胡子曜 代培紅 劉超 瑪?shù)夏取つ纠?王倩 吾尕力汗·阿不都維力趙燚 孫玲 徐詩(shī)佳 李月

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830052）

棉花是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，種植廣泛。然而棉花在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)受到一系列的生物脅迫和環(huán)境因素的影響。這些不利因素會(huì)影響棉花的生長(zhǎng)、產(chǎn)量以及纖維品質(zhì)，繼而造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，發(fā)掘棉花抗逆相關(guān)基因并研究其抗逆的分子機(jī)制，培育棉花抗逆新品種進(jìn)而獲得高產(chǎn)高品質(zhì)的棉花，對(duì)于提高棉花產(chǎn)量和農(nóng)民收入，促進(jìn)經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有重大意義。

小G蛋白（small GTPases）家族成員是一類分子量為20-30 kD的單體蛋白，廣泛存在于真核生物中［1］，通過(guò)其獨(dú)特的調(diào)節(jié)方式，在植物細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及生長(zhǎng)發(fā)育等生理活動(dòng)中起關(guān)鍵的作用［2］。根據(jù)其結(jié)構(gòu)和功能的不同，將其分為Ras、Ran、Rab、Rho和Arf等5個(gè)家族［3］，在真核生物中，Ran、Rab、Arf家族蛋白的功能主要參與囊泡和大分子運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)，而Ras和Rho家族蛋白則是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)開關(guān)。ROP蛋白是一類植物特有的Rho類小G蛋白［4-5］，具有GTP酶活性，通過(guò)與GTP結(jié)合和水解過(guò)程中構(gòu)象的變化促進(jìn)了ROP蛋白與效應(yīng)因子或調(diào)節(jié)蛋白的短暫相互作用，從而導(dǎo)致信號(hào)級(jí)聯(lián)的周期性激活或失活，在植物信號(hào)傳導(dǎo)途徑中起分子開關(guān)的作用［6］，ROP家族蛋白作為植物特有的上游信號(hào)傳遞的分子開關(guān)，參與了植物對(duì)病原菌的防衛(wèi)調(diào)控及抗逆反應(yīng)。

最早在豌豆中發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)ROP基因，目前，已在沉香、番茄、辣椒、煙草、玉米、棉花、水稻、擬南芥、苜蓿、葡萄、大豆等多種作物中克隆了ROP基因，對(duì)ROP基因的功能研究也更加深入，研究發(fā)現(xiàn)該類基因除了參與細(xì)胞分裂、根毛極性生長(zhǎng)、花粉管生長(zhǎng)、激素反應(yīng)等生理活動(dòng)外［7］，也響應(yīng)了高溫、鹽、低溫、干旱脅迫和抗病反應(yīng)［8］。目前，對(duì)于棉花中ROP家族基因的研究報(bào)道主要集中在棉花纖維發(fā)育和陸地棉對(duì)黃萎病菌的抗病反應(yīng)，對(duì)其在非生物脅迫下的功能研究也有初步報(bào)道。雖然已有研究表明ROP基因響應(yīng)棉花抗逆反應(yīng)，但其對(duì)逆境的調(diào)控方式及抗逆分子機(jī)制還不清楚，仍需要進(jìn)一步探究。李先碧等［9］從陸地棉克隆了GhRacA和GhRacB，這兩個(gè)基因在棉花纖維起始和伸長(zhǎng)時(shí)期優(yōu)勢(shì)表達(dá)。因此，推測(cè)其可能調(diào)控棉花纖維的早期發(fā)育；Delmer等［10］克隆了2個(gè)在棉纖維發(fā)育過(guò)程中初生和次生壁合成過(guò)渡時(shí)期的優(yōu)勢(shì)表達(dá)的基因GhRac9和GhRac13，推測(cè)它們可能調(diào)控棉花次生壁的合成；王鈺靜［11］通過(guò)病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)抑制棉花GhROP6的表達(dá)，沉默植株的抗病性顯著低于對(duì)照組，推測(cè)GhROP6正調(diào)控棉花對(duì)黃萎病的抗性；李月等［12］從陸地棉克隆了GhROP4并利用qRT-PCR技術(shù)分析了不同脅迫下該基因的表達(dá)情況，表明GhROP4響應(yīng)非生物脅迫應(yīng)答；但目前對(duì)于GhROP3的生物學(xué)功能研究還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

