劉少華 趙希勝，2 楊晴 楊長(zhǎng)青 潘旭浩 張建會(huì) 楊?lèi)?ài)國(guó) 李依婷

（1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266100；2. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，成都 611130；3. 四川省煙草科學(xué)研究所，成都 610041）

在植物體內(nèi)，萜類(lèi)物質(zhì)主要通過(guò)兩條相對(duì)獨(dú)立的代謝途徑合成，即位于細(xì)胞質(zhì)中的甲羥戊酸（mevalonate pathway，MVA）途徑和位于質(zhì)體中的甲基赤蘚醇4-磷酸（methylerythritol-4-phosphate pathway，MEP）途徑。萜烯合酶（terpene synthase，TPS）是催化形成萜類(lèi)骨架的關(guān)鍵酶［7］。根據(jù)催化機(jī)理和形成產(chǎn)物的不同，萜烯合酶被分為Ⅰ類(lèi)（ClassⅠ）和Ⅱ類(lèi)（ClassⅡ）［8-9］。其中單萜合酶屬于Ⅰ類(lèi)萜類(lèi)合酶，包含保守的DDxxD和NSE/DTE結(jié)構(gòu)域，其中的氨基酸殘基通過(guò)結(jié)合二價(jià)金屬離子來(lái)促進(jìn)異戊二烯焦磷酸基團(tuán)的電離［10-11］。擬南芥中有多個(gè)萜類(lèi)合酶參與單萜和倍半萜類(lèi)化合物的生物合成［12-14］，其產(chǎn)物對(duì)吸引昆蟲(chóng)授粉及在植物抵御病原體的入侵中有重要作用［15］。葡萄中已有多個(gè)單萜合酶和倍半萜合酶被克隆和功能鑒定，其中包括α-松油醇合成酶，對(duì)葡萄繁殖和品種改良具有重要意義［16］。除此之外，萜烯合酶還參與植物對(duì)各種生物脅迫和非生物脅迫的響應(yīng)，如龐強(qiáng)強(qiáng)等［17］對(duì)大白菜高溫脅迫前后不同組織和持續(xù)高溫脅迫下葉片的表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)大部分BrTPS可對(duì)高溫脅迫產(chǎn)生響應(yīng)；水稻松油烯合酶OsTPS24參與水稻茉莉酸誘導(dǎo)引發(fā)對(duì)白葉枯病菌的抗性［18］；OsTPS18參與合成的橙花叔醇可明顯抑制白葉枯病菌的生長(zhǎng)［19］等。

茄科植物煙草的次生代謝產(chǎn)物豐富，遺傳轉(zhuǎn)化和表達(dá)體系完善，是研究植物次生代謝的理想植物。目前，煙草萜類(lèi)物質(zhì)生物合成途徑上游MVA和MEP途徑中的關(guān)鍵合成酶基因已被相繼報(bào)道，如1-脫氧木糖-5-磷酸合酶（1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase，DXS）、3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶（3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase，HMGR）、牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合酶（geranylgeranyl pyrophosphatesynthase，GGPPS）、法尼基焦磷酸合酶（farnesyl diphosphate synthase，F(xiàn)PPS）等，但是對(duì)合成途徑下游的關(guān)鍵萜烯合酶基因的研究鮮有報(bào)道。在普通栽培煙草中，共有68個(gè)TPS基因家族成員［20］，但目前已鑒定并明確功能的寥寥無(wú)幾。對(duì)煙草萜烯合酶基因的分離鑒定不僅可以完善煙草萜類(lèi)物質(zhì)生物合成途徑，還能夠?yàn)楫愒春铣蔁煵葺祁?lèi)天然產(chǎn)物提供基礎(chǔ)元件。

