毛婷 牛永艷 鄭群 楊濤 穆永松 祝英 季彬 王治業(yè)

（1. 甘肅省科學(xué)院生物研究所 甘肅省微生物資源開發(fā)利用重點實驗室，蘭州 730000；2. 甘肅華瑞農(nóng)業(yè)股份有限公司，張掖 734500）

被稱為飼草蛋白之王的紫花苜蓿是我國反芻動物的主要飼草來源，在我國東北、華北、西北等地區(qū)都適宜種植不同抗寒、耐鹽、高產(chǎn)、抗病品種的紫花苜蓿。紫花苜蓿蛋白質(zhì)含量高、微生物及礦物質(zhì)含量豐富、氨基酸平衡，是一種優(yōu)良的保健飼料［1］。在苜蓿主產(chǎn)區(qū)，由于雨水與熱量同期，苜蓿收獲季節(jié)在制備苜蓿干草過程中容易受到雨水、落葉等損失，很難曬制成優(yōu)質(zhì)的干草，紫花苜蓿的青貯成為解決上述問題較為理想的途徑。紫花苜蓿屬于豆科多年生草本植物，可溶性碳水化合物及干物質(zhì)含量低，在青貯過程中難以快速降低pH，減少梭狀芽胞桿菌生長、蛋白質(zhì)水解和異氧發(fā)酵，提高青貯適口性［2］。因此，必需研究開發(fā)適宜于紫花苜蓿青貯的專一菌劑產(chǎn)品。

目前，關(guān)于菌劑產(chǎn)品的研究報道許多，市場上青貯的菌劑產(chǎn)品多樣，品質(zhì)層次不一。青貯菌劑主要以乳酸菌菌株為主，添加多種功能性酶，具有添加量小、安全、易操作、無污染等優(yōu)勢［3］；青貯密封后可以快速降低pH，減少蛋白質(zhì)的分解；抑制青貯發(fā)酵溫度上升，減少干物質(zhì)的損失；不宜發(fā)生二次發(fā)酵［4］。對于不同青貯原料開發(fā)不同青貯菌劑的研究報道有許多，俸祥仁等［5］以黑曲霉、乳酸菌及產(chǎn)軟假絲酵母復(fù)配青貯菌劑并運用于甘蔗葉梢青貯中。Fija?kowska等［6］采用3種不同乳酸菌作用于甜菜中提高青貯有氧穩(wěn)定性，降低產(chǎn)毒真菌的濃度。Hager等［7］以植物乳桿菌和小球菌復(fù)配菌劑，以提高辣根草和甜高粱青貯的發(fā)酵品質(zhì)。目前關(guān)于苜蓿等豆科植物單獨青貯的菌劑產(chǎn)品較少［8］。

綠汁發(fā)酵液是一種新型的乳酸菌類青貯菌劑，是將原料鮮草的汁液在厭氧條件下培養(yǎng)，富集原料上附著的野生乳酸菌中制備成棕色或棕黃色的液體［9］。綠汁發(fā)酵液中存在適宜于原料發(fā)酵所需的豐富的乳酸菌，Li等［10］報道了在38個苜蓿品種中分離得到84株乳酸菌隸屬于7個屬15個種及亞種。Chen等［11］研究了乳酸菌與纖維素酶聯(lián)合使用改善苜蓿青貯發(fā)酵品質(zhì)，影響瘤胃發(fā)酵對動物生產(chǎn)性能產(chǎn)生積極影響。在苜蓿綠汁發(fā)酵液中分離篩選能在低碳水化合物下生長、產(chǎn)酸能力強(qiáng)的菌株可用于開發(fā)苜蓿青貯菌劑。研究表明，產(chǎn)酸能力強(qiáng)的乳酸菌株能快速的降低青貯pH值，為其他有益菌的生長提供酸性環(huán)境［12］；盧強(qiáng)等［13］研究發(fā)現(xiàn)在鹽堿地苜蓿青貯的微生物中，可能存在為數(shù)不多的藍(lán)細(xì)菌，并對鹽堿地苜蓿的生長發(fā)育產(chǎn)生促進(jìn)作用。包維臣等［14］研究發(fā)現(xiàn)在苜蓿青貯中添加植物乳桿菌可以使乳酸菌活菌數(shù)快速升高，并對梭菌、大腸菌群、酵母菌和霉菌等青貯有害微生物產(chǎn)生了抑制作用。青貯過程是微生物群落結(jié)構(gòu)復(fù)雜變化的過程。不同青貯添加劑的添加對微生物群落結(jié)構(gòu)有著不同的影響。

