張愛蓮 巴雪麗 王丹陽(yáng) 趙兵

（新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 新疆生物資源與基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830046）

口蹄疫（foot and mouth disease，F(xiàn)MD）是由口蹄疫病毒（foot and mouth disease virus，F(xiàn)MDV）引起的一種在偶蹄類動(dòng)物之間傳播的疾病，嚴(yán)重危害家畜健康，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。疫苗接種作為預(yù)防口蹄疫的有效手段被廣泛使用，并取得顯著成效。由于口蹄疫病毒滅活抗原免疫原性較弱，往往需要添加佐劑才能發(fā)揮作用［1-2］。目前，商品化口蹄疫疫苗中常用佐劑是ISA-206油乳劑，它是Thl細(xì)胞的激活劑，也能增強(qiáng)體液免疫應(yīng)答，但其副作用較大。盡管佐劑種類繁多，如常用佐劑（鋁鹽類佐劑，油水乳劑等）和新型佐劑（MF59，植物多糖等），但是用于口蹄疫疫苗的佐劑仍然有限，主要包括氫氧化鋁、司班、輕型礦物油等，均存在不同的缺陷，如免疫效果不理想或毒副作用大等［3-4］。因此，急需研制高效、低毒的口蹄疫疫苗新型佐劑，用于提高疫苗的免疫保護(hù)效果，這對(duì)于口蹄疫的防治具有積極意義。

中草藥在傳染病防治中具有廣泛的應(yīng)用前景，中草藥治療人類和動(dòng)物疾病有著悠久的歷史。在疫苗佐劑研究領(lǐng)域，國(guó)內(nèi)外研究者已經(jīng)從多種中草藥中提取多糖成分研究其佐劑效果，如人參多糖、黃芪多糖、茯苓多糖、淫羊藿多糖等，發(fā)現(xiàn)其對(duì)人類和動(dòng)物免疫機(jī)能有很好的促進(jìn)作用而成為新型的候選佐劑［5-7］。新疆荒漠肉蓯蓉（Cistanche deserticola Y.C.Ma）為列當(dāng)科植物，是常用的益補(bǔ)類中草藥，一直用作滋補(bǔ)食品被人們長(zhǎng)期食用。近些年，研究者們主要針對(duì)荒漠肉蓯蓉多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)和藥理活性方面開展了大量的研究工作，發(fā)現(xiàn)其有效成分主要包括多糖、苯乙醇苷類化合物、生物堿等，其中多糖含量較高，可以調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，具有抗氧化、抗衰老等作用［8-9］。前期研究發(fā)現(xiàn)荒漠肉蓯蓉粗多糖聯(lián)合OVA免疫小鼠后顯著增強(qiáng)了OVA特異性抗體水平，與流感疫苗配伍可以提高流感疫苗的抗體水平［10-11］。鑒于此，本研究以荒漠肉蓯蓉粗多糖作為口蹄疫滅活疫苗的候選佐劑，篩選具有顯著免疫增強(qiáng)效果、副反應(yīng)小的水溶佐劑，使荒漠肉蓯蓉粗多糖可以有效的應(yīng)用于口蹄疫疫苗新型佐劑的研制。

