江迪 徐春城

（1. 河南工業(yè)大學糧油食品學院，鄭州 450001；2. 中國農業(yè)大學工學院，北京 100083）

畜牧業(yè)是我國現代農業(yè)的重要組成部分，隨著我國人民生活水平的不斷提高，人們對肉蛋奶等畜產品的需求量越來越大。2019年全年肉蛋奶產量約為1.4億t，其中牛奶產高達3 201萬t，與2018年相比增長4.1%，同比增長率創(chuàng)下了近5年的新高［1］。畜產品需求量的穩(wěn)步增長促使我國飼料糧的需求量不斷增加，糧食的供求長期處于緊平衡狀態(tài)，其中飼料用糧占糧食消費的40%以上，超過人對糧食的消費，“人畜爭糧”問題嚴重［1-2］。因此，為了緩解飼料糧對我國糧食產業(yè)的巨大壓力，減少畜牧業(yè)對糧食的依賴，加強非常規(guī)飼料資源的開發(fā)利用對促進我國畜牧業(yè)的發(fā)展至關重要。我國非常規(guī)飼料資源豐富每年近40億t。然而這些飼料資源通常因為水分含量高、營養(yǎng)成分不均衡、適口性差、消化率低等問題導致其應用范圍受到限制［3］。發(fā)酵全混合日糧（total mixed ration silage，TMR）作為一種在TMR調制加工技術上發(fā)展起來的新型飼喂技術，其推廣和普及能夠有效利用非常規(guī)飼料資源，緩解飼料資源短缺制約我國畜牧業(yè)穩(wěn)定發(fā)展的難題［4］。由于發(fā)酵TMR厭氧發(fā)酵過程中的環(huán)境復雜，其微生物組成也多種多樣。因此飼料中的微生物組成對飼料的發(fā)酵品質及有氧穩(wěn)定性都有重要作用。本文通過綜合閱讀近些年國內外關于發(fā)酵TMR研究的文獻，對TMR發(fā)酵過程及有氧狀態(tài)下的微生物種群進行分析，初步總結了發(fā)酵TMR應用及其微生物種群多樣性的研究現狀。

1 發(fā)酵TMR技術及應用

1.1 發(fā)酵TMR的加工工藝

發(fā)酵TMR是根據家畜不同生產階段的營養(yǎng)需要和飼料原料的營養(yǎng)價值，設計科學合理的日糧配方，經過乳酸菌厭氧發(fā)酵調制而成的一種營養(yǎng)平衡的日糧。日本早在20世紀90年代開始發(fā)酵TMR技術的研究，通過該方法使高水分食品副產物等非常規(guī)飼料能夠長期貯藏并有效利用。發(fā)酵TMR技術融合了TMR技術與青貯技術，不僅能夠有效保全了TMR的營養(yǎng)成分，同時發(fā)酵產生的生物活性物質又增加了飼料的附加價值［5］。由于飼料的質量通常會直接影響奶牛的產奶量、乳品質、泌乳年限及奶牛健康，因此，需要根據奶牛生長階段的營養(yǎng)需求對配方進行嚴格的設計。一般來說，用于調制發(fā)酵TMR的原料主要包括以下飼料（表1）。我國每年有大量的糟渣、秸稈等農產品加工副產物產生，然而利用率都不高，不但造成資源的浪費，同時還污染環(huán)境。利用農產品加工副產物調制發(fā)酵TMR能夠充分開發(fā)利用非常規(guī)飼料資源，在一定程度上解決我國飼料糧資源的不足，緩解人畜爭糧的矛盾，保護環(huán)境。利用高水分的農產品加工副產物與其他原料混合后制備發(fā)酵TMR，不僅能夠有效保存原料中的營養(yǎng)成分、提高有機酸、酶、維生素等功能性成分的含量，加之TMR的發(fā)酵品質良好，而且有氧穩(wěn)定性得到顯著提高，促進了發(fā)酵TMR的商品化流通［6］。