有關(guān)青貯的研究多是從不同青貯原料、青貯條件等對青貯期間或開封后微生物的影響方面進(jìn)行探討，較少將添加劑、青貯品質(zhì)與微生物多樣性結(jié)合進(jìn)行深入探討。本研究通過制備苜蓿綠汁發(fā)酵液分離篩選產(chǎn)乳酸能力強(qiáng)乳酸菌株并與實驗室前期分離得到的菌株復(fù)配制備苜蓿青貯菌劑，研究不同的青貯菌劑對紫花苜蓿青貯的發(fā)酵品質(zhì)和微生物群落多樣性的影響，為青貯菌劑產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)與技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

紫花苜蓿來自于甘肅張掖華瑞農(nóng)業(yè)股份在有限公司種植地。青貯試驗地位于張掖市民樂縣，E 100°22'-101°13'，N 37°56'-38°48'，海 拔2 309 m。試驗開展時間為2020年6月-9月，平均氣溫12℃-24℃，苜蓿原料有機(jī)組分如表1所示。

表1 紫花苜蓿鮮草的化學(xué)組成Table 1 Chemical composition of fresh alfalfa

1.2 方法

1.2.1 試驗處理 苜蓿收割后，放置田間晾曬1-2 d，用烘干法檢測水分含量為55%-60%。將晾曬水分含量為55%-60%的苜蓿切割為1-2 cm。4個處理組分別為：添加苜蓿綠汁發(fā)酵液（aFGJ組），添加進(jìn)口菌劑貯生宜寶（YB組），添加復(fù)配菌劑GSSW（GSSW組）、及未添加菌劑作為對照（CK組），每個處理組9個重復(fù)。將處理后的苜蓿草裝入50 L食品級塑料桶內(nèi)壓實封口后埋入地表下2 m貯存，樣品分別于30 d、50 d、70 d取樣檢測青貯的發(fā)酵特性和化學(xué)成分。對70 d的青貯微生物種群進(jìn)行分析。

1.2.2 苜蓿青綠汁發(fā)酵液的制備 收集花蕾期苜蓿250 g，加入等量蒸餾水，在攪拌器中研磨攪拌，然后通過2層紗布過濾得到綠汁。將綠汁液500 mL藍(lán)蓋瓶中，加入2%葡萄糖，置于厭氧培養(yǎng)箱37℃厭氧培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)3 d得到苜蓿綠汁發(fā)酵液。采用梯度稀釋法測定活菌數(shù)。

1.2.3 乳酸菌株的分離與鑒定

1.2.3.1 乳酸菌株的分離 將苜蓿綠汁發(fā)酵液做標(biāo)準(zhǔn)10倍濃度系列梯度稀釋，分別取稀釋度為10-3、10-4、10-5、10-6倍的菌液100 μL涂于MRS篩選 培養(yǎng)基上，每個稀釋度做3個平行試驗，培養(yǎng)基倒置放入37℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后觀察菌落形態(tài)及是否產(chǎn)生鈣溶圈。用游標(biāo)卡尺測量培養(yǎng)基中鈣溶圈直徑和菌落直徑，將兩者的比值記為Dd，選取比值較大的菌株進(jìn)一步劃線純化3代獲得單菌落。