本研究從煙草中克隆了一個(gè)定位在質(zhì)體中的萜烯合酶基因NtTPS2，利用qRT-PCR分析其時(shí)空表達(dá)模式和對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)，并通過(guò)大腸桿菌代謝工程鑒定NtTPS2的生化功能，為煙草萜類(lèi)天然產(chǎn)物的生物合成機(jī)理研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用材料普通栽培煙草品種K326（Nicotiana tabacum L.）由國(guó)家煙草種質(zhì)資源中期庫(kù)提供。載體質(zhì)粒pYJM26與pYJM14由中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所饋贈(zèng)；Plant Total RNA Kit購(gòu)自北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司；Transcript Green One-Step qRT-PCR Supermix、2×Phanta Max Master Mix和2×ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有 限 公 司；pEASY-Blunt Zero Cloning kit、DH5α Chemically Competent Cell、BL21（DE3）Chemically Competent Cell、EasyPure Quick Gel Extraction kit、DNA凝膠試劑盒，購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；試驗(yàn)所用內(nèi)切酶與連接酶均購(gòu)自NEB（北京）有限公司。

LB培養(yǎng)基（g/L）：10.0 g蛋白胨、5.0 g酵母粉、10.0 g NaCl，pH 7.0，用于大腸桿菌的培養(yǎng)。

發(fā) 酵 培 養(yǎng) 基（g/L）：5.0 g酵 母 浸 粉，1.0 g NH4Cl、15.2 g Na2HPO4·12H2O、3.0 g KH2PO4、0.5 g NaCl、0.48 g MgSO4·7H2O、20 g 葡萄糖，用于大腸桿菌的發(fā)酵。

1.2 方法

1.2.1 NtTPS2的克隆及序列分析 萜烯合酶在植物抗逆境脅迫過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。通過(guò)對(duì)干旱和低溫脅迫處理的煙草轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)的分析篩選，獲得NtTPS2轉(zhuǎn)錄本序列并設(shè)計(jì)特異性引物NtTPS2-F和NtTPS2-R（表1）。使 用Plant Total RNA Kit提取煙草葉片總RNA，用超微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度，利用Transcript Green One-Step qRT-PCR Supermix試劑盒反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA作為基因克隆的模板。使用引物NtTPS2-F和NtTPS2-R，以煙草cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為cDNA 2 μL、2×Phanta Max Master Mix 25 μL、NtTPS2-F和NtTPS2-R引 物 各2.5 μL，補(bǔ)充ddH2O 18 μL。反應(yīng)程序?yàn)?4℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，35個(gè) 循 環(huán)；72℃ 5 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)、純化后，連入pEASY-Blunt Zero Cloning kit載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化子用含有卡那霉素（50 mg/L）的LB固體培養(yǎng)基進(jìn)行篩選培養(yǎng)12 h，挑取單克隆進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，陽(yáng)性克隆進(jìn)行雙向測(cè)序，獲得含有NtTPS2序列的陽(yáng)性質(zhì)粒Blunt-NtTPS2。

對(duì)照組患者單獨(dú)采用胺碘酮進(jìn)行治療，首次劑量為150 mg，溶于20 mL0.9%氯化鈉溶液中，10 min內(nèi)靜脈滴注完成，間隔15 min后可重復(fù)用藥。根據(jù)患者病情變化，可適當(dāng)減少給藥劑量。靜脈給藥停止后，改口服胺碘酮，每天600 mg，聯(lián)用7d后，改藥量為每天400 mg，同樣服藥7 d；觀察組患者在此基礎(chǔ)上，聯(lián)合服用倍他樂(lè)克緩釋片，口服，每次11.875 mg，每天服藥1次，觀察無(wú)明顯不良反應(yīng)后，則每2周增加藥量，達(dá)到目標(biāo)劑量后可長(zhǎng)期口服。