表1 發(fā)酵TMR的原料組成Table 1 Raw material composition of TMR silage

1.2 發(fā)酵TMR的生產應用

在我國，規(guī)?；鲆呀洸捎肨MR 飼喂技術。TMR 飼喂方式能夠有效避免奶牛挑食和營養(yǎng)失衡狀況的發(fā)生；而且能夠增強瘤胃機能，維持瘤胃pH穩(wěn)定，降低奶牛發(fā)病率。發(fā)酵TMR作為一種在TMR調制加工技術上發(fā)展起來的新型飼喂技術，不僅能夠提高飼料適口性，同時能夠進一步提高飼料價值，保證奶牛機體健康，提高奶制品品質。研究發(fā)現，奶牛飼喂發(fā)酵TMR后，干物質采食量（DMI）相比于對照組有了顯著的提升；同時，4%的標準乳、乳蛋白和乳糖均提高了10%以上，這些結果表明發(fā)酵TMR 對營養(yǎng)物質在反芻動物消化吸收的過程中均具有較好促進效果［7］。以咖啡渣、蘑菇渣、桃渣等農產品加工副產物替代部分精料、干草等常規(guī)原料調制TMR，經過發(fā)酵后，其乳酸含量顯著提高、pH和氨態(tài)氮含量顯著降低，顯著改善了TMR的發(fā)酵品質；提高了發(fā)酵TMR的適口性、增加了家畜的干物質采食量；且不影響發(fā)酵TMR的營養(yǎng)物質消化率及可消化養(yǎng)分總量和消化能；對家畜的血液指標、瘤胃發(fā)酵性狀無不良影響，同時，像綠茶飲料渣等還能提高家畜的免疫性能［8-11］?？梢?，使用高水分副產物代替部分原料制備發(fā)酵TMR，不僅能夠得到品質較好的發(fā)酵飼料，而且能夠降低生產成本，增加經濟效益。一些營養(yǎng)成分較少，適口性差的作物秸稈單獨作為飼料使用時，其能量和消化率都比較低，然而當使用這類原料與副產物共同調制TMR發(fā)酵后，能夠有效保持其營養(yǎng)成分，提高飼喂價值［12-14］。而且，與某一原料單獨青貯相比，將其與其他原料混合調制發(fā)酵TMR后無論適口性還是貯藏性都得到了較大的提高［15］。苜蓿是奶牛等草食動物的重要優(yōu)質飼草，但由于水分含量高，可溶性碳水化合物含量低，緩沖能較高，青貯過程中極易發(fā)生丁酸發(fā)酵，導致飼草品質下降。而將新鮮苜蓿與玉米粉、豆?jié){渣、豆粕、預混料等混合調制發(fā)酵TMR后，有效解決了苜蓿難以獲得優(yōu)質青貯的技術瓶頸［16］。此外，TMR暴露在空氣中48 h內即發(fā)生好氧變質，而發(fā)酵TMR暴露在空氣中7 d內無顯著變化，表現出相當好的有氧穩(wěn)定性；且隨著發(fā)酵時間的延長，有氧穩(wěn)定性顯著增強［17-18］。

2 發(fā)酵TMR好氧變質及其微生物影響因素

2.1 發(fā)酵TMR好氧變質

TMR厭氧發(fā)酵過程是一個微生物主導的復雜生物化學過程。TMR經過厭氧發(fā)酵后，以乳酸菌為主的有益菌，將飼料中的可溶性糖轉化為以乳酸為主的有機酸，迅速降低pH，抑制其他好氧微生物對飼料營養(yǎng)成分的降解作用，從而使飼料得到很好的保存。當發(fā)酵TMR開封后暴露在空氣中，好氧微生物在有氧狀態(tài)下快速增殖，飼料中的發(fā)酵酸和其他底物會被酵母、好氧細菌及霉菌利用，導致飼料發(fā)熱、pH升高、營養(yǎng)物質損失而發(fā)生變質［19］。發(fā)生變質的飼料干物質損失嚴重，其營養(yǎng)價值會隨著發(fā)酵產物的消耗而降低［20-21］。同時，由于有害微生物的孢子以及代謝過程中毒素的積累［22-25］，奶牛的健康和牛奶的品質也會受到不良影響，進而影響新鮮牛奶和奶制品的安全［5，26-28］。