1.2.3.2 乳酸菌株的鑒定 利用微生物16S rDNA通用 引 物27F（5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'）、1492R（5'-TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3'）對菌株16S rDNA序列進(jìn)行擴(kuò)增。菌落PCR條件：95℃ 5 min；95℃ 45 s，57℃退火50 s，72℃ 1 min，30循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物純化回收后送至上海生物技術(shù)有限公司測序，利用BLAST軟件將測序結(jié)果與GenBank中已有序列進(jìn)行比對，并建立系統(tǒng)發(fā)育樹，確定菌株的種屬。

1.2.4 青貯添加劑的特性 市售進(jìn)口菌劑宜生貯寶（美國，成分：植物乳桿菌，乳酸片球菌，屎腸球菌，丙酸桿菌，枯草芽胞桿菌，黑曲霉；菌數(shù)：≧2.0×1010CFU/g）。按照說明書取0.1 g溶于200 mL水中，按規(guī)格均勻噴施于50 kg苜蓿上。產(chǎn)纖維素酶貝萊斯芽胞桿菌（Bacillus belais）K1和產(chǎn)淀粉酶枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）J1保存于甘肅省工業(yè)微生物菌種保藏中心，保藏號分別為GSICC 42323和GSICC 78393。K1的羧甲基纖維素酶活性達(dá)到370 U/mL，J1的α-淀粉酶活性達(dá)到110 U/mL。將菌株K1，K2及在苜蓿綠汁發(fā)酵液中篩選到的乳酸菌按照1∶1混合，得到復(fù)合青貯菌劑GSSW。采用梯度稀釋法測定活菌數(shù)，青貯添加量為105CFU/g苜蓿。

1.2.5 苜蓿青貯樣品理化及發(fā)酵品質(zhì) pH值采用pH計檢測；氨態(tài)氮（ammonia nitrogen，NH3-N），總氮（total nitrogen，TN）采用凱氏定氮儀［15］；乳酸（lactic acid，LA）、乙酸（acetic acid，AA）及丁酸（butyric acid，BA）含量采用HPLC，KC-811離子色譜柱，柱溫50℃，流動相為3 mmol/L HCLO4溶液，進(jìn)樣量5 μL［16］；干物質(zhì)（dry matter，DM）含量測定采用105℃烘干恒質(zhì)量法［17］；可溶性碳水化合物（water soluble carbohydrates，WSC）含量采用蒽酮-硫酸比色法［17］；粗蛋白含量=總氮×6.2；酸性洗滌纖維（acid detergent fiber，ADF）、中性洗滌纖維（neutral detergent fiber，NDF）及木質(zhì)素（lignin，LN）含量的測定采用纖維素測定儀。

1.2.6 青貯樣品微生物多樣性分析 無菌條件下取苜蓿綠汁發(fā)酵液200 mL及發(fā)酵70 d苜蓿青貯樣品20 g與200 mL無菌生理鹽水混合，分別在37℃振蕩 2 h 制得菌懸液，無菌濾膜過濾獲得微生物菌體，每個樣品處理3個重復(fù)。按照Water DNA試劑盒步驟提取微生物總DNA。根據(jù)16S rDNA全長引物27F和1492R，合成帶有Barcode的特異引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并對其產(chǎn)物進(jìn)行純化、定量和均一化形成測序文庫（SMRT Bell）采用PacBio Sequel進(jìn)行測序。將測序結(jié)果與 NCBI 基因庫比對，然后按照 97%相似性水平劃分操作分類單元（OTU），選取最優(yōu)序列作為代表性序列，基于OTU分析結(jié)果，對樣品在各個分類水平上進(jìn)行分類學(xué)分析，獲得樣品在門、綱、目、科、屬、種分類學(xué)水平上的物種分布柱狀圖［18］。利用QIIME軟件計算Alpha多樣性分析研究單個樣品物種豐度（richness）及物種多樣性（diversity）；Beta多樣性（beta diversity）分析比較不同樣品在物種多樣性方面存在的相似程度［19］。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 試驗數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2007軟件整理并用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。對不同處理組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素和一般線性模型分析，P＜0.05代表差異顯著，P＞0.05代表差異不顯著。

