初 霞，王保健，趙 偉，趙 坡

隨著精準診斷和治療的發(fā)展，越來越多的肺癌患者從中獲益，延長了生命，但是肺癌仍位于腫瘤死亡的第一位［1］。因此，肺癌的早期診斷和治療是解決上述問題的關鍵。既往研究顯示檢測血漿游離DNA（cfDNA）中 的SHOX2（short stature homeobox 2，SHOX2）和PTGER4（prostaglandin E receptor 4 gene，PTGER4）基因甲基化有助于CT肺結節(jié)性質的提示，在惡性肺結節(jié)中甲基化陽性率高達90%［2］。本研究分析肺癌與非肺癌中兩基因甲基化情況，以及甲基化與臨床病理特征的關系，探討其在肺癌早期篩查的意義。

1 對象與方法

1.1 對象 選取聯(lián)勤保障部隊第九八八醫(yī)院2018年1月～2019年4月檢測者共176例，男性121例，女性55例，年齡28～93歲，平均年齡58歲。肺癌組93例，其中鱗癌34例，腺癌41例，小細胞癌17例，大細胞神經內分泌癌1例；TNM分期，Ⅰ期21例，Ⅱ期14例，Ⅲ期25例，Ⅳ期33例。對照組中非惡性肺部疾病有73例，包括肺炎或支氣管炎患者67例，肺結核2例，間質性肺炎4例，健康體檢者10例。所有患者均在自愿的前提下，簽訂知情同意書。本研究遵從修訂版的赫爾辛基宣言，得到醫(yī)院倫理委員會的認可。

納入標準：肺癌組均經病理組織學確診為肺癌，按WHO2015版組織學分類，按國際抗癌聯(lián)盟（UICC）第8版肺癌分期標準進行分期，所有患者采樣前均未接受抗腫瘤治療，也未患有其他腫瘤。

1.2 方法 晨起空腹采集10 ml靜脈血于streck管（上海菱格生物科技有限公司）內，以離心半徑8.5 cm、1 500 r/min離心10 min，移取血漿于2.0 ml EP管中，再以離心半徑8.5 cm、16 000 r/min，低溫（2～8℃）離心10 min，抽取上清于新的2.0 ml EP管中。應用商業(yè)化磁珠法大體積游離核酸提取試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司（DP710）］提取血漿cfDNA，用Qubit 4.0超微量分光光度計（Thermo）檢測DNA濃度，用重亞硫酸鹽轉化試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司（DP215）］對DNA進行亞硫酸鹽修飾，采用ABI7500實時熒光定量PCR儀擴增（Thermo），實驗設計和原理參考文獻［3］。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司制備，PCR反應條件為94℃、20 min，50個循環(huán)（94℃、15 s，64℃、5 s，60℃、30 s），25℃、1 min。每個樣本重復3次（表1）。

表1 SHOX2、PTGER4和GAPDH引物序列

1.3 結果判讀 靶基因SHOX2和PTGER4通道顯示的數(shù)據(jù)是與內對照GAPDH相比較得出的相對數(shù)值，有S型擴增曲線且Ct值≤50，根據(jù)設定的閾值，將6個有效的Ct值輸入專用的判讀軟件進行分析，得出SHOX2和PTGER4基因甲基化情況。該樣本的最終判讀是根據(jù)軟件計算得出，6個單獨的Ct結果均不能代表樣本最終的結果。陽性表示檢測到SHOX2和/或PTGER4基因發(fā)生甲基化，陰性表示沒有檢測出SHOX2和PTGER4基因甲基化。

