崔欣雨 李榮榮 蔡瑞 王妍 鄭猛虎 徐春城
(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院,北京 100083)
苜蓿(Medicago sativa L.)是多年生豆科牧草,含有豐富的維生素和礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分,是當(dāng)今世界上分布最廣、栽培面積最大的牧草[1]。為實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期保藏和全年均衡供應(yīng),常將苜蓿制作成干草,然而在我國(guó)苜蓿種植地帶收割時(shí)伴隨有雨熱同期現(xiàn)象,苜蓿干草的制作過(guò)程中存在落葉與雨淋損失,實(shí)踐生產(chǎn)發(fā)現(xiàn)高水分青貯是解決上述問(wèn)題的理想措施。青貯依靠乳酸菌等有益菌迅速將青綠飼草中的可溶性碳水化合物轉(zhuǎn)化為有機(jī)酸,使青貯飼料pH值下降,從而有效地抑制了有害微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分的分解,其中乳酸是最主要的有機(jī)酸[2-3]。乳酸(C3H6O3)含羥基,酸度(pK=3.1)遠(yuǎn)高于揮發(fā)性脂肪酸(volatile fatty acid,VFA)酸度(pK=4.8),能夠產(chǎn)生酸香氣味,適量的乳酸可以刺激家畜食欲并顯著提高適口性,且能通過(guò)破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁增加細(xì)胞膜通透性導(dǎo)致內(nèi)容物流出,從而達(dá)到殺菌效果[4-6]。因此,乳酸對(duì)改善飼草青貯的風(fēng)味和維持青貯過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)的平衡具有重要作用。
乳酸不易揮發(fā),應(yīng)隨著青貯過(guò)程不斷積累,然而在一些飼草青貯研究中出現(xiàn)了乳酸含量下降的現(xiàn)象[7-9]。Muck等[10]提出,隨著干物質(zhì)的損失,其他微生物的活動(dòng)會(huì)造成已生成乳酸的降解與轉(zhuǎn)化。Lindgren等[11]也發(fā)現(xiàn),當(dāng)可溶性碳水化合物含量較低或不足時(shí),部分微生物會(huì)將乳酸代謝成其他有機(jī)產(chǎn)物。這類(lèi)能夠利用乳酸作為碳源或者電子受體的微生物稱(chēng)為乳酸降解菌,又叫乳酸利用菌,其體內(nèi)具有NAD-非依賴(lài)型乳酸脫氫酶(NAD-independent lactate dehydrogenases,iLDH)和乳酸氧化酶(lactate oxidase,LOX)等能代謝乳酸的酶[12]。乳酸氧化生成丙酮酸時(shí)所產(chǎn)生的電子通過(guò)電子傳遞鏈進(jìn)行氧化磷酸化能夠產(chǎn)生為微生物供給能量的ATP,這一途徑同時(shí)存在于部分原核微生物和真核微生物中。
有研究表明當(dāng)青貯原料中混入土壤、施用有機(jī)肥料或酸化緩慢時(shí),表面附著的腸桿菌屬、梭菌屬、芽胞桿菌屬和酵母中的一些乳酸降解菌就能發(fā)揮作用,其不僅能分解乳酸影響發(fā)酵品質(zhì),有些還能在開(kāi)封后代謝乳酸散發(fā)出大量熱量導(dǎo)致青貯料溫度上升,造成飼料變質(zhì)從而對(duì)動(dòng)物健康產(chǎn)生不利影響[13-14]。盡管人們已對(duì)青貯中乳酸降解的危害有一定認(rèn)識(shí),但是針對(duì)青貯中乳酸降解菌的研究較少。通過(guò)探究青貯中乳酸降解菌的降解性能和環(huán)境因子的耐受性,能夠更加全面地認(rèn)識(shí)青貯這一復(fù)雜的過(guò)程,從而提升苜蓿青貯的品質(zhì)。
