胡子曜 代培紅 劉超 瑪?shù)夏取つ纠?王倩 吾尕力汗·阿不都維力趙燚 孫玲 徐詩佳 李月

（新疆農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室，烏魯木齊 830052）

棉花是我國重要的經(jīng)濟作物，種植廣泛。然而棉花在生長過程中會受到一系列的生物脅迫和環(huán)境因素的影響。這些不利因素會影響棉花的生長、產(chǎn)量以及纖維品質(zhì)，繼而造成巨大的經(jīng)濟損失。因此，發(fā)掘棉花抗逆相關(guān)基因并研究其抗逆的分子機制，培育棉花抗逆新品種進而獲得高產(chǎn)高品質(zhì)的棉花，對于提高棉花產(chǎn)量和農(nóng)民收入，促進經(jīng)濟發(fā)展具有重大意義。

小G蛋白（small GTPases）家族成員是一類分子量為20-30 kD的單體蛋白，廣泛存在于真核生物中［1］，通過其獨特的調(diào)節(jié)方式，在植物細胞信號轉(zhuǎn)導及生長發(fā)育等生理活動中起關(guān)鍵的作用［2］。根據(jù)其結(jié)構(gòu)和功能的不同，將其分為Ras、Ran、Rab、Rho和Arf等5個家族［3］，在真核生物中，Ran、Rab、Arf家族蛋白的功能主要參與囊泡和大分子運動的調(diào)節(jié)，而Ras和Rho家族蛋白則是信號轉(zhuǎn)導開關(guān)。ROP蛋白是一類植物特有的Rho類小G蛋白［4-5］，具有GTP酶活性，通過與GTP結(jié)合和水解過程中構(gòu)象的變化促進了ROP蛋白與效應因子或調(diào)節(jié)蛋白的短暫相互作用，從而導致信號級聯(lián)的周期性激活或失活，在植物信號傳導途徑中起分子開關(guān)的作用［6］，ROP家族蛋白作為植物特有的上游信號傳遞的分子開關(guān)，參與了植物對病原菌的防衛(wèi)調(diào)控及抗逆反應。

最早在豌豆中發(fā)現(xiàn)了第一個ROP基因，目前，已在沉香、番茄、辣椒、煙草、玉米、棉花、水稻、擬南芥、苜蓿、葡萄、大豆等多種作物中克隆了ROP基因，對ROP基因的功能研究也更加深入，研究發(fā)現(xiàn)該類基因除了參與細胞分裂、根毛極性生長、花粉管生長、激素反應等生理活動外［7］，也響應了高溫、鹽、低溫、干旱脅迫和抗病反應［8］。目前，對于棉花中ROP家族基因的研究報道主要集中在棉花纖維發(fā)育和陸地棉對黃萎病菌的抗病反應，對其在非生物脅迫下的功能研究也有初步報道。雖然已有研究表明ROP基因響應棉花抗逆反應，但其對逆境的調(diào)控方式及抗逆分子機制還不清楚，仍需要進一步探究。李先碧等［9］從陸地棉克隆了GhRacA和GhRacB，這兩個基因在棉花纖維起始和伸長時期優(yōu)勢表達。因此，推測其可能調(diào)控棉花纖維的早期發(fā)育；Delmer等［10］克隆了2個在棉纖維發(fā)育過程中初生和次生壁合成過渡時期的優(yōu)勢表達的基因GhRac9和GhRac13，推測它們可能調(diào)控棉花次生壁的合成；王鈺靜［11］通過病毒誘導的基因沉默技術(shù)抑制棉花GhROP6的表達，沉默植株的抗病性顯著低于對照組，推測GhROP6正調(diào)控棉花對黃萎病的抗性；李月等［12］從陸地棉克隆了GhROP4并利用qRT-PCR技術(shù)分析了不同脅迫下該基因的表達情況，表明GhROP4響應非生物脅迫應答；但目前對于GhROP3的生物學功能研究還未見相關(guān)報道。

病毒誘導基因沉默（virusinduced gene silencing，VIGS）是近年來發(fā)展起來的一種快速、高效、高通量的反向遺傳學技術(shù)，其原理是利用重組病毒抑制植物內(nèi)源基因的表達，通過表型或生理指標變化鑒定基因的功能，屬于轉(zhuǎn)錄后基因沉默［13］。