利 用ORF finder（http：//www.bioinformatics.org/sms2/orf_find.html）軟件分析NtTPS2開(kāi)放閱讀框及氨基酸序列；利用在線程序PSORT II Prediction（https：//www.genscript.com/psort.html）預(yù) 測(cè)NtTPS2蛋白的亞細(xì)胞定位；使用InterProScan（https：//www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence/）軟件對(duì)NtTPS2蛋白保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，利用MEGA7軟件鄰接（NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，Bootstrap值設(shè)定為1 000。1.2.2 NtTPS2的組織與時(shí)空表達(dá)模式 分別提取盛花期煙草根、莖、上部葉、中部葉、下部葉、花瓣、雄蕊和雌蕊的總RNA，反轉(zhuǎn)錄后，進(jìn)行qRT-PCR分析。根據(jù)NtTPS2序列設(shè)計(jì)特異性引物NtTPS2-qF和NtTPS2-qR（表1），以煙草Actin為內(nèi)參，利用2×ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix進(jìn)行PCR反應(yīng)。試驗(yàn)設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，2次技術(shù)重復(fù)。采用2-△△CT方法計(jì)算NtTPS2的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 不同非生物脅迫處理下NtTPS2的表達(dá)分析 將K326種子用75%酒精消毒20-30 s，滅菌ddH2O清洗1遍，用15%過(guò)氧化氫溶液浸泡8-10 min，滅菌ddH2O清洗3遍后，播種于1/2 MS固體培養(yǎng)基中。在光照培養(yǎng)箱（16 h光照/8 h黑暗）中培養(yǎng)至兩葉一心，移至1/2 MS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)4周后，分別移入200 mmol/L NaCl、1.0% PEG、4℃、10 μmol/L ABA進(jìn)行處理。其中，NaCl處理分別在0、1、3、6、12和24 h取樣；4℃處理分別在0、3、6和12 h以及1、3和7 d取樣；PEG和ABA處理分別在為0、6、12、24、48和72 h取樣，每個(gè)處理3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。每個(gè)樣品取樣完成后液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 NtTPS2的亞細(xì)胞定位 根據(jù)NtTPS2的全長(zhǎng)CDS序列（去掉終止密碼子）設(shè)計(jì)帶有Bsa I酶切位點(diǎn)的引物NtTPS2∷gfp-F和NtTPS2∷gfp-R（表1），以Blunt-NtTPS2為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增、回收。利用Bsa I對(duì)pBWA（V）HS-GLosgfp表達(dá)載體和NtTPS2回收片段進(jìn)行酶切，用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，單克隆經(jīng)PCR及測(cè)序驗(yàn)證，獲得NtTPS2融合GFP的重組質(zhì)粒pBWA（V）HS-TPS2-GLosgfp。將重組質(zhì)粒和對(duì)照空載質(zhì)粒pBWA（V）HS-Glosgfp分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101。陽(yáng)性農(nóng)桿菌菌株經(jīng)活化和擴(kuò)大培養(yǎng)后，收集菌體重懸于煙草注射緩沖液（0.2 mmol/L乙酰丁香酮、10 mmol/L MES和10 mmol/L MgCl2）中，調(diào)整OD600值為0.7-1.0。重懸液于室溫靜置2-4 h后，用1 mL注射器在本氏煙（Nicotiana bentamiana）中部葉片背面注射。注射后的煙草置于28℃溫室中培養(yǎng)2 d后，在LEICA TCS SP8激光共聚焦顯微鏡下觀察侵染的葉片，確定熒光融合蛋白的定位。

表1 NtTPS2基因克隆、載體構(gòu)建及qPCR引物Table 1 Primers for NtTPS2 gene cloning，vector construction and qPCR

1.2.5 NtTPS2工程大腸桿菌構(gòu)建和發(fā)酵 將NtTPS2連接到pYJM26質(zhì)粒的BglII和XhoI雙酶切位點(diǎn)之間，得到重組質(zhì)粒NtTPS2-pYJM26。pYJM26質(zhì)粒，即pACY-mvaE-mvaS-GPPS2質(zhì)粒，攜帶來(lái)源于糞腸球菌（Enterococcus faecalis）的乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶基因/羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因（mvaE，GenBank No. AAG02438）、3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶基因（mvaS，GenBank No. AAG02439），以及來(lái)源于北美冷杉（Abies grandis）的牻牛兒基焦磷酸合成酶基因（GPPS2，GenBank No. AF513112.1）的pACYCDuet-1。參 考Yang等［21］的 方 法 構(gòu) 建pYJM26質(zhì)粒載體。以含有NtTPS2 CDS序列的Blunt-NtTPS2質(zhì)粒為模板，采用NtTPS2-pYJM26-F和NtTPS2-pYJM26-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增和基因片段回收。將所得NtTPS2片段與pYJM26質(zhì)粒分別用Bgl II和Xho I進(jìn)行雙酶切，將載體與外源片段進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒NtTPS2-pYJM26。