2 結(jié)果

2.1 苜蓿綠汁發(fā)酵液中菌株的分離鑒定

根據(jù)MRS培養(yǎng)基上乳酸菌的菌落形態(tài)差異及鈣溶圈比值大小，挑選Dd比值較大菌株共得到3株，分別為MXLZ-1、MXLZ-2、MXLZ-4，Dd比值分比為8.82、8.39、7.29。通過PCR擴(kuò)增菌株16S rDNA片段，測序結(jié)果經(jīng)BLAST同源性分析，選取親緣關(guān)系最近的13個菌株序列，采用MEGA7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖1所示。從圖中看出菌株MXLZ-1、MXLZ-2及MXLZ-4的16S rDNA序列分別與小片球菌（Pediococcus parvulus）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）及戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）同源性≧99%。因此，菌株MXLZ-1、MXLZ-2及MXLZ-4分別鑒定為P. parvulus、L. plantarum及 P.pentosaceus。

圖1 菌株16S rDNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of 16S rDNA gene sequence of strains

2.2 苜蓿青貯

在無菌條件下將菌株MXLZ-1、MXLZ-2、MXLZ-4分別接入100 mLMRS培養(yǎng)基，菌株K1、J1分別接入100 mL營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基培養(yǎng)，5種菌株發(fā)酵液按照1∶1∶1∶1∶1復(fù)配得到500 mL青貯菌劑GSSW。檢測GSSW青貯菌劑菌數(shù)為1.1×108g/mL。檢測苜蓿綠汁發(fā)酵液菌數(shù)為2.5×107g/mL。

2.3 苜蓿青貯營養(yǎng)成分變化

青貯時間及青貯添加劑對苜蓿營養(yǎng)品質(zhì)的影響如表2所示。從表中可以看出，添加菌劑3組DM及CP含量明顯高于CK組（P＜0.05）；隨青貯時間的延長，4組DM及CP含量顯著降低；YB組30 d DM含量達(dá)到最高為324 g/kg FM，GSSW組30 d CP含量達(dá)到最高為274 g/kg DM；與發(fā)酵前原料相比，YB與GSSW組CP含量顯著增加。在青貯過程中WSC含量變化較大，發(fā)酵30 d、50 d時除CK組外，其余3個組WSC含量降低，70 d后WSC又有所升高，70 d時GSSW組WSC含量為67.8 g/kg DM，高于其他3個組（P＜0.05）。添加菌劑GSSW組及YB組ADF、NDF值顯著低于CK組，隨著青貯時間的延長，添加菌劑3組ADF及NDF顯著降低，而CK組無明顯變化，50 d后ADF及NDF降低速度緩慢，GSSW組及YB組苜蓿青貯NDF值分別為284、260 g/kg DM，ADF分別為314、323 g/kg DM；青貯過程中除YB處理組LN值明顯的降低外，其余3組無明顯變化。

表2 青貯時間和青貯添加劑對苜蓿營養(yǎng)品質(zhì)的影響Table 2 Effect of time and silage additive on the nutritional quality of alfalfa silage

2.4 苜蓿青貯發(fā)酵特性及微生物的代謝產(chǎn)物變化

青貯時間及青貯添加劑對苜蓿發(fā)酵品質(zhì)的影響如表3所示。從表中可以看出，除CK組pH降低速度較慢外，其余3個組pH在發(fā)酵50 d后都能快速的降到5以下；在青貯70 d后GSSW組、YB組 及aFGJ組pH值 分 別 為4.20、4.25、4.80，添加GSSW、YB可有效降低青貯pH值，提高青貯品質(zhì)；GSSW組青貯pH的降低速度明顯高于aFGJ組。GSSW組氨氮/總氮含量明顯低于其他組；CK組氨氮含量明顯高于其他組。隨著青貯時間的延長，GSSW組乳酸含量呈現(xiàn)先降低后輕微升高，而乙酸含量降低的趨勢，在青貯50 d時，乳酸、乙酸含量分別為59.8、11.2 g/kg DM；YB組乳酸含量低于GSSW組而乙酸含量高于YB組；CK組在發(fā)酵30、50 d時乳酸含量無明顯的增加而在70 d后顯著增高（P＜0.05）；YB及GSSW組都未檢測到丁酸含量，aFGJ組檢測到丁酸含量明顯低于CK組（P＜0.05）。