本研究利用同源克隆的方法從棉花cDNA中克隆得到的GhROP3，通過熒光定量PCR的方法分析該基因的組織表達特異性和不同逆境誘導條件下的表達模式，同時構(gòu)建了該基因的VIGS沉默載體并通過農(nóng)桿菌介導侵染棉花獲得沉默植株，旨為進一步驗證棉花GhROP3的生物學功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為陸地棉新陸早22，由新疆農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室提供。農(nóng)桿菌菌株GV3101為新疆農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室保存；大麗輪枝菌強致病力落葉型菌株V991（Verticillium dahlia Kleb）、TRV病 毒 載 體 及含陽性對照TRV：GhCLA1載體的農(nóng)桿菌菌株由新疆農(nóng)業(yè)科學院核技術(shù)生物技術(shù)研究所黃全生研究員惠贈。XbaⅠ和SmaⅠ等限制性內(nèi)切酶購于賽默飛（Thermo）公司，Biospin多糖多酚植物總RNA提取試劑盒購于杭州博日科技公司，Taq DNA聚合酶、T4 DNA Ligase、RNase A、高保真聚合酶TransStar KD Plus、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒和DNA分子量Marker均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。卡那霉素、慶大霉素、MES、乙酰丁香酮、MgCl2及培養(yǎng)基配制等化學試劑均為國產(chǎn)分析純。PCR所用引物的合成及DNA的測序均由上海杰李生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 棉花種植及脅迫處理 選取經(jīng)硫酸脫絨后顆粒飽滿大小一致的種子，經(jīng)30%的H2O2處理后，再用清水沖洗3-5遍，將種子浸泡于清水中直至露白，然后把種子平鋪在發(fā)芽紙上裝入自封袋中置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)12 h，待胚根長至2-3 cm時，種植于蛭石∶黑土=1∶2的營養(yǎng)土中，25℃培養(yǎng)室、光照周期為16 h光照/8 h黑暗條件下培養(yǎng)并適時澆水，待棉苗生長15 d后用于脅迫處理。

選取生長一致的棉花，置于吸水紙上吸干水分，分別進行4℃低溫、干旱、高鹽（200 mol/L NaCl）脅迫處理，具體處理方法參照王娜等［14］已報道的方法進行。分別于脅迫處理后的0、1、3、6和12 h采集葉片，鹽脅迫處理的最適濃度及各取樣時間段的選擇參照李月等［12］的方法，同時對未處理材料的根、真葉、子葉、下胚軸和莖進行取樣，用于組織特異性表達檢測。不同的時間點及不同部位均取3個生物學重復。將所取材料液氮冷凍并-80℃保存，用于總RNA提取及目的基因表達分析。

待棉花第二片真葉完全展開時，參照王鈺靜［11］和李秀青等［15］的方法挑選生長狀況一致的棉苗進行接菌處理，在接菌0、6、12、24和48 h后取棉花幼根，不同的時間點均取3個生物學重復。取樣時用無菌水將根部清洗干凈，迅速液氮冷凍并-80℃保存，用于總RNA提取及目的基因的表達分析。

1.2.2 棉花總RNA的提取與cDNA第一鏈的合成 將上述樣品研磨成白色粉末，使用Biospin Plant Total RNA Extraction Kit試劑盒提取棉花不同處理、不同時間點和棉花不同組織的RNA，用Thermo Scientific（NanoDrop 1000）核酸分析儀和1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提RNA的質(zhì)量和完整性，質(zhì)量檢測合格的RNA使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒，進行cDNA第一鏈的合成。

1.2.3 棉花GhROP3的克隆及序列分析 從擬南芥TAIR網(wǎng)站（http：/www.arabidopsis.org/index.jsp）下載AtROP1（AT2G17800）基因的序列，在棉花EST數(shù)據(jù)庫（http：//www.leonxie.com）、棉花基因組數(shù)據(jù)庫（http：//www.phytozome.net）中進行比對，獲得棉花ROP基因的cDNA序列，將其命名為GhROP3。然后根據(jù)此序列的ORF（open reading frame）序列設(shè)計擴增引物（表1），以陸地棉新陸早22的cDNA為模板，使用高保真聚合酶TransStar KD Plus進行PCR擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，回收目的條帶，并連接pEASY-Blunt-Zero克隆載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans-T1感受態(tài)細胞。挑取單克隆進行質(zhì)粒酶切鑒定，正確的陽性克隆質(zhì)粒送上海杰李生物技術(shù)有限公司進行測序。試驗所用的PCR程序、擴增產(chǎn)物檢測及目的片段的純化回收均參照王娜等［14］方法進行。

