申正超，申吉泓，謝星星，宋 娜，李旭華，石西南，柯坤彬

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 泌尿外一科，云南昆明 650032；2.云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南昆明 650500)

前列腺癌在歐美國家是男性最多見的惡性腫瘤之一，并且在男性癌癥致死病因中排名第1位[1]。在中國，隨著老齡人口增加以及檢查手段的普及，前列腺癌發(fā)病率逐年上升[2]。早期前列腺癌患者的主要治療方式是手術(shù)、化療等，但大部分前列腺癌患者在初診時(shí)已出現(xiàn)遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，目前晚期轉(zhuǎn)移性前列腺癌的標(biāo)準(zhǔn)方案仍為抗雄激素內(nèi)分泌治療[3]。然而幾乎全部患者在接受雄激素去勢治療1～2年后將進(jìn)展為去勢抵抗性前列腺癌，此類患者一般預(yù)后較差，并且現(xiàn)有治療方法有限[4]。因此急需新型藥物來控制前列腺癌，改善患者預(yù)后。

滇重樓(Paris polyphylla)運(yùn)用于中醫(yī)已有上千年歷史，臨床上用于癰腫、咽喉腫痛、乳腺炎以及惡性腫瘤等治療[5]。從滇重樓根莖中提取的滇重樓皂苷(Polyphyllin Ⅰ，PPⅠ)是1種具有生物活性的甾體皂苷。最近許多學(xué)者發(fā)現(xiàn)，滇重樓皂苷在肺癌、乳腺癌、胃癌等惡性腫瘤中具有廣泛的抗腫瘤作用[6-9]。有研究發(fā)現(xiàn)滇重樓皂苷在肺癌中具有增高p21蛋白的作用[10]，但滇重樓皂苷在前列腺癌中的研究還相對較少。本文旨在評估滇重樓皂苷影響去勢抵抗性前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3和DU145的增殖、周期以及凋亡的作用，并進(jìn)一步觀察p21以及磷酸化CDK2蛋白表達(dá)的變化，為后期的臨床試驗(yàn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、藥物與試劑去勢抵抗性前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3和Du145于中科院上海細(xì)胞庫購買。滇重樓皂苷購買自瀚香生物科技有限公司(Shanghai,China)，純度大于98%，以10 mmol/L的濃度溶于二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide，DMSO)中，避光儲存于-20 ℃中。F-12、DMEM培養(yǎng)基，胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素混合液購自HyClone(USA)；MTT粉末購自美倫生物(China)；Annexin V-FITC凋亡試劑盒購自BD Pharmingen(USA)；pho-RB(Ser795)、GAPDH、Caspase-3、p21waf/cip1、pho-CDK2(Thr160)購自CELL Signaling Technology (USA)；RNA酶、BCA蛋白檢測試劑盒購自Thermo(USA)；ECL超敏顯色試劑購自蘇州宇恒生物科技有限公司(China)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)PC-3與Du145分別采用含有體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 mg/mL鏈霉素的F-12和DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%的CO2恒溫箱中培養(yǎng)。細(xì)胞傳代時(shí)胰蛋白酶消化，800～1 000 r/min離心3～5 min。

1.3 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測滇重樓皂苷對PC-3和Du145克隆增殖的影響將細(xì)胞以500個(gè)/孔的密度接種在6孔板中，連續(xù)培養(yǎng)3 d后加入含濃度為0.1 μmol/L滇重樓皂苷的完全培養(yǎng)基，每2～3 d換液1次，培養(yǎng)7 d后吸出培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗滌3次，加入預(yù)冷無水甲醇溶液固定10 min后加入2.5 g/L結(jié)晶紫溶液染色10 min，流水將殘余溶液洗去后晾干、拍照，在顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆數(shù)(大于50個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞群)，計(jì)算細(xì)胞克隆形成率。