1.4 病理檢查 所有送檢至病理科的組織學標本，均經100 ml/L中性甲醛固定6～24 h后，取材、脫水、石蠟包埋、切片、常規(guī)HE染色后，光學顯微鏡下進行HE診斷，如有需要再進行免疫組化染色協(xié)助診斷。在澳大利亞Leica Bond-Max自動免疫組織化學染色儀上用En VisionTM方法染色，所有一抗均為上海杰浩即用型試劑，包括CK5/6、P63、CK7、TTF-1、NapsinA、CD56、CgA、Syn、Ki-67，修復方法參考試劑說明書，其余試劑均為英國Leica公司。陽性細胞為胞膜或胞核含棕黃色顆粒者。肺鱗狀細胞癌時CK5/6、P63陽性，陽性部位分別位于細胞膜和細胞核。肺腺癌時CK7、TTF-1、NapsinA陽性，分別位于細胞膜、核和膜。肺小細胞癌時CD56細胞膜強陽性、CgA、Syn陽性或陰性。肺大細胞神經內分泌癌時鱗、腺的標記為陰性，但是CD56陽性。Ki-67細胞核陽性，提示腫瘤的增殖活性，小細胞癌常大于90%。超過80%的腫瘤細胞著色即認為是陽性。用已知陽性片作陽性對照，PBS代替一抗作陰性對照。

1.5 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，采用卡方檢驗比較肺癌組和對照組甲基化；肺癌組甲基化與患者臨床特征關系；肺炎/支氣管炎組甲基化與患者臨床特征的關系。運用Spearman相關性分析肺炎/支氣管炎組中肺纖維化或胸膜增厚與甲基化的相關性。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 所有標本血漿cfDNA的SHOX2和PTGER4基因甲基化情況 176例樣本檢測結果繪制ROC曲線，AUC面積為0.788，檢測肺癌的靈敏性和特異性分別是74%和85.1%。肺癌組甲基化陽性率為83.9%（78/93），明顯高于對照組28.9%（24/83），差異有統(tǒng)計學意義。對照組中肺炎/支氣管炎陽性率32.9%（22/67）、肺結核0、間質性肺炎50%（2/4）和健康體檢者0。肺癌組和對照組間差異有統(tǒng)計學意義（χ2=59.628，P＜0.05，表2）。

表2 兩組標本甲基化［例（%）］

2.2 肺癌組基因甲基化與臨床病理特征關系 肺癌組血漿SHOX2和PTGER4基因甲基化與患者的性別、年齡、吸煙史無關（P>0.05）。與病理類型有關，不同病理類型間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。鱗狀細胞癌、大細胞神經內分泌癌陽性率100%（34/34），小細胞癌82.4%（14/17），腺癌70.7%（29/41），不同TNM分期間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。早期肺癌（Ⅰ和Ⅱ期）甲基化陽性率為68.6%（24/35），Ⅳ期為93.9%（31/33），分期越高陽性率越高（表3）。

表3 93例肺癌患者甲基化與臨床特征的關系［例（%）］

2.3 肺炎/支氣管炎組基因甲基化與臨床特征 肺炎/支氣管炎組血漿SHOX2和PTGER4基因甲基化陽性率為32.8%（22/67），與患者的性別、年齡、吸煙史無關（P>0.05，表4）。

表4 67例肺炎/支氣管炎患者甲基化與臨床特征的關系［例（%）］

2.4 肺炎/支氣管炎組中肺纖維化和胸膜增厚與基因甲基化相關性 肺炎/支氣管炎組中血漿SHOX2和PTGER4基因甲基化陽性的患者，部分伴有肺纖維化或胸膜增厚，但統(tǒng)計學顯示肺纖維化和胸膜增厚與甲基化之間并無相關性（Spearman相關系數(shù)ρ=0.029，P=0.863）。