2.2 好氧變質過程中的微生物影響因素

發(fā)酵TMR的好氧變質一般經歷3個階段［27］，當氧氣進入到飼料后，酵母首先利用發(fā)酵過程中產生的有機酸和殘存的可溶性糖大量繁殖，快速提高飼料的溫度和pH，為其他微生物的生長提供有利環(huán)境［24］；隨著pH的升高，好氧細菌開始增殖，進一步消耗飼料中的營養(yǎng)成分，升高飼料溫度；最后，霉菌在表面大量生長，飼料完全變質［19］。發(fā)酵TMR發(fā)生好氧變質的過程中一般會出現兩個溫度高峰［29］，第一個溫度高峰與酵母菌或者好氧乙酸菌的生長增殖有關，第二個溫度高峰則反映了霉菌的生長［27］。Wang等［15］在對全株玉米發(fā)酵TMR好氧變質過程中的溫度監(jiān)測中發(fā)現，整個過程中共檢測到了兩個溫度高峰，第一個溫度高峰與最大酵母數量一致，且在有氧狀態(tài)下檢出了數量較高的好氧細菌，表明需氧細菌在后期降解中的作用。發(fā)酵TMR在有氧變質的過程中，乳酸等發(fā)酵酸被迅速代謝，飼料pH快速升高，從而引起梭狀芽胞桿菌的增殖，導致蛋白質和碳水化合物的大量損失。梭狀芽胞桿菌（Clostridium）一般是嚴格厭氧或者微需氧的芽胞桿菌，當好氧細菌利用乳酸產生酸性終產物較少時，飼料的pH顯著增加，一些兼性厭氧微生物進一步消耗氧氣和發(fā)酵終產物，在飼料局部形成一個厭氧高pH的小環(huán)境，為梭狀芽胞桿菌的生長提供有利條件，使其在好氧變質過程中數量增加，加速好氧變質發(fā)生［30］。而霉菌的大量出現意味著飼料中的乳酸含量較低，pH較高，此時飼料發(fā)生變質，失去飼喂價值［31］。其中，酵母被認為是好氧變質過程中最重要的微生物［24］。由于酵母喜在糖分高的偏酸環(huán)境中生長，因此雖然在厭氧發(fā)酵過程其生長會受到抑制，一旦飼料開封后，充足的底物和適宜的環(huán)境使酵母首先快速增值，提高飼料pH，為其他好氧微生物的生長提供有利環(huán)境。因此，在發(fā)酵過程中存活下來的酵母菌被認為是引起飼料好氧變質的主要微生物［24］。Beck等［32］認為酵母是導致青貯飼料發(fā)生好氧變質的主要微生物因素，當青貯飼料中的酵母數量高于105CFU/g FM時，青貯飼料更容易發(fā)生好氧變質［33］。許多研究表明，開封時酵母菌的數量是影響青貯飼料有氧穩(wěn)定性的重要因素，且隨著酵母菌數量的減少，有氧穩(wěn)定性增強［28，34-35］。然而Hu等［10］對發(fā)酵TMR有氧穩(wěn)定性的研究發(fā)現，以苜蓿為主要原料調制的TMR經過56 d發(fā)酵后，雖然酵母菌的數量達到104CFU/g FM以上，但發(fā)酵TMR在6 d內并未發(fā)生好氧變質。因此，可以推測開封時酵母的種類比數量對有氧穩(wěn)定性的影響更大。一般來說，在發(fā)酵過程及有氧狀態(tài)下被檢出的酵母種類有很多（表2）。與好氧變質有關的酵母按照其生理特征可以分為兩組，第一組是具有較高糖發(fā)酵能力的酵母，如Saccharomyces cerevisiae和Torulopsis spp.；第二組是具有高有機酸親和力的酵母，如Candida、Issatchenkia、Pichia、Hansenula和Endomycopsis［36］。其中，Pichia和Candida由于其高乳酸同化能力和高葡萄糖親和能力而在好氧變質過程中檢出率較高［24］。這類酵母往往是影響飼料好氧變質的關鍵因素。