本研究以荒漠肉蓯蓉粗多糖（Cistanche deserticola crude polysaccharide，CDCP）配伍FMDVAg制備疫苗，肌肉途徑免疫ICR小鼠，通過(guò)檢測(cè)免疫后對(duì)小鼠體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)的影響，并觀察其安全性，為高效、安全的口蹄疫疫苗新型佐劑的研制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF雌性ICR小鼠（20-25 g）購(gòu)買于新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（合格證號(hào)SCXK（新）2016-0003），小鼠喂養(yǎng)5 d后進(jìn)行動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在新疆生物資源基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房?jī)?nèi)進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)獲得新疆大學(xué)新疆生物資源基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，動(dòng)物倫理批件編號(hào)為： BRGE-AE001。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)材料及試劑 CDCP為實(shí)驗(yàn)室制備（多糖含量為60%）［10］，用0.9% NaCl溶解，配制粗多糖母液濃度為20 mg/mL的溶液，過(guò)濾除菌備用。FMDV-Ag，ISA-206油佐劑來(lái)自天康生物股份有限公司。RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清為Hyclone公司產(chǎn)品。山羊抗鼠的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記IgG-HRP購(gòu)自Southbiotech公司；刀豆蛋白A（ConA）、脂多糖（LPS）和N-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）購(gòu)自Sigma公司；噻唑藍(lán)（MTT）購(gòu)自Amresco公司。流式檢測(cè)用抗體PECD3、APC-CD4、APC-CD8、FITC-CD8、PE-CD44購(gòu)自BD公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及免疫 將CDCP溶液、FMDV-Ag、ISA-206油佐劑按照一定的比例混勻，制備成疫苗。雌性ICR小鼠隨機(jī)分為4組，每組6只，具體分組如下：0.9% NaCl對(duì)照組、FMDV-Ag組（146S，0.3 μg/每只小鼠，無(wú)佐劑）、FMDV-Ag/CDCP組（146S，0.3 μg/每只小鼠，CDCP 400 μg）、FMDV/ISA-206組（146S，0.3 μg/每只小鼠，ISA-206油佐劑）。肌肉免疫，100 μL/只，于0 d初次免疫和14 d加強(qiáng)免疫。采用同樣的免疫策略免疫小鼠后進(jìn)行淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，T細(xì)胞亞群檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 IgG抗體水平檢測(cè) 在初免后14 d、21 d、28 d小鼠眼眶采血制備血清，間接酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)抗體水平。方法參考文獻(xiàn)［12］，簡(jiǎn)述如下：包被合適濃度的FMDV-Ag到96孔板中，4℃放置12 h。加入5%脫脂奶粉封閉1 h。接著，加入稀釋的小鼠免疫后血清，37℃ 孵育1 h。加入稀釋的IgGHPR抗體，37℃孵育1 h。加入TMB 底物溶液，顯色15-20 min，加入H2SO4溶液終止，酶標(biāo)儀上檢測(cè)OD450的值。

1.2.3 脾臟淋巴細(xì)胞增殖檢測(cè) 加強(qiáng)免疫后7 d，制備脾臟單細(xì)胞懸液，裂解紅細(xì)胞，洗滌并離心收集細(xì)胞。將細(xì)胞計(jì)數(shù)后，調(diào)整濃度為2×106/mL的單細(xì)胞懸液加入到細(xì)胞培養(yǎng)板中，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，再分別加入合適濃度的FMDV-Ag、ConA、LPS刺激細(xì)胞，37℃放置48 h，加入MTT繼續(xù)培養(yǎng)3-4 h后，棄上清，加入DMSO溶解沉淀，在酶標(biāo)儀檢測(cè)OD490的值。計(jì)算每組刺激指數(shù)（SI）：SI=（OD各刺激孔-OD培養(yǎng)基）/（OD未刺激孔- OD培養(yǎng)基）。

1.2.4 T細(xì)胞亞群檢測(cè) 流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行表面染色，檢測(cè)免疫后小鼠脾臟T細(xì)胞亞群的表達(dá)水平。如上1.2.3所述制備脾單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL，用含0.5% 胎牛血清的磷酸緩沖液洗滌細(xì)胞，離心后棄上清。細(xì)胞分別用流式抗體PECD3、APC-CD4、APC-CD8、FITC-CD8、PE-CD44進(jìn)行避光染色30 min，加入含0.5%胎牛血清的磷酸緩沖液終止染色，離心棄上清加入300 μL磷酸緩沖液混勻細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，運(yùn)用FlowJo 7.6處理流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果，Graph Pad Prism 5.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。不同實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)用one-way ANOVA分析后，運(yùn)用Tukey’s Multiple-Comparison Test分析不同組數(shù)據(jù)之間的差異性，“*”表示兩組數(shù)據(jù)之間差異顯著（P＜0.05），“**”表示兩組數(shù)據(jù)之間差異極顯著（P＜0.01）。

2 結(jié)果

2.1 CDCP對(duì)血清中FMDV特異性抗體水平的影響

初疫后14 d、21 d、28 d血清IgG的水平呈現(xiàn)逐漸增強(qiáng)的趨勢(shì)（圖1）。初免后14 d和21 d，F(xiàn)MDVAg/CDCP組抗體水平顯著高于FMDV-Ag無(wú)佐劑組（P＜0.05），與FMDV組無(wú)顯著差異（P＞0.05）。初免后28 d，與FMDV-Ag無(wú)佐劑相比，F(xiàn)MDV-Ag/CDCP的IgG抗體水平顯著提高（P＜0.05），但是極顯著低于FMDV/ISA-206組（P＜0.01）。FMDV-Ag無(wú)佐劑組的抗體水平與0.9% NaCl對(duì)照組顯著差異（P＜0.05）。