表3 時間和添加劑對苜蓿青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響Table 3 Effect of time and silage additive on the fermentation quality of alfalfa silage

2.5 苜蓿青貯微生物群落分析

2.5.1 Alpha多樣性 不同處理組青貯樣品中的多樣性指數(shù)分析如圖2所示，Shannon稀釋曲線顯示曲線已經(jīng)趨于平坦，其覆蓋度均達(dá)到99%以上，表明樣本測序量已經(jīng)飽和，足夠反映樣本中絕大部分細(xì)菌物種的信息。

圖2 多樣本的香農(nóng)曲線Fig.2 Multi-samples Shannon curves

2.5.2 Beta多樣性分析 不同處理組青貯樣品PCoA分析如圖3所示。3個重復(fù)的樣品點聚集在一起，表示3個樣品重復(fù)性好，PC1貢獻(xiàn)率為81.1%，PC2的貢獻(xiàn)率為10.7%。CK組落在第一象限，GSSW組和YB組樣品落在第二象限，和其他組樣品的距離相對較遠(yuǎn)，GSSW組與YB組在物種上相似度較高。

圖3 多樣本的PCOA分析Fig.3 PCoA analysis of multi-samples

2.5.3 基于屬種水平細(xì)菌微生物群落結(jié)構(gòu)分析 12個樣品測序后通過Barcode識別后共獲得89 997條CCS 序列，每個樣品至少產(chǎn)生7 387條CCS序列，平均產(chǎn)生7 500條CCS序列。圖中顯示豐度水平前十的物種，并將其他物種合并為Other在圖中顯示。不同處理組青貯樣品屬水平微生物群落結(jié)構(gòu)如圖4-A所示，不同處理組青貯樣品屬種類和分布比例有顯著差異，4組屬水平豐度較高的屬均為Lactobacillis及Pediococcus；而添加3種菌劑的處理組，Lactobacillis豐度高于Pediococcus，CK組相反。不同處理組種水平微生物群落結(jié)構(gòu)如圖4-B所示，圖中豐度大于5%的種中GSSW組微生物群落為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum，92.95%）；YB組為植物乳桿菌（L. plantarum，85.50%）、戊糖 片 球 菌（Pediococcus pentosaceus，7.63%）；aFGJ組 為 植 物 乳 桿 菌（L. plantarum，50.55%）、戊糖 片 球 菌（P. pentosaceus，29.90%）、短 乳 桿 菌（Lactobacillus brevis，8.91%）；CK組為戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus，49.84%）、植物乳桿菌（L.plantarum，23.83%）、類腸膜魏斯氏菌（Weissella paramesenteroides，9.71%）、蒙氏腸球菌（Enterococcus mundtii，6.04%）。

圖4 樣品屬種水平微生物群落結(jié)構(gòu)Fig.4 Microbial community structure of samples on the genus and species level

不 同 處 理 組L. plantarum，P. pentosaceus，L.brevis及E. mundtii相對豐度差異顯著；添加3種菌劑的處理組L. plantarum 明顯高于CK組而P.pentosaceus明顯低于CK組；aFGJ組L.brevis明顯高于其他3組；在CK組中E. mundtii豐度明顯高于添加青貯菌劑的3組。

