

綜上所述，二補助育湯能調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜細胞自噬，維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，有利于胚胎著床。