圖1 間接ELISA檢測(cè)血清中FMDV特異性抗體水平Fig.1 Detection on FMDV-specific antibody by indirect ELISA

2.2 CDCP對(duì)脾臟淋巴細(xì)胞的增殖作用

初免后21 d，MTT法檢測(cè)CDCP對(duì)脾淋巴細(xì)胞的增殖作用。如圖2所示，F(xiàn)MDV-Ag體外刺激脾淋巴細(xì)胞后，F(xiàn)MDV-Ag/CDCP組的淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)顯著高于FMDV-Ag無(wú)佐劑組（P＜0.05），且與FMDV/ISA-206組無(wú)顯著差異（P＞0.05）。ConA、LPS刺激后，可顯著增強(qiáng)脾臟淋巴細(xì)胞增殖（P＜0.05）。

圖2 CDCP對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的影響Fig. 2 Effect of CDCP on splenocyte proliferation

2.3 CDCP對(duì)CD4+和CD8+ T細(xì)胞表達(dá)的影響

初免后21 d，檢測(cè)CDCP配伍FMDV-Ag對(duì)小鼠脾臟中CD4+和CD8+T細(xì)胞的影響。結(jié)果如圖3-AD，F(xiàn)MDV-Ag/CDCP組CD3+CD4+和CD3+CD8+T細(xì)胞亞群的比例顯著高于FMDV-Ag無(wú)佐劑組（P＜0.05），且與FMDV/ISA-206組之間差異不顯著（P＞0.05）。FMDV-Ag無(wú)佐劑組沒有增強(qiáng)CD4+和CD8+T細(xì)胞表達(dá)。

圖3 CDCP對(duì)CD4+和CD8+ T細(xì)胞亞群的影響Fig.3 Effects of CDCP on CD4+ and CD8+ T cell subsets

2.4 CDCP對(duì)CD4+CD44+和CD8+CD44+效應(yīng)T細(xì)胞亞群的影響

為觀察CDCP對(duì)效應(yīng)T細(xì)胞的影響，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)免疫后小鼠脾臟細(xì)胞中CD4+CD44+和CD8+CD44+的表達(dá)情況。結(jié)果如圖4-A-D，F(xiàn)MDVAg/CDCP組CD4+CD44+和CD8+CD44+的 百 分 比 顯著高于FMDV-Ag無(wú)佐劑組（P＜0.05），且與FMDV/ISA-206組之間差異不顯著（P＞0.05）。

圖4 CDCP對(duì)CD4+ CD44+、CD8+ CD44+效應(yīng)T細(xì)胞的影響Fig.4 Effects of CDCP on CD4+ CD44+ and CD8+ CD44+ effector T cell

2.5 CDCP對(duì)小鼠生長(zhǎng)的影響

CDCP通過(guò)肌肉途徑免疫動(dòng)物后，整個(gè)免疫期間觀察小鼠生長(zhǎng)情況并每周稱量體重，觀察注射部位肉芽腫情況（表1）。免疫后小鼠沒有脫毛、拒食等現(xiàn)象，免疫后14 d、21 d、28 d每組小鼠體重正常增長(zhǎng)，各組間體重沒有顯著變化（P＞0.05）。FMDVAg/CDCP組小鼠注射部位未見肉芽腫，含有ISA 206油佐劑的FMDV疫苗組小鼠注射部位有肉芽腫。

表1 FMDV/CDCP免疫后小鼠體重變化Table 1 Changes in body weight of mice immunized with FMDV/CDCP

