李成

膽固醇又被叫作膽甾醇，是環(huán)戊烷多氫菲的一種衍生物，被世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)列為3類致癌物，人體內(nèi)膽固醇過高會(huì)導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病等心腦血管疾病。針對(duì)膽固醇的定量方法，比較常見的是高效液相色譜法、比色法以及氣相色譜法。傳統(tǒng)的比色法操作復(fù)雜繁瑣，對(duì)試劑的需求量較大，需要投入較高的成本，因此使用并不廣泛。本文采用氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定食用油中的膽固醇，旨在提高測(cè)定效益以及結(jié)果的可靠性，更好地確保食用油的健康。

一、儀器和試劑

5977A質(zhì)譜儀、7890B氣相色譜儀，安捷倫公司;XP205分析天平，梅特勒-托利多中國(guó)有限公司;異辛烷，廣州化學(xué)試劑廠;膽固醇，純度和批號(hào)分別為95.0%、00219，美國(guó)DR公司;甲醇，無水乙醇，氫氧化鉀，60%氫氧化鉀溶液，無水硫酸鈉，無水乙醚，沸程為30-60℃的石油醚。

二、操作條件

1.氣相色譜條件。分流模式進(jìn)樣，分離比為1︰1;進(jìn)樣口溫度280℃;柱溫借助程序升溫，初始溫度為220℃，保持3min，再以30℃/min的速率上升到280℃，保持12min;載氣為氦氣，載氣流量為1.5mL/min，溶劑延遲3min。

2.質(zhì)譜條件。ET電離方式，質(zhì)量掃描范圍190-450amu，電子能量70eV，電子倍增器電壓1405V，傳輸線溫度280℃，離子源溫度250℃。采用離子（SIM）方式的時(shí)候，定量離子為386，定性離子為275、301、368、386。

三、實(shí)驗(yàn)和方法

1.樣品制備。（1）皂化。稱取均勻混合的油樣1-5g，精確到0.1mg，將5mL的氫氧化鉀溶液和10mL的無水乙醇加入到100mL的圓底燒瓶中，均勻混合后在75℃恒溫水浴鍋中皂化試樣。在皂化的過程中，振搖5min后油層幾乎消失干凈，再皂化1h;然后再搖一次，當(dāng)溶液為澄清透明的亮黃色液體時(shí)皂化結(jié)束，將其取出來放在75℃水浴鍋上將乙醇蒸去，自然冷卻，直到和室溫保持一致。

（2）提取。在250mL的分液漏斗中裝入所有的皂化液，用60mL的氫氧化鉀溶液（1mol/L）對(duì)試管進(jìn)行三次清洗，把洗液一起倒在分液漏斗中。輕輕搖晃均勻后，將40mL的乙醚萃取液加入到混合溶液之中，振搖1min，靜置，分層。轉(zhuǎn)移水相至第二個(gè)分液漏斗，再用20mL的乙醚展開提取工作，一共提取兩次，舍去下層水相，將三次有機(jī)相合并在一起。用0.5mol的氫氧化鉀溶液將乙醚清除干凈，再借助蒸餾水對(duì)有機(jī)相進(jìn)行清洗，直到pH為中性。通過無水硫酸鈉脫水干燥，在250mL氮吹專用瓶中濾入濾液。

（3）濃縮。在Caliper濃縮儀上放置上述濾液，45℃水浴，使用氮?dú)獯?，濃縮，借助乙醚定容到1mL，利用吸管將其吸出并放入進(jìn)樣瓶，借助氣相色譜展開分析。

2.工作曲線的繪制。提取膽固醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用乙酸乙酯進(jìn)行稀釋，制成1.62μg/mL、16.2μg/mL、48.6μg/mL、113.2μg/mL、162μg/mL、243μg/mL的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)系列。基于上述色譜條件，分別取1μL進(jìn)樣，對(duì)峰面積和保留時(shí)間進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)峰面積均值和濃度（μg/mL）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

四、結(jié)果與討論

1.色譜條件。基于試樣配置方式與色譜條件等，測(cè)定空白溶液，比較其和膽固醇對(duì)照品溶液的出峰時(shí)間，空白溶液在膽固醇的出峰時(shí)間處都沒有吸收峰，由此可知，空白溶液基本沒有影響測(cè)定結(jié)果。

2.線性實(shí)驗(yàn)。線性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示，相關(guān)系數(shù)r2為0.999，在濃度0.06061-0.6061mg/mL之間，線性關(guān)系良好。

3.定量限和檢出限。分析方法的檢出限即信噪比為3時(shí)相應(yīng)的待分析物濃度，定量限即信噪比為10時(shí)相應(yīng)的分析物濃度。當(dāng)信噪比為3時(shí)，膽固醇的檢出限為0.12μg/mL，得到方法的膽固醇檢出限0.004mg/g;當(dāng)信噪比為10時(shí)，膽固醇的定量限為0.43μg/mL，得到方法的膽固醇定量限0.014mg/g。

4.準(zhǔn)確度和精密度。分別稱取花生油和大豆油樣品各10g，分別加入1mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg三個(gè)濃度水平的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后基于以上提取方式進(jìn)行處理，需要平行測(cè)定6次，準(zhǔn)確計(jì)算加標(biāo)回收率以及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。通過計(jì)算可知，大豆油和花生油中膽固醇的回收率分別為94%-98%、93%-98%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.4%-4.6%、2.2%-3.7%，說明此方法具有較強(qiáng)的可靠性。

5.測(cè)定食用油樣品。通過前文提到的方式，對(duì)花生油、色拉油、大豆油、豬油、芝麻調(diào)和油、地溝油以及餐廚廢油進(jìn)行測(cè)定，并運(yùn)用質(zhì)譜定性其中的甾醇，結(jié)果如表2所示。通過對(duì)表2進(jìn)行分析可知，芝麻調(diào)和油中涉及到的膽固醇偏低，餐廚廢油以及豬油則偏高，地溝油中也存在膽固醇，植物油中不包含膽固醇，但結(jié)構(gòu)上存在與膽固醇較為接近的物質(zhì)，比如豆甾醇、菜油甾醇等植物甾醇。

五、結(jié)論

本文采用氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定了食用油中的膽固醇含量，分離效果良好，且選擇性高。采取質(zhì)譜定性，排除植物甾醇對(duì)膽固醇檢測(cè)產(chǎn)生的影響，可以在測(cè)定食用油中高膽固醇含量時(shí)運(yùn)用。借助測(cè)試食用油樣品，發(fā)現(xiàn)地溝油、餐廚廢油以及豬油中均有膽固醇，而植物油中涉及到的膽固醇極少，可以忽略。因此，測(cè)定食用油中包含的膽固醇能夠有效辨別植物油中是否摻入了動(dòng)物油，這屬于判斷食用油中是否摻入餐廚廢油的關(guān)鍵指標(biāo)。