1.4 MTT檢測PC-3、Du145細(xì)胞增殖抑制率取對數(shù)生長期PC-3、Du145以6 000個(gè)/孔種于96孔板中。實(shí)驗(yàn)組及對照組均設(shè)5個(gè)重復(fù)孔，四周孔使用PBS填充。過夜培養(yǎng)后吸出培養(yǎng)液，將含體積分?jǐn)?shù)為0.1%DMSO的完全培養(yǎng)基加入對照組中，實(shí)驗(yàn)組加入終濃度為0.1、0.3、1.0、3.0、10.0 μmol/L的含滇重樓皂苷的培養(yǎng)基100 μL，分別孵育24、48、72 h后加入5 mg/mL的MTT溶液10 μL，孵育4 h后吸出液體，使用100 μL的DMSO溶解結(jié)晶，震蕩5 min后于570 nm、630 nm處檢測吸光度，計(jì)算細(xì)胞活性率。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期PC-3、Du145按3×105個(gè)/孔接種于6孔板中培養(yǎng)24 h，加入梯度為0.1、0.3、1.0 μmol/L的含藥完全培養(yǎng)基，陰性對照孔加入含有體積分?jǐn)?shù)為0.1%的DMSO培養(yǎng)基，24 h后收集細(xì)胞，PBS洗2遍，重懸后加預(yù)冷體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇于4 ℃固定12 h以上，1 000 r/min離心去上清，用預(yù)冷PBS洗2次后加入RNase和PI染液37 ℃孵育30 min，離心后用PBS重懸細(xì)胞上機(jī)(BD，Biosciences,USA)檢測細(xì)胞周期。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡將PC-3、Du145以6×105個(gè)/孔接種于6孔板中培養(yǎng)24 h后，加入最終濃度梯度為1、3、5 μmol/L的含藥完全培養(yǎng)基，陰性對照孔加入含有0.1%DMSO的培養(yǎng)基，12 h后收集細(xì)胞，使用Annexin V-FITC流式凋亡盒檢測，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡。

1.7 Western blotting檢測p21、p-CDK2、p-RB以及Caspase-3蛋白的表達(dá)將PC-3、Du145細(xì)胞以6×105個(gè)/孔接種于6孔板中培養(yǎng)24 h后，加入最終藥物濃度梯度為0.1、0.3、1.0 μmol/L，對照孔加入含有體積分?jǐn)?shù)為0.1%的DMSO培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后加入RIPA細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min，吸取裂解產(chǎn)物至1.5 mL離心管中，低溫13 000 r/min離心5 min，吸取上清為細(xì)胞總蛋白。使用聚氰基丙烯酸正丁酯(bicinchoninic acid，BCA)法蛋白濃度定量試劑盒測定蛋白濃度，將各組蛋白濃度調(diào)節(jié)至相等。使用10% SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳。每組加入30 μg蛋白以90 V電泳10～20 min，待marker分層后使用120 V電泳45 min，對目的蛋白分離后進(jìn)行180 mA濕轉(zhuǎn)45 min，再用50 g/L脫脂牛奶室溫下封閉1 h。加入一抗后4 ℃過夜孵育。第2天吸出一抗，用TBST洗45 min后加入二抗孵育1 h。洗膜后加入電化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence，ECL)發(fā)光液，反應(yīng)5 min后放入化學(xué)發(fā)光成像儀(Invitrogen,USA)中檢測目的蛋白。

2 結(jié) 果

2.1 滇重樓皂苷使前列腺癌細(xì)胞集落形成減少克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，滇重樓皂苷(0.1 μmol/L)處理后PC-3和Du145細(xì)胞的克隆形成集落少于對照組(圖1A)，與對照組相比實(shí)驗(yàn)組克隆形成率下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1B)。表明滇重樓皂苷具有抑制前列腺癌細(xì)胞克隆形成的能力。

A：含0.1 μmol/L的滇重樓皂苷培養(yǎng)基與對照組PC-3和Du145細(xì)胞克隆形成集落的對比，結(jié)晶紫染色；B：PC-3和Du145細(xì)胞克隆形成率[克隆形成率=(克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%]；與對照組相比，***P<0.001。圖1 滇重樓皂苷對PC-3和Du145細(xì)胞克隆形成的抑制作用