3 討論

佐劑長(zhǎng)期以來(lái)用于各類疫苗中，可以輔佐疫苗發(fā)揮免疫促進(jìn)作用，降低疫苗用量，對(duì)于傳染病的防治和流行起到了非常重要的作用［3］。隨著新型疫苗的發(fā)展，不論是獸用疫苗研究領(lǐng)域還是人用疫苗研究領(lǐng)域，對(duì)疫苗佐劑數(shù)量上和質(zhì)量上的要求越來(lái)越高了。理想的新型佐劑應(yīng)該是對(duì)機(jī)體的細(xì)胞或體液免疫均有有效的激發(fā)作用、作用持久穩(wěn)定、免疫次數(shù)減少、副作用小，同時(shí)便于生產(chǎn)和易于注射［13］。在FMDV滅活疫苗中，通常通過(guò)添加油佐劑發(fā)揮疫苗的免疫增強(qiáng)作用，但是存在免疫應(yīng)激大等缺點(diǎn)。水佐劑與油佐劑相比使用簡(jiǎn)單，可以與疫苗抗原以任意比例互溶，無(wú)須乳化，容易注射，因此水佐劑在FMDV疫苗中具有良好的應(yīng)用前景。

中草藥多糖有良好免疫調(diào)節(jié)作用，加之其在安全性、多效性、無(wú)依賴性等方面的優(yōu)勢(shì)，成為新型疫苗佐劑研究的一個(gè)熱點(diǎn)［14］。在FMDV疫苗佐劑研究領(lǐng)域，一些中草藥多糖被用于新型佐劑的研究中，如黃芪多糖作為FMDV疫苗的佐劑，通過(guò)口服途徑免疫能夠增強(qiáng)體液和細(xì)胞免疫，低劑量抑制樹突狀細(xì)胞的成熟，高劑量可以促進(jìn)其成熟。研究者們也用白術(shù)多糖、杜仲多糖作為FMDV疫苗的佐劑探討了其免疫增強(qiáng)的作用［15-17］。由于不同中草藥的活性成分含量有很大的差別，從具有免疫活性的中草藥中進(jìn)行廣泛篩選，尋找合適的佐劑對(duì)于疾病防治和人類健康意義重大，也是疫苗學(xué)領(lǐng)域中的研究熱點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)選用CDCP作為FMDV疫苗的候選佐劑，進(jìn)行了佐劑效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究。傳染病的防治主要依賴B淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)和T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)［18-20］。由于FMDV疫苗在生產(chǎn)實(shí)際采用的是肌肉免疫方式，為此，在實(shí)驗(yàn)中選用肌肉途徑免疫小鼠，通過(guò)評(píng)價(jià)CDCP對(duì)抗體產(chǎn)生和T細(xì)胞亞群的影響來(lái)評(píng)價(jià)其免疫增強(qiáng)作用，并進(jìn)行安全性的初步觀察。研究結(jié)果表明，免疫后14 d和21 d，肉蓯蓉粗多糖可以增強(qiáng)FMDV特異性的抗體水平，且作用和ISA-206佐劑水平?jīng)]有顯著差異；在免疫后28 d的抗體水平低于ISA-206油佐劑，這說(shuō)明CDCP在免疫后的一定時(shí)間內(nèi)可以增強(qiáng)體液免疫水平。淋巴細(xì)胞增殖率與刺激指數(shù)的高低呈正相關(guān)，在MTT實(shí)驗(yàn)中，CDCP可促進(jìn)FMDV抗原、ConA和LPS刺激的淋巴細(xì)胞增殖。在T細(xì)胞亞群實(shí)驗(yàn)中，CDCP不僅可以提高CD4+和CD8+T細(xì)胞的表達(dá)，也可以增強(qiáng)CD4+CD44+和CD8+CD44+效應(yīng)T細(xì)胞的水平，且與ISA-206佐劑組沒有顯著差異；在安全性實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)含有ISA-206的疫苗組注射小鼠后，在注射部位有肉芽腫，而含有CDCP水佐劑的疫苗組沒有發(fā)現(xiàn)肉芽腫，初步表明了CDCP有良好的安全性，進(jìn)一步的安全性需要開展相關(guān)實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

4 結(jié)論

CPCD不僅增強(qiáng)了體液免疫反應(yīng)，還可以提高淋巴細(xì)胞的增殖水平，促進(jìn)CD4+和CD8+T細(xì)胞亞群的水平，活化效應(yīng)T細(xì)胞，在注射后沒有發(fā)現(xiàn)小鼠注射部位的肉芽腫，小鼠正常生長(zhǎng)且沒有異常行為。這些研究結(jié)果為進(jìn)一步開展CDCP作為FMDV疫苗的新型佐劑研究提供了基礎(chǔ)，也為多糖佐劑在其他疫苗中的應(yīng)用提供了有益的參考。