用基因文庫（GenBank）為GhROP3申請登錄號，利用（http：//web.expasy.org/protparam/）在線程序計算GhROP3編碼蛋白質(zhì)的理化參數(shù)。用SignalP（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）在 線 程 序?qū)υ摰鞍踪|(zhì)進行信號肽預測分析。利用在線軟件TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預測跨膜結(jié)構(gòu)域。

1.2.4 目的基因的表達特征分析 以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，以棉花管家基因UBQ7［16］為內(nèi)參基因，進行熒光定量PCR反應，反應體系和反應條件參照王娜等［14］方法，每個樣本進行3個技術(shù)重復。反應結(jié)束后根據(jù)目的基因和內(nèi)參基因Ct值，使用2-ΔΔCt方法［17］計算目的基因的表達量。目的基因和內(nèi)參基因熒光定量引物見表1。

1.2.5 陸地棉GhROP3的VIGS片段克隆與VIGS載體構(gòu)建 根據(jù)GhROP3的CDS（591 bp）序列，利用SGN-VIGS在線軟件設(shè)計抑制目的基因表達的靶序列（291 bp），設(shè)計合適引物，并在其上、下游5'端分別加入XbaⅠ和SmaⅠ的酶切位點（表1），以cDNA為模板，PCR擴增目標片段?；厥?、檢驗、測序方法同1.2.1。將測序完全正確的質(zhì)粒和VIGS沉默載體TRV2用XbaⅠ和SmaⅠ進行雙酶切并回收，將回收的目的條帶與TRV2載體用T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans-T1感受態(tài)細胞，用XbaⅠ和SmaⅠ進行雙酶切鑒定，酶切正確的質(zhì)粒取15 μL使用凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細胞，28℃倒置培養(yǎng)2-3 d，用于后續(xù)試驗。1.2.6 農(nóng)桿菌介導的VIGS侵染棉花及沉默效率檢測 參照李秀青等［15］的方法，挑取構(gòu)建好的載體TRV:RNA1、TRV:RNA2、TRV:GhCLA1和TRV:GhROP3轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后，進行轉(zhuǎn)化棉花前的活化及重懸。待棉花幼苗生長至子葉完全展開且真葉還未露出時，參照王鈺靜［11］的方法選取生長較為一致的幼苗，利用注射法侵染棉花。將包含TRV:GhROP3和TRV:RNA1、TRV:GhCLA1和TRV:RNA1、TRV:RNA2和TRV:RNA1的重懸菌液侵染的棉花植株分別作為試驗組及陽性、陰性對照。

侵染棉株幼苗大約15 d時，當陽性對照TRV:GhCLA1出現(xiàn)葉綠素缺失的白化表型時，拍照記錄。對陰、陽對照和試驗組植株第二片真葉及根部進行取樣，每個樣本取3個技術(shù)重復。將所取樣本進行RNA提取并反轉(zhuǎn)成cDNA，利用熒光定量PCR反應檢測基因沉默效率。目的基因沉默檢測和陽性對照GhCLA1沉默檢測的熒光定量引物見表1。

表1 引物及用途Table 1 Primer and application

2 結(jié)果

2.1 GhROP3的克隆與序列分析

以陸地棉新陸早22的葉片cDNA為模板進行PCR擴增（圖1），擴增片段大小符合預期，表明已克隆出GhROP3的CDS序列并在基因文庫（GenBank）為其申請登錄號：MK955930。利用在線軟件對GhROP3進行生物學分析（表2），GhROP3的ORF為591 bp，編碼196個氨基酸，相對分子質(zhì)量為21.75 kD，理論等電點為9.45，平均疏水性為負值，表明該基因編碼的蛋白為堿性、親水性蛋白；蛋白質(zhì)信號肽預測結(jié)果顯示GhROP3蛋白無信號肽；亞細胞定位預測結(jié)果顯示GhROP3蛋白定位于細胞膜；跨膜結(jié)構(gòu)域預測結(jié)果顯示GhROP3蛋白是非跨膜蛋白。