1.1.1 苜蓿 來(lái)源于北京市農(nóng)林科學(xué)院國(guó)家精準(zhǔn)農(nóng)業(yè)示范基地(北京市昌平區(qū)),品種分別為Khan、Meizoo和Central,于2020年9月22日刈割第三茬初花期苜蓿,留茬高度5 cm。
1.1.2 培養(yǎng)基 培養(yǎng)基的配制和乳酸降解菌的分離、純化方法參考栗連會(huì)[15]。
乳酸鈉分離培養(yǎng)基(g/L):乳酸鈉20.0,酵母膏5.0,硫酸銨5.0,磷酸二氫鉀0.3,磷酸氫二鉀1.0,七水合硫酸鎂0.3,瓊脂粉20.0,pH值 6.8±0.2;
乳酸鈉發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):乳酸鈉20.0,酵母膏5.0,蛋白胨5.0,硫酸銨5.0,磷酸二氫鉀0.3,磷酸氫二鉀1.0,氯化鈉0.5,七水合硫酸鎂0.5,pH值 6.8±0.2。
生理生化培養(yǎng)基:西蒙氏枸櫞鹽培養(yǎng)基、乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基、蛋白胨水、葡萄糖發(fā)酵管和蔗糖發(fā)酵管均購(gòu)置于青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。
1.2.1 青貯調(diào)制 將刈割后的苜蓿迅速帶回實(shí)驗(yàn)室用鍘刀切短至1-2 cm,充分混勻后裝入青貯專(zhuān)用聚乙烯袋,每袋約300 g,用真空包裝機(jī)抽真空、封口后于室溫條件下避光貯藏。
1.2.2 測(cè)定指標(biāo)及方法 分別于3、7、14、21、28和56 d開(kāi)封,充分混勻并準(zhǔn)確稱(chēng)取10 g樣品放入滅菌后的聚乙烯袋中,加入90 mL蒸餾水充分混合,均質(zhì)器處理60 s后先用4層紗布過(guò)濾,再用定性濾紙過(guò)濾得到浸提液,每個(gè)處理重復(fù)3次。用pH計(jì)測(cè)定浸提液pH值;采用高效液相色譜法測(cè)定乳酸(lactic acid,LA)、乙 酸(acetic acid,AA)、丙 酸(propanoic acid,PA)和丁酸(butyric acid,BA)濃度[16]。
1.2.3 乳酸降解菌的分離和保存 稱(chēng)取開(kāi)封后的苜蓿青貯樣品10 g置于90 mL無(wú)菌生理鹽水中,充分震蕩后制作成10-1、10-2、10-3、10-4和10-5系列梯度的稀釋液,吸取10-1、10-3和10-5稀釋液至乳酸分離培養(yǎng)基上,用滅菌的涂布棒輕輕涂開(kāi),倒置于厭氧培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)72 h,每組重復(fù)3次。用接種環(huán)挑選單菌落,在乳酸分離培養(yǎng)基上劃線(xiàn)并置于37℃厭氧培養(yǎng)48 h,重復(fù)至出現(xiàn)單菌落。將純化后的單菌落接種到乳酸鈉發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h,將能使培養(yǎng)基變渾濁的菌株進(jìn)行甘油保藏,按照分離的時(shí)間和順序進(jìn)行編號(hào)。
1.2.4 乳酸降解率的測(cè)定 采用磷酸緩沖溶液調(diào)整乳酸鈉發(fā)酵培養(yǎng)基pH值至6.2,將挑選出的乳酸降解菌株按照105CFU/mL的接種量接種到培養(yǎng)基中,在30℃下厭氧培養(yǎng)120 h,采用對(duì)羥基聯(lián)苯比色法[17]測(cè)定發(fā)酵液發(fā)酵前后乳酸含量,并計(jì)算乳酸降解率:
1.2.5 乳酸降解菌株的鑒定 進(jìn)行菌落形態(tài)的觀(guān)察,并采用增強(qiáng)革蘭氏染色液(上海源葉生物科技有限公司)進(jìn)行革蘭氏染色觀(guān)察,再利用生理生化鑒定管(青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行糖發(fā)酵試驗(yàn)和IMViC試驗(yàn)(包括吲哚實(shí)驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、乙酰甲基甲醇試驗(yàn)和檸檬酸鹽利用試驗(yàn)),參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》對(duì)菌株進(jìn)行生理生化特征分析。采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)提取細(xì)菌DNA并作為模板,引物為正向引物:27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')及反向引物:1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'),PCR反應(yīng)體系和PCR反應(yīng)過(guò)程參考白文華[18]的方法,PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度約為1 400 bp。將擴(kuò)增成功的PCR 產(chǎn)物送北京博邁德生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序,獲得的待測(cè)菌株序列利用BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)工具與GenBank中的標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行對(duì)比,并用Mega 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。
1.2.6 乳酸降解菌的降解性能 菌液密度(OD600)采用比濁法測(cè)定;采用2,4-二硝基苯肼比色法測(cè)定NAD-非依賴(lài)型乳酸脫氫酶和乳酸氧化酶的活性[19-20]。采用島津氣相色譜儀檢測(cè)酸類(lèi)代謝產(chǎn)物(條件:色譜柱30 m×0.25 mm×0.25 μm的RTX-WAX,檢測(cè)器為FID)[21]。
1.2.7 生長(zhǎng)耐受性實(shí)驗(yàn) 采用單因素試驗(yàn)研究溫度(20、25、30和35℃)、pH值(4.5、5.0、5.5、6.0、6.5和7.0)、乳酸鈉濃度(10、20、30 和40 g/L)和葡萄糖濃度(10、20和30 g/L)對(duì)菌株降解乳酸能力的影響,接種量為106CFU/mL,厭氧培養(yǎng)120 h后計(jì)算乳酸降解率。
1.2.8 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 23.0軟件、Microsoft Excel 2016軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析,P<0.05代表數(shù)據(jù)存在顯著性差異;采用Origin 2021b軟件作圖。
3個(gè)品種苜蓿的青貯pH值隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)顯著下降(P<0.05),且前3 d下降速度最快并均降至6.1左右。Khan和Meizoo的青貯pH值分別在3-7 d和7-14 d出現(xiàn)回升,而Central的青貯pH值在青貯過(guò)程中持續(xù)下降(圖1)。
圖1 苜蓿青貯過(guò)程pH值的動(dòng)態(tài)變化Fig.1 Dynamic changes of pH during alfalfa silage
乳酸、乙酸、丙酸均在青貯的前7 d快速積累,乙酸的含量最高,丙酸含量低于乙酸和乳酸,丁酸含量在前28 d均在檢出線(xiàn)以下。青貯7 d后3個(gè)品種的乳酸含量隨著時(shí)間延長(zhǎng)無(wú)顯著變化(P>0.05),Khan的乳酸含量在14 d達(dá)到最高值后不斷下降,Meizoo和Central的乳酸含量在7 d后先減少后增加。3個(gè)品種的乙酸含量沒(méi)有顯著差異(P>0.05)且均呈現(xiàn)緩慢增加的狀態(tài),其中Khan的乙酸含量最高,在發(fā)酵結(jié)束后達(dá)到23.05 g/kg DM(表1)。