病毒誘導(dǎo)基因沉默（virusinduced gene silencing，VIGS）是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種快速、高效、高通量的反向遺傳學(xué)技術(shù)，其原理是利用重組病毒抑制植物內(nèi)源基因的表達(dá)，通過(guò)表型或生理指標(biāo)變化鑒定基因的功能，屬于轉(zhuǎn)錄后基因沉默［13］。

本研究利用同源克隆的方法從棉花cDNA中克隆得到的GhROP3，通過(guò)熒光定量PCR的方法分析該基因的組織表達(dá)特異性和不同逆境誘導(dǎo)條件下的表達(dá)模式，同時(shí)構(gòu)建了該基因的VIGS沉默載體并通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)侵染棉花獲得沉默植株，旨為進(jìn)一步驗(yàn)證棉花GhROP3的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為陸地棉新陸早22，由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。農(nóng)桿菌菌株GV3101為新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；大麗輪枝菌強(qiáng)致病力落葉型菌株V991（Verticillium dahlia Kleb）、TRV病 毒 載 體 及含陽(yáng)性對(duì)照TRV：GhCLA1載體的農(nóng)桿菌菌株由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院核技術(shù)生物技術(shù)研究所黃全生研究員惠贈(zèng)。XbaⅠ和SmaⅠ等限制性內(nèi)切酶購(gòu)于賽默飛（Thermo）公司，Biospin多糖多酚植物總RNA提取試劑盒購(gòu)于杭州博日科技公司，Taq DNA聚合酶、T4 DNA Ligase、RNase A、高保真聚合酶TransStar KD Plus、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒和DNA分子量Marker均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司?？敲顾?、慶大霉素、MES、乙酰丁香酮、MgCl2及培養(yǎng)基配制等化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。PCR所用引物的合成及DNA的測(cè)序均由上海杰李生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 棉花種植及脅迫處理 選取經(jīng)硫酸脫絨后顆粒飽滿大小一致的種子，經(jīng)30%的H2O2處理后，再用清水沖洗3-5遍，將種子浸泡于清水中直至露白，然后把種子平鋪在發(fā)芽紙上裝入自封袋中置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)12 h，待胚根長(zhǎng)至2-3 cm時(shí)，種植于蛭石∶黑土=1∶2的營(yíng)養(yǎng)土中，25℃培養(yǎng)室、光照周期為16 h光照/8 h黑暗條件下培養(yǎng)并適時(shí)澆水，待棉苗生長(zhǎng)15 d后用于脅迫處理。

選取生長(zhǎng)一致的棉花，置于吸水紙上吸干水分，分別進(jìn)行4℃低溫、干旱、高鹽（200 mol/L NaCl）脅迫處理，具體處理方法參照王娜等［14］已報(bào)道的方法進(jìn)行。分別于脅迫處理后的0、1、3、6和12 h采集葉片，鹽脅迫處理的最適濃度及各取樣時(shí)間段的選擇參照李月等［12］的方法，同時(shí)對(duì)未處理材料的根、真葉、子葉、下胚軸和莖進(jìn)行取樣，用于組織特異性表達(dá)檢測(cè)。不同的時(shí)間點(diǎn)及不同部位均取3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。將所取材料液氮冷凍并-80℃保存，用于總RNA提取及目的基因表達(dá)分析。