表2 棉花GhROP3的生物信息學分析Table 2 Bioinformatics analysis of GhROP3 in cotton

圖1 GhROP3的克隆Fig. 1 Cloning of GhROP3 gene

2.2 GhROP3的表達特征分析

利用熒光定量PCR檢測GhROP3在高鹽（200 mol/L NaCl）、干旱、低溫和黃萎病菌逆境脅迫處理下的表達模式，結(jié)果表明，GhROP3對以上處理均有應答反應，但在不同脅迫處理下基因表達模式不同。在高鹽處理下，GhROP3在1 h的表達量最高，在0和3 h基因表達量一致，無明顯差異，均顯著與高于6和12 h（圖2-A）。在干旱處理下，GhROP3在6 h的表達量均高于其他時間點，在0和12 h的表達量基本一致，均低于1和3 h（圖2-B）。低溫處理后，GhROP3在12 h的表達量高于其他時間點，但在其他時間點也有一定的表達量（圖2-C）。黃萎病菌侵染棉花后，GhROP3的表達量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在4 h的表達量最高，在24和48 h的表達量基本一致，在0 h的表達量最低（圖2-D）。GhROP3在不同組織中的表達分析結(jié)果表明，GhROP3在莖中的表達量最高，在根、葉、子葉和下胚軸中的表達量均處于低表達量水平（圖2-E），說明該基因的表達存在一定的組織特異性。

圖2 GhROP3的表達譜分析Fig. 2 Expression pattern analysis of GhROP3

2.3 GhROP3的VIGS載體構(gòu)建

利用PCR方法擴增GhROP3的VIGS靶序列，所得產(chǎn)物大小符合預期（圖3-A）。將產(chǎn)物進行克隆并測序，所得結(jié)果與目標片段序列一致。經(jīng)XbaⅠ和SmaⅠ酶切陽性質(zhì)粒與VIGS沉默載體TRV2連接，并進行雙酶切鑒定（圖3-B），發(fā)現(xiàn)呈現(xiàn)2條條帶，一條大于8 000 bp的載體條帶和大小為250-500 bp的目標條帶，表明GhROP3的VIGS沉默載體構(gòu)建成功。

圖3 GhROP3的VIGS載體的構(gòu)建Fig. 3 Construction of VIGS vector of GhROP3

2.4 VIGS技術(shù)體系檢驗

將3個轉(zhuǎn)化體TRV∶GhCLA1、TRV∶GhROP3和TRV∶RNA2分別與TRV∶RNA1混合，分別侵染棉花子葉。侵染15 d后，表型觀察，陽性對照的葉片出現(xiàn)白化現(xiàn)象（圖4-A）；利用qRT-PCR技術(shù)檢測陽性對照GhCLA1和GhROP3在根和真葉中的表達量，結(jié)果顯示，目的基因的表達量均顯著性低于對照組（圖4-B-C），證明VIGS沉默載體在植株體內(nèi)能夠正常工作，成功獲得GhROP3的沉默植株。

圖4 VIGS技術(shù)體系驗證Fig. 4 Verification of VIGS system

3 討論

棉花是我國重要的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟作物，在國民經(jīng)濟中占有舉足輕重的地位。而新疆由于其獨特的光熱資源，現(xiàn)已成為我國最大的棉花種植區(qū)［18］。但新疆棉花的大面積種植在推動地區(qū)經(jīng)濟發(fā)展的同時，也給棉花黃萎病的爆發(fā)和流行提供了便利條件，黃萎病現(xiàn)已成為棉花生產(chǎn)的主要障礙，同時也是制約棉花高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、優(yōu)產(chǎn)的關(guān)鍵因素；此外棉花在生長過程中還會遭受到一系列的非生物逆境脅迫，由于地理位置及氣候的影響，干旱脅迫同樣嚴重影響著新疆棉花的擴大生產(chǎn)，使得新疆地區(qū)棉花的生產(chǎn)優(yōu)勢無法充分發(fā)揮出來。傳統(tǒng)的雜交育種方法難度大、周期長，已不能滿足現(xiàn)實生產(chǎn)發(fā)展的需求。因此，篩選、鑒定棉花抗逆相關(guān)基因，對保障棉花的有效供給具有重要的現(xiàn)實意義。