2.2 滇重樓皂苷抑制前列腺癌細(xì)胞增殖的作用隨著滇重樓皂苷濃度和作用時(shí)間的增加，MTT結(jié)果顯示PC-3、Du145細(xì)胞活性明顯降低，表明其對前列腺癌細(xì)胞的增殖抑制作用具有時(shí)間-劑量依賴效應(yīng)。作用時(shí)間在72 h時(shí)達(dá)到最佳的抑制效果(圖2)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，滇重樓皂苷在PC-3、Du145細(xì)胞株中的半數(shù)抑制率(IC50)分別為3.0、5.7 μmol/L。

A：PC-3；B：Du145。[細(xì)胞活性率=(實(shí)驗(yàn)組A值/對照組A值)×100%]，與對照組相比，*P<0.05。圖2 不同濃度滇重樓皂苷在不同時(shí)間下對前列腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用

2.3 滇重樓皂苷對細(xì)胞周期的影響經(jīng)過滇重樓皂苷處理24 h后，可見隨著藥物劑量的上升，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞G0/G1期比例逐漸升高，S期與G2期比例下降(圖3A)。在1 μmol/L時(shí)滇重樓皂苷抑制效果最好，前列腺癌細(xì)胞G0/G1期比例達(dá)到80%以上，與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3B)，表明滇重樓皂苷具有阻斷細(xì)胞G0/G1期的作用。

A：PC-3；B：Du145。與對照組相比，*P<0.05；**P<0.01。圖3 不同濃度的滇重樓皂苷對前列腺癌細(xì)胞周期分布的影響

2.4 滇重樓皂苷促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞株發(fā)生凋亡用不同濃度的滇重樓皂苷(1、3、5 μmol/L)分別處理PC-3和Du145細(xì)胞12 h(圖4A)，結(jié)果顯示各劑量組可明顯升高細(xì)胞凋亡率(P<0.05)，與對照組比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4B)。

A:流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡，滇重樓皂苷各個(gè)濃度可促細(xì)胞凋亡；B:PC-3和Du145細(xì)胞凋亡率[細(xì)胞凋亡率%=晚期凋亡細(xì)胞率%+早期細(xì)胞凋亡率%]，與對照組相比，*P<0.05。圖4 滇重樓皂苷誘導(dǎo)PC-3、Du145細(xì)胞凋亡

2.5 滇重樓皂苷對p21、p-CDK2、p-RB蛋白和凋亡蛋白的影響使用滇重樓皂苷(0.1、0.3、1.0、3.0 μmol/L)分別處理PC-3和Du145細(xì)胞24 h后，Western blotting檢測p21waf/cip1、pho-RB(Ser795)、pho-CDK2(Thr160)和Caspase-3蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示p21蛋白含量增高，細(xì)胞周期相關(guān)蛋白p-CDK2、p-RB降低，凋亡剪切酶Caspase-3含量增多，且呈劑量依賴趨勢。在3 μmol/L濃度下，p-RB的表達(dá)幾乎被完全抑制(圖5)。

圖5 不同濃度滇重樓皂苷對細(xì)胞周期相關(guān)蛋白p21、p-CDK2、p-RB和凋亡蛋白Caspase-3的影響

3 討 論

前列腺癌是老年男性最常見的腫瘤，2018年全世界約有130萬確診病例，導(dǎo)致近36萬人死亡。常用的治療手段包括手術(shù)去勢、內(nèi)分泌治療、放化療和靶向治療，這些治療方式的出現(xiàn)大大改善了前列腺癌患者的預(yù)后，但晚期或轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者的5年生存率僅為26%～30%，因此需要有新的藥物能有效控制前列腺癌[11]。中醫(yī)臨床使用滇重樓根莖已有數(shù)千年歷史，滇重樓皂苷是滇重樓根莖中提取的活性成分之一。研究者發(fā)現(xiàn)滇重樓皂苷具有抑制腫瘤細(xì)胞生長、抑制腫瘤血管生成[12]、逆轉(zhuǎn)耐藥性[13]、抑制炎癥反應(yīng)[14]和調(diào)節(jié)免疫功能的作用，在治療癌癥方面極具前景。