3 討論

3.1 苜蓿青貯菌劑的分類

青貯菌劑主要分為發(fā)酵促進(jìn)型添加劑、發(fā)酵抑制型添加劑、好氧性變質(zhì)抑制劑、營養(yǎng)性添加劑及吸附劑［20］。其中以乳酸菌類添加劑屬于發(fā)酵促進(jìn)型添加劑，通過調(diào)節(jié)微生物的種類及數(shù)量從而促進(jìn)其快速向低溫和低損失的發(fā)酵過程轉(zhuǎn)變。本實驗從綠汁發(fā)酵液中通過產(chǎn)酸能力強(qiáng)的3株菌株經(jīng)16S rDNA檢測及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建確定為P. pentosaceus、L. plantarum及P. parvulus，這一結(jié)果與Li等［21］等報道的綠汁發(fā)酵液中乳酸菌株包括L. plantarum、L.casei、L. brevis及Streptococcus faecalis等結(jié)果相符。綠汁發(fā)酵液通常會促生原料上附著的野生乳酸菌株，更適宜于苜蓿青貯。目前市售的青貯菌劑中除乳酸菌外還添加纖維素酶、淀粉酶等或產(chǎn)酶的芽胞桿菌菌株，Bai等報道［22］在苜蓿青貯中添加產(chǎn)生抗菌肽的B. subtilis可以改善青貯發(fā)酵品質(zhì)，提高有氧穩(wěn)定性。Rychen等［23］報道了在一定劑量下添加解B.belais可以改善青貯有氧穩(wěn)定性。因此，在GSSW菌劑中，除了添加來自綠汁發(fā)酵液中高產(chǎn)酸野生乳酸菌株外還添加了實驗室前期分離得到的產(chǎn)纖維素酶的B. belais K1及產(chǎn)淀粉酶的B. subtilis J1，調(diào)節(jié)苜蓿草營養(yǎng)成分及微生物的代謝組成。

3.2 苜蓿青貯營養(yǎng)及發(fā)酵品質(zhì)

青貯過程是一個復(fù)雜的微生物活動和生物化學(xué)變化問題，原料成分會隨著發(fā)酵不同階段微生物的生長而成變化。隨著青貯時間的延長，植物體類一系列的酶促反映都會造成蛋白質(zhì)的水解。70 d時GSSW組WSC含量高于其他3個組，菌劑的添加可以促進(jìn)飼草中纖維素類物質(zhì)的分解釋放出可被乳酸菌利用的糖，增加可發(fā)酵底物的量；青貯菌劑GSSW及YB組的添加可以提高原料中粗蛋白含量，快速降酸，減少干物質(zhì)及粗蛋白的損失，這一研究結(jié)果與Li等［24］報道的內(nèi)容一致。GSSW及YB組pH明顯低于CK及aFGJ組，菌劑的添加可以快速降低青貯PH，這與Mariott等［25］的研究結(jié)果相同。有機(jī)酸的總量及構(gòu)成可以反映青貯發(fā)酵品值，優(yōu)質(zhì)青貯飼料乳酸含量＞50 g/kg DM，并占總有機(jī)酸60%以上；乙酸含量10-40 g/kg DM；丁酸含量越少或不含丁酸。GSSW及YB組乳酸含量明顯高于CK組，菌劑的添加不僅可以使青貯早期產(chǎn)生較多酸，在青貯后青貯飼料中乳酸含量也高于一般青貯飼料，而丙酸乙酸含量明顯降低。優(yōu)質(zhì)的苜蓿青貯飼料氨態(tài)氮/總氮的比例應(yīng)＜15%。GSSW組氨氮/總氮含量明顯低于其他組，菌劑的添加可以減少蛋白質(zhì)的分解，降低氨態(tài)氮/總氮含量，這一結(jié)論與Liu等［26］的研究結(jié)果一致。GSSW及YB菌劑的添加對于調(diào)整苜蓿營養(yǎng)成和改善發(fā)酵品質(zhì)有著顯著地作用。

3.3 苜蓿青貯微生物群落結(jié)構(gòu)