表2 發(fā)酵過程及有氧狀態(tài)下的主要酵母Table 2 Main yeasts during ensiling and aerobic exposure

3 發(fā)酵TMR中的微生物種群多樣性

3.1 TMR發(fā)酵過程微生物種群的動態(tài)變化

發(fā)酵TMR中的微生物組成對飼料的發(fā)酵品質及有氧穩(wěn)定性均具有重要的影響。針對發(fā)酵TMR中微生物種群多樣性的研究一直都是研究的熱點。對不同季節(jié)不同地域發(fā)酵TMR中的微生物組成進行分析發(fā)現，大部分發(fā)酵TMR中，芽胞桿菌和好氧細菌的數量在發(fā)酵過程中略有降低；酵母隨著發(fā)酵時間的延長，其生長逐步受到抑制；7 d后霉菌數量降至檢出限以下［37］。乳酸菌是TMR發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌，在厭氧發(fā)酵過程中的種類較多（表3）。其中，在厭氧發(fā)酵前期的乳酸菌主要為Lactobacillus casei、Lactobacillus brevis、Tetragenococcus halpphilus、Lactobacillus buchneri、Lactobacillus plantarum、Pediococcus pentosaceus、Weissella paramesenteroides和Pediococcus acidilactici，而 到 了 發(fā) 酵 后 期，Lactobacillus代替Lactococcus成為發(fā)酵TMR中的優(yōu)勢乳酸菌［10，38］。TMR發(fā)酵過程中微生物種群常常與營養(yǎng)成分的降解密切相關。半纖維素的降解通常發(fā)生在厭氧發(fā)酵早期，Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus licheniformis、Bacillus subtilis、Bacillus pumilus和Paenibacillus xylanexedens是 降 解 半 纖維素的主要微生物；B. amyloliquefaciens、Bacillus cereus、B. licheniformis、B. subtilis、Bacillus flexus和P.xylanexedens在發(fā)酵前期與淀粉的降解密切相關，而Enterococcus faecium是發(fā)酵后期降解淀粉的主要微生物［39］；降解蛋白的細菌主要屬于Curtobacterium和Paenibacillus，其中Curtobacterium flaccumfaciens、Paenibacillus amylolyticus、Paenibacillus borealis、P.xylanexedens和Paenibacillus turicensis為 發(fā) 酵TMR中微生物蛋白酶的主要來源；到了發(fā)酵后期，E.faecium成為發(fā)酵TMR中降解蛋白的主要細菌［40］。發(fā)酵TMR中酵母隨著發(fā)酵時間的延長其生長逐漸受到抑制，而開封后檢出的酵母通常被認為是導致好氧變質的主要微生物。Pichia kudriavzevii、Kazachstania exigua、Kluyveromyces marxianus和Candida milleri常常在發(fā)酵TMR中被檢出，抑制K.marxianus和P. kudriavzevii的生長能夠在一定程度上改善發(fā)酵TMR的有氧穩(wěn)定性［38，41］。

表3 厭氧發(fā)酵過程的常見乳酸菌Table 3 Main lactic acid bacteria during ensiling

近年來，隨著分子生物學技術的飛速發(fā)展，高通量測序技術（high-throughput sequencing）被廣泛用于發(fā)酵TMR微生物種群多樣性的研究，使得我們對發(fā)酵過程的微生物種群有了進一步了解。Pediococcus、Lactobacillus等乳酸菌屬的相對豐度通常在發(fā)酵過程中顯著增加，抑制了Erwinia、Pseudomonas等有害細菌相對豐度的增長；隨著發(fā)酵時間的延長，Cryotococcus、Pseudozyma等真菌菌屬的相對豐度逐漸降低，真菌的生長逐漸受到抑制；許多發(fā)酵TMR開封時酵母和霉菌的數量處于檢出限以下，而通過高通量測序技術發(fā)現，Pichia、Candida、Aspergillus和Phanerochaete均能夠在開封時被檢出，其相對豐度隨著發(fā)酵時間的延長顯著增加［16，18］。