表1 苜蓿青貯過(guò)程中有機(jī)酸含量的動(dòng)態(tài)變化Table 1 Dynamic changes of organic acids content during alfalfa silage
2.2.1 乳酸降解菌的篩選 青貯過(guò)程中共分離得到75株乳酸降解菌,根據(jù)分離時(shí)間將其編號(hào)為RSF1-RSF31(0 d-7 d)、RSM1-RSM20(14 d-21 d)、RSH1-RSH24(28 d-56 d)。依據(jù)純化菌落的顏色、形態(tài)、革蘭氏染色試驗(yàn)、糖發(fā)酵試驗(yàn)及IMViC試驗(yàn)將75株菌進(jìn)行分組(表2)。
表2 乳酸降解菌的分組情況Table 2 Grouping of lactic acid degrading bacteria
從A-U組中各選出一株代表菌株,依次測(cè)定乳酸降解率,降解率最高的RSM9達(dá)到44.64%,最低的RSF24只有10.22%。其中RSM9、RSF15、RSH16和RSF2的降解率分別為44.64%、33.86%、33.35%和30.64%,均超過(guò)30%(圖2)。
圖2 各組代表性菌株的乳酸降解率Fig.2 Degradation rate of lactic acid by representative strains in each group
2.2.2 乳酸降解菌的形態(tài)特征 4株菌的菌落顏色、形態(tài)等存在差異,但均能在LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)繁殖,且均為革蘭氏陰性菌(圖3)。其中RSM9在分離培養(yǎng)基中呈白色不透明的圓形菌落,表面凸起,邊緣整齊,具有一定的黏性;RSF15菌落為扁平的黃色同心圓菌落,邊緣整齊且沒(méi)有黏性;RSF2菌落為白色不透明圓形,菌落凸起,邊緣整齊,具有黏性;RSH16為較小的白色圓形菌落,表面凸起且濕潤(rùn),邊緣整齊,具有一定的黏性。
圖3 菌株菌落形態(tài)及革蘭氏染色結(jié)果Fig.3 Colony morphology and Gram staining of each strain
2.2.3 乳酸降解菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù) RSM9、RSF15、RSF2和RSH16的片段長(zhǎng)度 分 別為1 409、1 375、1 410和1 403 bp,將 其 序 列 與Genbank中 的 模式菌株相關(guān)序列進(jìn)行比對(duì),選擇與其序列相似度>99%的菌種進(jìn)行親緣關(guān)系的比較并制作系統(tǒng)發(fā)育 樹(shù)(圖4)。其 中 菌 株RSM9、RSF15、RSF2和RSH16分 別 與Hafnia paralvei、Proteus columbae、Obesumbacterium proteus和Citrobacter cronae構(gòu) 成同一進(jìn)化分支,bootstrap值均大于90%。結(jié)合生理生化試驗(yàn)確定RSM9為哈夫尼菌(Hafnia sp.),RSF15屬于變形菌(Proteus sp.),RSF2屬于肥桿菌(Obesumbacterium sp.),RSH16為 檸 檬 酸 桿 菌(Citrobacter sp.)。四者的GenBank登錄號(hào)依次為MW 793477、MW 793478、MW 793479和MW 793480。
圖4 4株乳酸降解菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of 4 lactic acid degrading strains