待棉花第二片真葉完全展開時(shí)，參照王鈺靜［11］和李秀青等［15］的方法挑選生長(zhǎng)狀況一致的棉苗進(jìn)行接菌處理，在接菌0、6、12、24和48 h后取棉花幼根，不同的時(shí)間點(diǎn)均取3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。取樣時(shí)用無(wú)菌水將根部清洗干凈，迅速液氮冷凍并-80℃保存，用于總RNA提取及目的基因的表達(dá)分析。

1.2.2 棉花總RNA的提取與cDNA第一鏈的合成 將上述樣品研磨成白色粉末，使用Biospin Plant Total RNA Extraction Kit試劑盒提取棉花不同處理、不同時(shí)間點(diǎn)和棉花不同組織的RNA，用Thermo Scientific（NanoDrop 1000）核酸分析儀和1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提RNA的質(zhì)量和完整性，質(zhì)量檢測(cè)合格的RNA使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒，進(jìn)行cDNA第一鏈的合成。

1.2.3 棉花GhROP3的克隆及序列分析 從擬南芥TAIR網(wǎng)站（http：/www.arabidopsis.org/index.jsp）下載AtROP1（AT2G17800）基因的序列，在棉花EST數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.leonxie.com）、棉花基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.phytozome.net）中進(jìn)行比對(duì)，獲得棉花ROP基因的cDNA序列，將其命名為GhROP3。然后根據(jù)此序列的ORF（open reading frame）序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物（表1），以陸地棉新陸早22的cDNA為模板，使用高保真聚合酶TransStar KD Plus進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，回收目的條帶，并連接pEASY-Blunt-Zero克隆載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞。挑取單克隆進(jìn)行質(zhì)粒酶切鑒定，正確的陽(yáng)性克隆質(zhì)粒送上海杰李生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。試驗(yàn)所用的PCR程序、擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)及目的片段的純化回收均參照王娜等［14］方法進(jìn)行。

用基因文庫(kù)（GenBank）為GhROP3申請(qǐng)登錄號(hào)，利用（http：//web.expasy.org/protparam/）在線程序計(jì)算GhROP3編碼蛋白質(zhì)的理化參數(shù)。用SignalP（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）在 線 程 序?qū)υ摰鞍踪|(zhì)進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析。利用在線軟件TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)域。

1.2.4 目的基因的表達(dá)特征分析 以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，以棉花管家基因UBQ7［16］為內(nèi)參基因，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參照王娜等［14］方法，每個(gè)樣本進(jìn)行3個(gè)技術(shù)重復(fù)。反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)目的基因和內(nèi)參基因Ct值，使用2-ΔΔCt方法［17］計(jì)算目的基因的表達(dá)量。目的基因和內(nèi)參基因熒光定量引物見(jiàn)表1。

1.2.5 陸地棉GhROP3的VIGS片段克隆與VIGS載體構(gòu)建 根據(jù)GhROP3的CDS（591 bp）序列，利用SGN-VIGS在線軟件設(shè)計(jì)抑制目的基因表達(dá)的靶序列（291 bp），設(shè)計(jì)合適引物，并在其上、下游5'端分別加入XbaⅠ和SmaⅠ的酶切位點(diǎn)（表1），以cDNA為模板，PCR擴(kuò)增目標(biāo)片段?；厥?、檢驗(yàn)、測(cè)序方法同1.2.1。將測(cè)序完全正確的質(zhì)粒和VIGS沉默載體TRV2用XbaⅠ和SmaⅠ進(jìn)行雙酶切并回收，將回收的目的條帶與TRV2載體用T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞，用XbaⅠ和SmaⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切正確的質(zhì)粒取15 μL使用凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞，28℃倒置培養(yǎng)2-3 d，用于后續(xù)試驗(yàn)。1.2.6 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的VIGS侵染棉花及沉默效率檢測(cè) 參照李秀青等［15］的方法，挑取構(gòu)建好的載體TRV:RNA1、TRV:RNA2、TRV:GhCLA1和TRV:GhROP3轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后，進(jìn)行轉(zhuǎn)化棉花前的活化及重懸。待棉花幼苗生長(zhǎng)至子葉完全展開且真葉還未露出時(shí)，參照王鈺靜［11］的方法選取生長(zhǎng)較為一致的幼苗，利用注射法侵染棉花。將包含TRV:GhROP3和TRV:RNA1、TRV:GhCLA1和TRV:RNA1、TRV:RNA2和TRV:RNA1的重懸菌液侵染的棉花植株分別作為試驗(yàn)組及陽(yáng)性、陰性對(duì)照。