在黃萎病抗性基因篩選方面，Kawchuk等［19］在番茄中克隆出了Ve1、Ve2兩個抗黃萎病相關(guān)連鎖基因；陳捷胤［20］在海島棉中克隆出GbaVd1和GbaVd2，通過過表達GbaVd1和GbaVd2增強了擬南芥對黃萎病的抗性；Zhang等［21］沉默了海島棉中GbVe1后，沉默植株對黃萎病菌的抗性顯著降低，證明該基因在抗黃萎病反應中起正調(diào)控作用；此外，一些抗性相關(guān)基因如GhDIR1、GhROP6［11］、GhWRKY40-like、GhWRKY70［22］等也被證實參與棉花對黃萎病菌的抗性。同時近年來也研究發(fā)現(xiàn)了許多有利用價值的抗旱基因，例如AREB、NAC、DREB、ABH1、SAD1、NF-Y和WRKY等轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因；SnRK2、ERA1、MAPK、GGB［23］、DST［24］等蛋白翻譯后修飾調(diào)控基因；CDPK、LOS、NCED和PLC等新陳代謝調(diào)控基因；LEA、P5CS、TPS、和betA等滲透保護調(diào)控基因［25］。

ROP蛋白作為傳遞細胞內(nèi)和細胞外刺激信號的分子開關(guān)，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的各種反應［7］。在擬南芥中，AtROP11的表達影響種子萌發(fā)、幼苗生長、氣孔關(guān)閉、脫落酸介導的反應和干旱脅迫反應［26］；AtROP1是ABA調(diào)控氣孔開閉中的一個重要基因，該基因在氣孔保衛(wèi)細胞中優(yōu)勢表達，ABA通過滅活AtROP1蛋白，誘導氣孔開閉［27］；擬南芥ROP效應子RIC1的敲除通過改善解聚微管的重組提高了鹽脅迫下植株的存活率［28］。本研究通過擬南芥基因序列與棉花基因組數(shù)據(jù)庫比對，利用同源克隆的方法成功克隆出一個棉花ROP基因，命名為GhROP3，該基因的ORF長度為591 bp，編碼196個氨基酸，相對分子質(zhì)量為21.75 kD，編碼的蛋白為堿性、親水性蛋白，定位于細胞膜，是非跨膜蛋白。為探究該基因是否具有與擬南芥AtROP相似的功能，本研究分析了GhROP3在低溫、干旱、高鹽處理和黃萎病菌侵染后基因的表達情況，結(jié)果表明，GhROP3在低溫脅迫下，基因表達量整體上呈現(xiàn)先升高再降低后升高的趨勢；在干旱、高鹽脅迫下和黃萎病菌處理后，該基因的表達量整體均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢；在這4種逆境脅迫處理中GhROP3的表達受干旱和黃萎病調(diào)控的程度較強，推測GhROP3可能更多地參與了棉花對干旱的脅迫反應和抗黃萎病反應。上述結(jié)果顯示在后續(xù)的研究中應該更多地關(guān)注GhROP3在棉花抗旱和抗黃萎病中的功能。組織特異性分析表明，GhROP3在棉花幼苗根、莖、葉、子葉和下胚軸中均有表達，但存在一定的組織特異性，GhROP3在莖中的表達量遠高于其它組織，以上結(jié)果推測棉花GhROP3棉花莖組織中發(fā)揮著重要的調(diào)控功能。然而GhROP3在棉花抗逆中的功能尚不清楚，為進一步探究該基因在棉花抗逆中的調(diào)控方式及調(diào)控的分子機制，本研究還構(gòu)建了GhROP3的VIGS沉默載體并轉(zhuǎn)化棉花，獲得了沉默植株，以期進一步研究棉花GhROP3的生物學功能，本研究為棉花抗逆的重要基因資源挖掘及創(chuàng)制新材料奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

克隆獲得1個小GTP結(jié)合蛋白基因GhROP3，其開放閱讀框為591 bp，編碼196個氨基酸，相對分子質(zhì)量為21.75 kD，編碼蛋白為堿性、親水性蛋白，定位于細胞膜，是非跨膜蛋白。GhROP3在棉花幼苗根、莖、葉、子葉和下胚軸中均有表達，且在莖中表達水平較高。同時該基因響應高鹽、干旱、低溫和黃萎病菌等逆境脅迫。本研究獲得VIGS沉默植株。