厭氧培養(yǎng)120 h后RSM9菌株的OD600達(dá)到0.989,生長(zhǎng)情況最好。接種4種菌的發(fā)酵液的pH值均增加,其中RSM9組的pH值最大為6.76。RSM9、RSF15和RSF2菌株能夠分泌NAD-非依賴(lài)型乳酸脫氫酶和乳酸氧化酶,而RSH16菌株沒(méi)有測(cè)定到乳酸氧化酶活性。4株菌的酸類(lèi)代謝產(chǎn)物主要是乙酸和丙酸,只有RSM9能代謝產(chǎn)生丁酸,根據(jù)測(cè)定結(jié)果計(jì)算4株菌的酸類(lèi)代謝產(chǎn)物大約占降解物總量的15%-40%(表3)。
表3 4株乳酸降解菌的代謝特征Table 3 Metabolic characteristics of 4 strains of lactic acid degrading bacteria
2.4.1 培養(yǎng)溫度 4株菌溫度適應(yīng)性強(qiáng),其中RSM9在各溫度段乳酸降解率均較高,在35℃環(huán)境下降解率達(dá)到41.81%、RSF15、RSF2和RSH16在20℃降解率最高,分別為21.90%、23.67%和21.21%,當(dāng)溫度大于25℃時(shí),溫度的增加會(huì)提高乳酸降解率。(圖5-A)。
2.4.2 pH值 在弱酸性環(huán)境下4株菌的乳酸降解能力要好于中性環(huán)境,當(dāng)pH值降至5.0以下時(shí)不利于乳酸降解菌的代謝。其中菌株RSM9在pH≥6.0時(shí)表現(xiàn)出良好的乳酸降解能力,乳酸降解率高于其他3株菌,RSF15和RSF2在pH值為5.5時(shí)乳酸降解率最大分別為25.51%和21.15%,pH值在5.5-7.0時(shí)RSH16的乳酸降解率受pH值變化影響較?。▓D5-B)。
圖5 環(huán)境因子對(duì)菌株乳酸降解率的影響Fig.5 Effects of environmental factors on the degradation rate of lactic acid
2.4.3 乳酸鈉濃度 總體上乳酸降解率隨著乳酸濃度的增加而降低,當(dāng)乳酸鈉濃度為10 g/L時(shí)4株菌的乳酸降解率最高,RSM9最高達(dá)到65.76%,其他3株菌的乳酸降解率均在30%以上。4株乳酸降解菌均能夠耐受40 g/L的乳酸,在其中表現(xiàn)最好的是RSM9,RSF2的降解率最低僅為13.66%(圖5-C)。2.4.4 葡萄糖濃度 在培養(yǎng)基中添加葡萄糖后的結(jié)果如圖5-D所示。當(dāng)添加10 g/L葡萄糖時(shí)4株菌的乳酸降解率最高分別為22.95%、23.75%、20.81%和28.29%。隨著葡萄糖濃度的增加乳酸降解率降低,當(dāng)葡萄糖濃度增加到30 g/L以上時(shí),乳酸降解菌幾乎不再降解乳酸。
本研究采用3個(gè)品種的苜蓿進(jìn)行青貯試驗(yàn),苜蓿較高的緩沖能和較低的含糖量導(dǎo)致三者經(jīng)過(guò)56 d發(fā)酵后pH值均未達(dá)到理想水平[22-23]。在青貯的前7 d,由于新鮮苜蓿原料在切碎密封后仍有少量氧氣存在,且初始pH較高,對(duì)微生物的抑制效果差,從而附著在原料上的乳酸菌與其他微生物競(jìng)爭(zhēng)糖類(lèi)底物進(jìn)行生長(zhǎng)代謝,使得原料所含有的可溶性碳水化合物被迅速消耗并轉(zhuǎn)化成有機(jī)酸,造成青貯前期乳酸、乙酸和丙酸的快速積累。然而隨著貯藏時(shí)間進(jìn)一步的延長(zhǎng)出現(xiàn)乳酸緩慢減少的現(xiàn)象,Khan和Meizoo品種的青貯pH值甚至回升,這與Tao等[24]單獨(dú)青貯苜蓿的結(jié)果相一致。