細(xì)胞周期失調(diào)是癌癥的一個(gè)特性[15]。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2(cyclin-dependent kinase 2，CDK2)是調(diào)控細(xì)胞G1-S期的重要蛋白，它以磷酸化的形式參與細(xì)胞周期進(jìn)程、DNA復(fù)制、組蛋白合成以及中心體復(fù)制[16-17]。當(dāng)細(xì)胞受到有絲分裂信號刺激時(shí)，將激活細(xì)胞周期蛋白E(cyclin E)，隨后激活CDK2并形成復(fù)合體，CDK2-cyclinE復(fù)合體可使RB磷酸化，從而促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子協(xié)調(diào)的基因表達(dá)，推動細(xì)胞周期的進(jìn)程[18]。作為CDK2的調(diào)控基因，p21可以抑制CDK2的活性，阻止RB進(jìn)一步磷酸化和DNA復(fù)制啟動，使細(xì)胞周期停滯在G1期[19]。

在胃癌及非小細(xì)胞肺癌中，滇重樓皂苷在濃度很低(0.1、0.5 μmol/L)的時(shí)候即可抑制細(xì)胞增殖[20-21]。本研究中，我們在克隆增殖實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)滇重樓皂苷在0.1 μmol/L濃度下即可抑制前列腺癌細(xì)胞的克隆增殖，因此我們在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中使用0.1 μmol/L作為起始濃度，并以3倍濃度梯度遞增。當(dāng)?shù)嶂貥窃碥諠舛仍鲋?0 μmol/L時(shí)可使細(xì)胞發(fā)生大量壞死，因此我們選擇1、3、5 μmol/L作為凋亡實(shí)驗(yàn)的劑量。本研究結(jié)果顯示，前列腺癌細(xì)胞活力在遞增濃度和時(shí)間的滇重樓皂苷作用下，呈濃度-時(shí)間依賴的下降趨勢。流式技術(shù)結(jié)果示，滇重樓皂苷在低劑量(1、3 μmol/L)下，使PC-3和Du145細(xì)胞G0/G1期比例升高，S期占比下降，且G0/G1期比例隨著藥物濃度的增加，呈上升趨勢。當(dāng)前列腺癌細(xì)胞在滇重樓皂苷高劑量(5 μmol/L)的作用下出現(xiàn)明顯凋亡，凋亡細(xì)胞所占比例呈濃度依賴性增高。為闡明滇重樓皂苷誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞發(fā)生周期阻滯和凋亡的可能機(jī)制，我們進(jìn)一步對相關(guān)細(xì)胞周期蛋白和凋亡通路蛋白進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，PC-3和Du145在滇重樓皂苷的作用下，p21表達(dá)顯著上升，而p-CDK2和p-RB的表達(dá)下降。并且細(xì)胞發(fā)生凋亡中最重要的終末剪切酶Caspase-3[22]出現(xiàn)明顯裂解激活。以上結(jié)果提示，滇重樓皂苷具有激活細(xì)胞凋亡通路和抑制p21調(diào)控CDK2/RB通路的作用。

綜上所述，滇重樓皂苷能夠通過調(diào)節(jié)p21/CDK2/RB信號通路和激活細(xì)胞凋亡蛋白，從而抑制前列腺癌細(xì)胞株的增殖和生長、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，為滇重樓皂苷運(yùn)用于前列腺癌臨床治療提供了理論依據(jù)。但滇重樓皂苷激活p21的具體機(jī)制及其在前列腺癌動物模型中的抗腫瘤活性仍需進(jìn)一步研究。