侵染棉株幼苗大約15 d時(shí)，當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照TRV:GhCLA1出現(xiàn)葉綠素缺失的白化表型時(shí)，拍照記錄。對(duì)陰、陽(yáng)對(duì)照和試驗(yàn)組植株第二片真葉及根部進(jìn)行取樣，每個(gè)樣本取3個(gè)技術(shù)重復(fù)。將所取樣本進(jìn)行RNA提取并反轉(zhuǎn)成cDNA，利用熒光定量PCR反應(yīng)檢測(cè)基因沉默效率。目的基因沉默檢測(cè)和陽(yáng)性對(duì)照GhCLA1沉默檢測(cè)的熒光定量引物見(jiàn)表1。

表1 引物及用途Table 1 Primer and application

2 結(jié)果

2.1 GhROP3的克隆與序列分析

以陸地棉新陸早22的葉片cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增（圖1），擴(kuò)增片段大小符合預(yù)期，表明已克隆出GhROP3的CDS序列并在基因文庫(kù)（GenBank）為其申請(qǐng)登錄號(hào)：MK955930。利用在線軟件對(duì)GhROP3進(jìn)行生物學(xué)分析（表2），GhROP3的ORF為591 bp，編碼196個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量為21.75 kD，理論等電點(diǎn)為9.45，平均疏水性為負(fù)值，表明該基因編碼的蛋白為堿性、親水性蛋白；蛋白質(zhì)信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果顯示GhROP3蛋白無(wú)信號(hào)肽；亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示GhROP3蛋白定位于細(xì)胞膜；跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果顯示GhROP3蛋白是非跨膜蛋白。

表2 棉花GhROP3的生物信息學(xué)分析Table 2 Bioinformatics analysis of GhROP3 in cotton

圖1 GhROP3的克隆Fig. 1 Cloning of GhROP3 gene

2.2 GhROP3的表達(dá)特征分析

利用熒光定量PCR檢測(cè)GhROP3在高鹽（200 mol/L NaCl）、干旱、低溫和黃萎病菌逆境脅迫處理下的表達(dá)模式，結(jié)果表明，GhROP3對(duì)以上處理均有應(yīng)答反應(yīng)，但在不同脅迫處理下基因表達(dá)模式不同。在高鹽處理下，GhROP3在1 h的表達(dá)量最高，在0和3 h基因表達(dá)量一致，無(wú)明顯差異，均顯著與高于6和12 h（圖2-A）。在干旱處理下，GhROP3在6 h的表達(dá)量均高于其他時(shí)間點(diǎn)，在0和12 h的表達(dá)量基本一致，均低于1和3 h（圖2-B）。低溫處理后，GhROP3在12 h的表達(dá)量高于其他時(shí)間點(diǎn)，但在其他時(shí)間點(diǎn)也有一定的表達(dá)量（圖2-C）。黃萎病菌侵染棉花后，GhROP3的表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在4 h的表達(dá)量最高，在24和48 h的表達(dá)量基本一致，在0 h的表達(dá)量最低（圖2-D）。GhROP3在不同組織中的表達(dá)分析結(jié)果表明，GhROP3在莖中的表達(dá)量最高，在根、葉、子葉和下胚軸中的表達(dá)量均處于低表達(dá)量水平（圖2-E），說(shuō)明該基因的表達(dá)存在一定的組織特異性。