將質(zhì)粒NtTPS2-pYJM26和質(zhì)粒pYJM14共同轉(zhuǎn)化E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，37℃過(guò)夜培養(yǎng)后，得到合成香葉醇的大腸桿菌工程菌。pYJM14質(zhì)粒，即pTrc-low質(zhì)粒，攜帶來(lái)源于釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的甲羥戊酸激酶基因（ERG12，GenBank No. NM_001182715.1）、甲羥戊酸-5-磷酸激酶基因（ERG8，GenBank NO. NM_001182727.1）、甲羥戊酸-5-二磷酸脫羧酶基因（ERG19，GenBank NO. X97557.1）、異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶基因（IDI1，GenBank NO. NM_001183931.1）的pTrcHis2B。參考Yang等［22］的方法構(gòu)建pYJM14質(zhì)粒載體。

挑取平板上的單克隆接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)8 h后，將一級(jí)種子液按1∶50接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD600為0.6時(shí)添加終濃度為0.3 mmol/L的IPTG，30℃誘導(dǎo)表達(dá)繼續(xù)發(fā)酵48 h。

1.2.6 分析檢測(cè) 取發(fā)酵液2 mL，12 000 r/min離心1 min，取上清1 mL加入等體積乙酸乙酯于渦旋振蕩器上混勻5 min，然后靜置10 min，取上層有機(jī)相進(jìn)行過(guò)濾后，使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS，島津TQ8050）檢測(cè)發(fā)酵產(chǎn)物中天然成分的含量。色譜柱為HP-INNOWAX毛細(xì)管柱（30 m × 0.25 mm× 0.25 μm），柱室溫度50℃起步以10℃/min的速度升溫至250℃，保溫5 min，氣化室和檢測(cè)室溫度均為250℃。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，由新復(fù)極差法分析均值差異的顯著性。

2 結(jié)果

2.1 NtTPS2的克隆及生物信息學(xué)分析

以煙草葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，利用NtTPS2-F和NtTPS2-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得全長(zhǎng)為1 854 bp片段，命名為NtTPS2（圖1）。NtTPS2編碼617個(gè)氨基酸，其中強(qiáng)酸性氨基酸81個(gè)，堿性氨基酸75個(gè)，pI為6.35，蛋白分子量為71.73 kD。利用InterProScan在線軟件對(duì)其氨基酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明，NtTPS2具有2個(gè)萜烯合成酶基因家族的保守結(jié)構(gòu)域。其中第68-255位氨基酸為萜類(lèi)合酶N末端區(qū)域；第282-606為萜類(lèi)合酶金屬離子結(jié)合結(jié)構(gòu)域（圖2）。

圖1 NtTPS2的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of NtTPS2

圖2 NtTPS2蛋白的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig.2 Prediction of the conserved domain of NtTPS2 protein

通過(guò)在線程序PSORT II Prediction對(duì)NtTPS2蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示NtTPS2在葉綠體、線粒體和質(zhì)體中定位的概率分別為57.14%、28.57%和14.29%，因此，該蛋白可能是位于葉綠體中。

利用GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)蛋白比對(duì)程序BLASTP對(duì)NtTPS2進(jìn)行比對(duì)分析，選擇與NtTPS2相似度高的萜烯合酶基因，利用DNAMAN軟件進(jìn)行多序列比對(duì)分析，結(jié)果（圖3）表明，NtTPS2與已知的萜烯合酶基因蛋白序列具有較高的相似性，且含有萜類(lèi)合酶催化活性位點(diǎn)“DDxxD”以及NSE/DTE功能域（N，D）D（L，I，V）X（S，T）XXXE。

圖3 NtTPS2與其他植物萜烯合酶基因的多序列比對(duì)Fig.3 Multiple sequence alignment of NtTPS2 and other plant terpene synthase genes

為分析NtTPS2與其他物種萜烯合酶基因間親緣關(guān)系，通過(guò)MEGA7等軟件對(duì)NtTPS2進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)分析。結(jié)果（圖4）表明，NtTPS2與矮牽牛、檸檬及柑橘等物種中的單萜合酶基因聚為同一簇，其中與矮牽牛的親緣關(guān)系最近，同源性為69.57%，與倍半萜和二萜合酶基因的遺傳距離較遠(yuǎn)，推測(cè)其可能為一個(gè)單萜合成酶。

圖4 NtTPS2與其他物種萜烯合酶系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)分析Fig.4 Phylogenetic tree analysis of NtTPS2 and terpene synthase of other species