3.2 發(fā)酵TMR有氧狀態(tài)下的微生物種群多樣性

開封后，發(fā)酵TMR中的無氧環(huán)境由于氧氣的進入發(fā)生變化，飼料中的微生物組成隨之改變。發(fā)酵TMR在有氧狀態(tài)下的細菌種群沒有顯著變化，Lactobacillus、Pediococcus和Erwinia無論在原料、發(fā)酵過程還是有氧狀態(tài)下均能夠被檢出［16，42］。Pichia、Cryptococcus和Candida是有氧狀態(tài)下的主要酵母，其中Pichia與發(fā)酵TMR的好氧變質密切相關，P.kudriavzevii和Pichia manshurica均被認為是導致發(fā)酵TMR好氧變質的主要酵母，抑制Candida humilis在一定程度上夠提高發(fā)酵TMR的有氧穩(wěn)定性；而在一些長期發(fā)酵的TMR中，Zygosaccharomyces bailii被認為是引發(fā)好氧變質的主要酵母［17-18，41，43］。霉菌一般出現在有氧狀態(tài)后期，Cladosporium、Alternaria、Aspergillus和Monascus均是有氧狀態(tài)下常見的霉菌屬；當發(fā)酵TMR好氧變質后，Monascus的相對豐度能夠達到80%以上，為發(fā)酵TMR中的主要真菌［16，18，44］。

4 總結與展望

發(fā)酵TMR技術的普及和推廣對于提高非常規(guī)飼料資源的利用效率，解決飼料資源短缺問題具有重要意義。而關于發(fā)酵TMR有氧穩(wěn)定性及其微生物種群多樣性的研究對促進發(fā)酵 TMR技術的推廣至關重要。目前，通過傳統(tǒng)分離純化技術、DGGE技術以及高通量測序技術對發(fā)酵TMR發(fā)酵過程及有氧狀態(tài)下的微生物種群多樣性進行了一系列的研究并取得了一定的研究結果，但是仍存在一定的不足。傳統(tǒng)微生物分離鑒定方法由于實驗室培養(yǎng)條件及微生物生長條件的限制，很難對微生物種群整體進行分析。近些年，高通量測序技術已成為研究飼料中微生物組成的常用方法。這種方法能夠對微生物種群進行更全面的分析，但是由于測序的通量較大，所以在確定到菌株水平上的準確率較低；同時，由于高通量測序技術直接提取樣品中的微生物總DNA進行微生物群落的分析，單純的相對豐度并不能顯示實時的微生物組成，因此單純的高通量測序技術在準確分析實時微生物菌群構成上存在一定的缺陷；在提供有關微生物群落代謝活性的定量數據方面也仍然存在問題。在未來的研究中，可以將一二代測序方法結合起來，使二者相互補充，能夠更好地對發(fā)酵TMR中的微生物種群進行分析。隨著現代分子生物技術的發(fā)展，第三代測序技術（PacBio Single Molecule）越來越多地被應用到青貯飼料發(fā)酵過程的微生物種群的測定上，該技術結合實時測序技術（real-time sequencing technology，SMRT）能夠更準確的評估飼料中物種水平上的微生物群落。然而該技術在發(fā)酵TMR中的應用還較少，在未來的研究中，利用更新、更高效的現代生物學手段對TMR發(fā)酵過程及有氧狀態(tài)下的微生物種群進行更深入的分析，并采用代謝組學技術分析優(yōu)勢微生物的代謝途徑與代謝產物，進一步分析TMR發(fā)酵過程中營養(yǎng)成分的代謝規(guī)律，為發(fā)酵TMR技術的普及和推廣提供堅實的理論基礎。