在苜蓿青貯過程中微生物的組成與發(fā)酵產(chǎn)物的生產(chǎn)、青貯組分變化、青貯的品質(zhì)優(yōu)質(zhì)密切的關(guān)系。研究表明青貯發(fā)酵品質(zhì)與發(fā)酵過程的微生態(tài)演變密切相關(guān)［27］。4個處理組發(fā)酵70 d苜蓿青貯樣品中豐度較高的屬為Lactobacillis、Pediococcus、Weisella及Enterococcus，這與Tohno等［28］報道的青貯有關(guān)乳酸菌等相一致。GSSW組種水平乳酸菌株有植物乳桿菌（L. plantarum，92.95%）、戊糖片球菌（P.pentosaceus，2.36%）與GSSW菌劑中的菌株相符，說明GSSW菌劑中菌株可以在苜蓿青貯中大量繁殖，適宜于苜蓿青貯并發(fā)揮重要作用。GSSW菌劑復(fù)配時添加了芽胞桿菌屬菌株，但在青貯發(fā)酵70 d后未檢出，分析原因為發(fā)酵70 d已進(jìn)入發(fā)酵穩(wěn)定階段，厭氧條件下不適宜芽胞桿菌屬菌株生長，芽胞桿菌屬菌株主要是在青貯初期好氧發(fā)酵階段進(jìn)行繁殖。

添加菌劑處理組L. plantarum 明顯高于CK組而P. pentosaceus明顯低于CK組；L. plantarum屬于兼性異型發(fā)酵乳酸菌，相比于異型發(fā)酵乳酸菌可以更好地利用原料中的營養(yǎng)物質(zhì)，減少營養(yǎng)成分的損失。GSSW組相比于其他組L. plantarum相對豐度越高，產(chǎn)酸速度快，乳酸含量高，pH值降低，減少蛋白質(zhì)的分解，降低氨態(tài)氮含量，這一結(jié)果與GSSW組營養(yǎng)及發(fā)酵品質(zhì)數(shù)據(jù)相對應(yīng)。青貯70 d樣品中，添加GSSW菌劑及進(jìn)口菌劑YB組pH值分別為4.20、4.25，明顯低于CK組，乳酸含量分別為44.5 g/kg DM、52.3 g/kg DM，明顯高于CK組。Zhao等［29］報道L. plantarum是青貯中重要菌株，可以快速產(chǎn)酸，為其他乳酸菌的生長提供酸性環(huán)境。GSSW組及YB組微生物群落結(jié)構(gòu)中L. plantarum均占主要優(yōu)勢，而在自然青貯條件下P. pentosaceus占主要優(yōu)勢，這一實驗結(jié)果也驗證了L. plantarum對青貯pH，乳酸含量影響顯著。不同菌劑處理組中L. plantarum / P.pentosaceus值為GSSW組＞YB組＞aFGJ組，乳酸含量為GSSW組＞YB組＞aFGJ組，而pH及氨氮/總氮 為aFGJ組＞YB組＞GSSW組。L. plantarum / P.pentosaceus值與青貯乳酸含量呈正相關(guān)，與pH及氨氮/總氮呈負(fù)相關(guān)，比值越高，青貯品質(zhì)越佳。E.mundtii在CK組中相對豐度明顯高于添加菌劑3組，E. mundtii在發(fā)酵初期與乳酸菌競爭可溶性碳水化合物，減緩青貯的酸化，因此，CK組青貯品質(zhì)低于添加菌劑3組。正是由于發(fā)酵過程中有益乳酸菌群占據(jù)優(yōu)勢主導(dǎo)地位，生成一定量的乳酸從而使pH值快速下降，才使得上述腐敗菌被有效抑制，從而更好地保存發(fā)酵原料的營養(yǎng)物質(zhì)，青貯中微生物的種類及數(shù)量對于青貯品質(zhì)有著顯著地影響。

4 結(jié)論

添加青貯菌劑均能增加有益菌的數(shù)量，減少有害菌數(shù)量，改善苜蓿青貯發(fā)酵品質(zhì)。苜蓿青貯中L.plantarum及 P. pentosaceus的含量及比值對青貯優(yōu)良發(fā)酵品質(zhì)和組分變化起著重要作用。GSSW菌劑處理后青貯苜蓿品質(zhì)優(yōu)于與市場在售菌劑YB，可運用于苜蓿青貯。