2.2 NtTPS2亞細(xì)胞定位

基因的亞細(xì)胞定位對(duì)研究該基因編碼的蛋白及行使功能的場(chǎng)所至關(guān)重要。將含有NtTPS2融合GFP的植物表達(dá)載體和僅表達(dá)GFP的對(duì)照載體分別在本式煙葉片中瞬時(shí)表達(dá)，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)NtTPS2編碼的蛋白產(chǎn)物定位在葉綠體中（圖5），這一結(jié)果與NtTPS2蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果一致。

圖5 NtTPS2的亞細(xì)胞定位Fig.5 Subcellular localization of NtTPS2

2.3 NtTPS2的組織表達(dá)分析

利用qRT-PCR技術(shù)分析NtTPS2在煙草盛花期各個(gè)組織中的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果表明，NtTPS2在煙草各個(gè)組織部位均有表達(dá)，在根部和雌蕊中的表達(dá)量顯著高于莖、葉、花瓣和雄蕊（圖6）。

圖6 NtTPS2的組織表達(dá)模式分析Fig.6 Tissue expression pattern analysis of NtTPS2

2.4 NtTPS2對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)

萜類(lèi)化合物在植物抗逆脅迫中發(fā)揮著重要的作用。為明確NtTPS2是否參與了煙草抗逆脅迫過(guò)程，對(duì)普通煙草K326進(jìn)行了不同逆境脅迫處理，通過(guò)qRT-PCR技術(shù)對(duì)NtTPS2的表達(dá)模式進(jìn)行分析（圖7），發(fā)現(xiàn)在200 mmol/L NaCl處理下，NtTPS2表達(dá)量在6 h內(nèi)迅速上調(diào)，隨后降低，但12 h時(shí)表達(dá)量仍顯著高于對(duì)照（0 h）；4℃低溫處理下，NtTPS2表達(dá)量在6和12 h被快速誘導(dǎo)，隨后急劇下降，7 d后已顯著低于對(duì)照（0 h）；10 μmol/L ABA處理下，NtTPS2表達(dá)量在6 h內(nèi)逐漸下調(diào)，隨后表達(dá)豐度上升，整個(gè)處理過(guò)程中表達(dá)量始終顯著低于對(duì)照；用1% PEG模擬干旱脅迫，NtTPS2表達(dá)量在48 h內(nèi)逐漸上調(diào)，48 h時(shí)出現(xiàn)峰值，隨后下調(diào)，到72 h時(shí)表達(dá)豐度與對(duì)照相比沒(méi)有顯著性差異。

圖7 不同逆境脅迫下NtTPS2的表達(dá)模式分析Fig.7 Expression analysis of NtTPS2 under different stresses

2.5 NtTPS2的生化功能鑒定

以大腸桿菌BL21（DE3）為宿主菌，通過(guò)代謝產(chǎn)物分析，鑒定NtTPS2的生化功能。工程菌株經(jīng)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)后，用等體積乙酸乙酯萃取、離心，取上層有機(jī)相過(guò)濾后用GC-MS檢測(cè)發(fā)酵產(chǎn)物。對(duì)GC-MS總離子色譜圖的分析結(jié)果表明，與對(duì)照菌株相比，表達(dá)了NtTPS2的工程菌株在5.5和5.8 min產(chǎn)生了2種新化合物，譜庫(kù)檢索表明可能是香葉醇和橙花醇。進(jìn)一步利用香葉醇、橙花醇的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比對(duì)，二者的保留時(shí)間和質(zhì)譜數(shù)據(jù)均一致，表明NtTPS2能夠以GPP為底物生成香葉醇和橙花醇（圖8）。