圖2 GhROP3的表達(dá)譜分析Fig. 2 Expression pattern analysis of GhROP3

2.3 GhROP3的VIGS載體構(gòu)建

利用PCR方法擴(kuò)增GhROP3的VIGS靶序列，所得產(chǎn)物大小符合預(yù)期（圖3-A）。將產(chǎn)物進(jìn)行克隆并測(cè)序，所得結(jié)果與目標(biāo)片段序列一致。經(jīng)XbaⅠ和SmaⅠ酶切陽(yáng)性質(zhì)粒與VIGS沉默載體TRV2連接，并進(jìn)行雙酶切鑒定（圖3-B），發(fā)現(xiàn)呈現(xiàn)2條條帶，一條大于8 000 bp的載體條帶和大小為250-500 bp的目標(biāo)條帶，表明GhROP3的VIGS沉默載體構(gòu)建成功。

圖3 GhROP3的VIGS載體的構(gòu)建Fig. 3 Construction of VIGS vector of GhROP3

2.4 VIGS技術(shù)體系檢驗(yàn)

將3個(gè)轉(zhuǎn)化體TRV∶GhCLA1、TRV∶GhROP3和TRV∶RNA2分別與TRV∶RNA1混合，分別侵染棉花子葉。侵染15 d后，表型觀察，陽(yáng)性對(duì)照的葉片出現(xiàn)白化現(xiàn)象（圖4-A）；利用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)陽(yáng)性對(duì)照GhCLA1和GhROP3在根和真葉中的表達(dá)量，結(jié)果顯示，目的基因的表達(dá)量均顯著性低于對(duì)照組（圖4-B-C），證明VIGS沉默載體在植株體內(nèi)能夠正常工作，成功獲得GhROP3的沉默植株。

圖4 VIGS技術(shù)體系驗(yàn)證Fig. 4 Verification of VIGS system

3 討論

棉花是我國(guó)重要的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)作物，在國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有舉足輕重的地位。而新疆由于其獨(dú)特的光熱資源，現(xiàn)已成為我國(guó)最大的棉花種植區(qū)［18］。但新疆棉花的大面積種植在推動(dòng)地區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的同時(shí)，也給棉花黃萎病的爆發(fā)和流行提供了便利條件，黃萎病現(xiàn)已成為棉花生產(chǎn)的主要障礙，同時(shí)也是制約棉花高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、優(yōu)產(chǎn)的關(guān)鍵因素；此外棉花在生長(zhǎng)過(guò)程中還會(huì)遭受到一系列的非生物逆境脅迫，由于地理位置及氣候的影響，干旱脅迫同樣嚴(yán)重影響著新疆棉花的擴(kuò)大生產(chǎn)，使得新疆地區(qū)棉花的生產(chǎn)優(yōu)勢(shì)無(wú)法充分發(fā)揮出來(lái)。傳統(tǒng)的雜交育種方法難度大、周期長(zhǎng)，已不能滿足現(xiàn)實(shí)生產(chǎn)發(fā)展的需求。因此，篩選、鑒定棉花抗逆相關(guān)基因，對(duì)保障棉花的有效供給具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

在黃萎病抗性基因篩選方面，Kawchuk等［19］在番茄中克隆出了Ve1、Ve2兩個(gè)抗黃萎病相關(guān)連鎖基因；陳捷胤［20］在海島棉中克隆出GbaVd1和GbaVd2，通過(guò)過(guò)表達(dá)GbaVd1和GbaVd2增強(qiáng)了擬南芥對(duì)黃萎病的抗性；Zhang等［21］沉默了海島棉中GbVe1后，沉默植株對(duì)黃萎病菌的抗性顯著降低，證明該基因在抗黃萎病反應(yīng)中起正調(diào)控作用；此外，一些抗性相關(guān)基因如GhDIR1、GhROP6［11］、GhWRKY40-like、GhWRKY70［22］等也被證實(shí)參與棉花對(duì)黃萎病菌的抗性。同時(shí)近年來(lái)也研究發(fā)現(xiàn)了許多有利用價(jià)值的抗旱基因，例如AREB、NAC、DREB、ABH1、SAD1、NF-Y和WRKY等轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因；SnRK2、ERA1、MAPK、GGB［23］、DST［24］等蛋白翻譯后修飾調(diào)控基因；CDPK、LOS、NCED和PLC等新陳代謝調(diào)控基因；LEA、P5CS、TPS、和betA等滲透保護(hù)調(diào)控基因［25］。