青貯過(guò)程中有機(jī)酸含量處于動(dòng)態(tài)變化中,其中乳酸、乙酸、丙酸和丁酸是青貯中重要的有機(jī)酸。乳酸是一種不易揮發(fā)的有機(jī)酸,不會(huì)隨著開(kāi)封逸出,因此其減少的主要原因是乳酸的生成量低于降解量。乳酸在7-14 d達(dá)到最大值的同時(shí)可溶性碳水化合物含量處于較低水平,此時(shí)乳酸降解菌開(kāi)始利用乳酸進(jìn)行代謝從而造成乳酸的消耗。本研究的結(jié)果表明4株菌的酸類(lèi)代謝產(chǎn)物主要是乙酸,其次是丙酸和己酸。乳酸的羧基電離后產(chǎn)生的負(fù)離子可以與α位的羥基形成分子內(nèi)氫鍵,從而使負(fù)離子穩(wěn)定性更高,相比于乙酸等揮發(fā)性有機(jī)酸具有更強(qiáng)的酸性,故而乳酸降解后pH值會(huì)回升。除了酸類(lèi)代謝產(chǎn)物外,有研究顯示乳酸降解菌代謝產(chǎn)物還包括醛類(lèi)、醇類(lèi)和酯類(lèi)等有機(jī)物[15]。
目前在酒醅、反芻動(dòng)物的瘤胃液以及豬的腸道中均分離出部分乳酸降解菌,已報(bào)道能夠降解乳酸的有丙酸桿菌屬、脫硫弧菌屬、固氮菌屬、梭菌屬、韋榮氏球菌屬、巨球型菌屬、芽胞桿菌屬和真桿菌屬等多個(gè)屬的一些種,其中部分菌株能夠很好地利用乳酸生長(zhǎng)和繁殖[25-27]。與以往分離得到的菌屬不同,本研究分離得到的菌株均屬于兼性厭氧型腸桿菌科細(xì)菌,常見(jiàn)于土壤和動(dòng)物腸道,其在青貯過(guò)程中降解乳酸的能力未被廣泛報(bào)道。試驗(yàn)表明4株菌都具有NAD-非依賴(lài)型乳酸脫氫酶活力,可在厭氧環(huán)境下將乳酸氧化為丙酮酸,并進(jìn)一步分解用于氧化磷酸化供給細(xì)胞能量[28]。而乳酸氧化酶是一種黃素蛋白酶,以黃素核苷酸作為輔因子,無(wú)需外加輔因子,但需要氧氣參與才能完成乳酸代謝,當(dāng)青貯料開(kāi)封后此類(lèi)微生物若大量繁殖或會(huì)引起有氧變質(zhì)[29-30]。
夏光亮等[31]研究表明,生長(zhǎng)環(huán)境的pH值、培養(yǎng)基底物類(lèi)型、乳酸的濃度和構(gòu)型等都對(duì)乳酸的降解有顯著的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明當(dāng)葡萄糖濃度較高時(shí)乳酸降解率較低,這是由于微生物會(huì)優(yōu)先消耗容易利用的速效碳源,微生物代謝糖類(lèi)的過(guò)程會(huì)抑制乳酸向丙酮酸轉(zhuǎn)化時(shí)乳酸脫氫酶的活性[32-33]。當(dāng)乳酸鈉濃度為10 g/L、pH值高于5.0時(shí)乳酸降解率較高,這與乳酸降解發(fā)生在苜蓿青貯的7-14 d時(shí)間點(diǎn)相吻合。4株菌的溫度適應(yīng)性強(qiáng)(20-35℃),乳酸降解能力受溫度影響小,35℃下的降解能力要好于25℃和30℃,且RSM9在35℃時(shí)的乳酸降解率最高能達(dá)到41.81%。李榮榮等[34]研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)貯藏溫度為35℃時(shí),隨著發(fā)酵進(jìn)行苜蓿青貯中乳酸含量顯著降低,可能與這一溫度下乳酸降解菌的代謝有關(guān)。
從苜蓿青貯中分離獲得4株能代謝乳酸的革蘭氏陰性細(xì)菌RSM9、RSF15、RSF2和RSH16,經(jīng)鑒定分別為哈夫尼菌(Hafnia sp.)、變形菌(Proteus sp.)、肥 桿 菌(Obesumbacterium sp.)和 檸 檬 酸 桿菌(Citrobacter sp.)。4株菌在乳酸鈉發(fā)酵培養(yǎng)基中經(jīng)30℃厭氧培養(yǎng)120 h后的乳酸降解率分別達(dá)到44.64%、33.86%、30.64%和33.35%,酸類(lèi)代謝產(chǎn)物主要是乙酸和丙酸。這類(lèi)微生物能夠在可溶性碳水化合物含量顯著減少、乳酸積累的苜蓿青貯的第7-14天發(fā)揮作用,通過(guò)代謝乳酸進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖,造成青貯體系的pH回升。4株菌均為兼性厭氧型細(xì)菌,溫度適應(yīng)性強(qiáng),但不耐酸,當(dāng)pH<5.0時(shí)生長(zhǎng)活性被抑制。