3 討論

植物單萜合酶催化底物GPP釋放焦磷酸基團(tuán)，并形成結(jié)構(gòu)不同的單萜類(lèi)化合物。本研究從煙草中克隆獲得了一個(gè)萜烯合酶基因NtTPS2，其包含一個(gè)完整的ORF，長(zhǎng)度為1 854 bp，編碼617個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。序列分析表明，NtTPS2與其他植物的萜類(lèi)合酶蛋白具有較高的保守性，都含有保守的DDxxD和NSE/DTE結(jié)構(gòu)域，該區(qū)域能與金屬離子結(jié)合，催化萜類(lèi)化合物的生物合成，屬于典型的I類(lèi)萜烯合酶［23］。對(duì)NtTPS2亞細(xì)胞定位的預(yù)測(cè)和試驗(yàn)均表明，NtTPS2定位于葉綠體中，與大部分單萜合酶的亞細(xì)胞定位相一致。進(jìn)化分析結(jié)果顯示NtTPS2與單萜合酶聚為一類(lèi)，推測(cè)其可能參與煙草中單萜類(lèi)化合物的生物合成。通過(guò)以大腸桿菌為底盤(pán)的微生物代謝工程對(duì)NtTPS2生化功能的鑒定，進(jìn)一步證實(shí)了NtTPS2是一個(gè)單萜合酶，能夠以GPP為底物合成單萜類(lèi)化合物香葉醇及其異構(gòu)體橙花醇，是一個(gè)香葉醇合成酶（geraniol synthase，GES）。目前編碼GES的基因已在多個(gè)物種中被分離和鑒定，如長(zhǎng)春花、羅勒、紫蘇、藿香和甜舌草等。但是不同GES基因的表達(dá)模式和酶活性卻不盡相同，暗示GES基因在不同物種間的生物學(xué)功能存在特異性。

已有的研究表明，萜類(lèi)化合物在植物抵御逆境脅迫、吸引昆蟲(chóng)授粉和趨避害蟲(chóng)等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。如大豆TPS家族基因可能參與花與根的生長(zhǎng)發(fā)育［24］；過(guò)表達(dá)水稻TPS1基因能提高水稻對(duì)干旱、高鹽及低溫等逆境的脅迫［25］；冬小麥TPS基因參與其低溫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程等［26］。對(duì)NtTPS2表達(dá)模式的分析發(fā)現(xiàn)，NtTPS2的表達(dá)具有一定的組織特異性，在根部和雌蕊中的表達(dá)量相對(duì)較高，且強(qiáng)烈響應(yīng)低溫、干旱和高鹽等逆境脅迫和ABA信號(hào)，暗示著其可能負(fù)責(zé)煙草根部和雌蕊中香葉醇和橙花醇類(lèi)揮發(fā)性單萜物質(zhì)的生物合成，在煙草抵御非生物逆境脅迫和授粉生殖等生理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。

近年來(lái)，人們對(duì)萜類(lèi)代謝途徑及其調(diào)控機(jī)理研究的不斷深入，使得代謝工程成為研究萜類(lèi)合酶基因及萜類(lèi)化合物生物合成的有效手段［27］。王詩(shī)語(yǔ)等［28］以大腸桿菌為底盤(pán)細(xì)胞，利用合成生物學(xué)手段導(dǎo)入外源雜合蒎烯合成途徑，構(gòu)建了合成蒎烯的微生物工程菌株；袁雪峰等［29］研究表明，通過(guò)構(gòu)建蝦青素合成相關(guān)基因工程菌的發(fā)酵試驗(yàn)，明確了蝦青素的生物合成路徑，并進(jìn)一步提高了蝦青素的產(chǎn)量和純度；李瑜等［30］利用發(fā)酵罐高密度培養(yǎng)番茄紅素生物合成工程菌，并通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)條件及工藝，獲得產(chǎn)量大幅提高的番茄紅素。本研究通過(guò)在大腸桿菌中優(yōu)化萜類(lèi)物質(zhì)生物合成途徑，并表達(dá)煙草單萜合成酶基因NtTPS2，利用基因工程手段構(gòu)建了以葡萄糖為原料合成香葉醇和橙花醇的工程菌株代謝途徑，為進(jìn)一步研究煙草單萜類(lèi)化合物的生物合成提供理論依據(jù)和基礎(chǔ)元件。

4 結(jié)論

煙草NtTPS2是一個(gè)單萜合成酶基因，包含1 854 bp的ORF，編碼617個(gè)氨基酸。該蛋白具有萜烯合酶典型的保守結(jié)構(gòu)域及催化活性功能域。NtTPS2定位于葉綠體中，具有組織表達(dá)特異性，受非生物脅迫和植物激素ABA信號(hào)誘導(dǎo)。NtTPS2能夠以GPP為底物催化合成香葉醇和橙花醇。