ROP蛋白作為傳遞細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外刺激信號(hào)的分子開關(guān)，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的各種反應(yīng)［7］。在擬南芥中，AtROP11的表達(dá)影響種子萌發(fā)、幼苗生長(zhǎng)、氣孔關(guān)閉、脫落酸介導(dǎo)的反應(yīng)和干旱脅迫反應(yīng)［26］；AtROP1是ABA調(diào)控氣孔開閉中的一個(gè)重要基因，該基因在氣孔保衛(wèi)細(xì)胞中優(yōu)勢(shì)表達(dá)，ABA通過(guò)滅活A(yù)tROP1蛋白，誘導(dǎo)氣孔開閉［27］；擬南芥ROP效應(yīng)子RIC1的敲除通過(guò)改善解聚微管的重組提高了鹽脅迫下植株的存活率［28］。本研究通過(guò)擬南芥基因序列與棉花基因組數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，利用同源克隆的方法成功克隆出一個(gè)棉花ROP基因，命名為GhROP3，該基因的ORF長(zhǎng)度為591 bp，編碼196個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量為21.75 kD，編碼的蛋白為堿性、親水性蛋白，定位于細(xì)胞膜，是非跨膜蛋白。為探究該基因是否具有與擬南芥AtROP相似的功能，本研究分析了GhROP3在低溫、干旱、高鹽處理和黃萎病菌侵染后基因的表達(dá)情況，結(jié)果表明，GhROP3在低溫脅迫下，基因表達(dá)量整體上呈現(xiàn)先升高再降低后升高的趨勢(shì)；在干旱、高鹽脅迫下和黃萎病菌處理后，該基因的表達(dá)量整體均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)；在這4種逆境脅迫處理中GhROP3的表達(dá)受干旱和黃萎病調(diào)控的程度較強(qiáng)，推測(cè)GhROP3可能更多地參與了棉花對(duì)干旱的脅迫反應(yīng)和抗黃萎病反應(yīng)。上述結(jié)果顯示在后續(xù)的研究中應(yīng)該更多地關(guān)注GhROP3在棉花抗旱和抗黃萎病中的功能。組織特異性分析表明，GhROP3在棉花幼苗根、莖、葉、子葉和下胚軸中均有表達(dá)，但存在一定的組織特異性，GhROP3在莖中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于其它組織，以上結(jié)果推測(cè)棉花GhROP3棉花莖組織中發(fā)揮著重要的調(diào)控功能。然而GhROP3在棉花抗逆中的功能尚不清楚，為進(jìn)一步探究該基因在棉花抗逆中的調(diào)控方式及調(diào)控的分子機(jī)制，本研究還構(gòu)建了GhROP3的VIGS沉默載體并轉(zhuǎn)化棉花，獲得了沉默植株，以期進(jìn)一步研究棉花GhROP3的生物學(xué)功能，本研究為棉花抗逆的重要基因資源挖掘及創(chuàng)制新材料奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

克隆獲得1個(gè)小GTP結(jié)合蛋白基因GhROP3，其開放閱讀框?yàn)?91 bp，編碼196個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量為21.75 kD，編碼蛋白為堿性、親水性蛋白，定位于細(xì)胞膜，是非跨膜蛋白。GhROP3在棉花幼苗根、莖、葉、子葉和下胚軸中均有表達(dá)，且在莖中表達(dá)水平較高。同時(shí)該基因響應(yīng)高鹽、干旱、低溫和黃萎病菌等逆境脅迫。本研究獲得VIGS沉默植株。