3 討論

當前肺癌的早期篩查方法有低劑量螺旋CT、肺癌特異性血清腫瘤標志物等。研究顯示，與胸部X射線相比，CT組肺癌相關死亡率降低了20%，但其假陽性率也很高，在NLST研究中，假陽性結節(jié)比例高達96.4%［4］。血清腫瘤標志物聯(lián)合檢測雖提高了敏感性，但特異性降低，而且很多早期肺癌血清標志物正常［5］。DNA異常甲基化出現(xiàn)于細胞癌變的早期，發(fā)生在CpG島（CpG islands，CGIs）上，發(fā)生于轉錄起始處的CGIs，導致抑癌基因沉默，而發(fā)生于基因體內CGIs，促進轉錄延長［6］。目前通過檢測糞便內BMP3和NDRG4基因甲基化以及血漿中Septin9基因甲基化，用于大腸癌的早期篩查［7］。研究發(fā)現(xiàn)早期肺癌中存在多個基因的異常甲基化，部分 基 因 的 甲 基 化 還 與 肺 癌 的 預 后、進 展 有 關［6，8-9］。多項研究證明肺癌組織中存在SHOX2基因甲基化，其在肺癌患者不同類型標本中的陽性率為35.7%～74.3%［10-11］。夏冬 平 等［12］和 王南等［13］對 肺癌患者血漿SHOX2基因甲基化的檢測，提示它可作為一種非侵入性的肺癌腫瘤標志物。Anne等［14］運用三重實時熒光定量PCR檢測肺癌患者血漿SHOX2和PTGER4基因甲基化，特異度95%時，靈敏度為67%，優(yōu)登指數(shù)62%。Weiss等［7］用實時熒光定量PCR檢測肺癌與非肺癌組中血漿多個基因甲基化情況，最后得出SHOX2/PTGER4基因甲基化是最優(yōu)組合，其優(yōu)登指數(shù)近60%。本研究的靈敏度和特異度分別是74%、85.1%，優(yōu)登指數(shù)為59.1%，與他們接近。Yin等［3］通過熒光定量PCR檢測493例Tis0-I期肺癌患者血漿SHOX2和PTGER4基因甲基化，結果338例（68.6%）有異常甲基化。本研究檢測顯示肺癌患者血漿SHOX2和PTGER4基因甲基化在早期肺癌（Ⅰ和Ⅱ期）中陽性率達到68.6%（24/35），在Ⅳ期為93.9%（31/33）。這些提示血漿SHOX2和PTGER4基因甲基化可用于肺癌的無創(chuàng)篩查。

研究顯示，非小細胞肺癌CGI的高度甲基化與組織學類型和進展有關［15-16］。本研究也證實了這點，鱗狀細胞癌和大細胞神經內分泌癌的SHOX2和PTGER4基因甲基化陽性率達到100%，小細胞癌、腺癌分別為82.4%和70.7%；TNMⅠ期陽性率71.4%，Ⅳ期93.9%，分期越高，基因甲基化陽性率越高，可能與晚期腫瘤細胞增生活躍、體循環(huán)中樣本DNA含量較高，因而甲基化基因拷貝數(shù)增加有關［17］。

本研究顯示肺炎/支氣管炎組血漿SHOX2和PTGER4基因甲基化陽性率達到32.9%。部分陽性患者的CT提示有一處或多處纖維化，或胸膜局限性增厚。慢性炎癥的長期存在，致使多種致炎因子反復、持續(xù)刺激肺泡上皮，致其損傷、脫落和增生修復，若不及時干預，可出現(xiàn)不典型增生、癌變，同時反復發(fā)生上皮損傷的部位會出現(xiàn)纖維母細胞的遷移、增殖、分化和抗凋亡能力增強［18］。Li等［19］分析提示肺纖維化患者中肺癌的發(fā)生率為4.8%～48%，遠遠高于無肺纖維化的患者（2.0%～6.4%）；Goto等［20］發(fā)現(xiàn)肺纖維化合并肺癌的發(fā)病率在美國為4.8%～8.0%，日本為48.2%，韓國為13.1%，均提示肺纖維化與肺癌的發(fā)生有一定關系。Ma等［21］在暴露于二氧化鈦微粒下的幼年小鼠肺中發(fā)現(xiàn)有炎癥基因（IFN-γ和TNF-α）和組織纖維化基因（Thy-1）的啟動子甲基化。本研究4例間質性肺炎患者，2例基因甲基化檢測陽性。間質性肺炎的鏡下特征也存在成纖維細胞增生、纖維化伴有炎細胞浸潤。盡管統(tǒng)計學提示肺纖維化和胸膜增厚與甲基化無相關性，但是數(shù)據(jù)中的確出現(xiàn)伴有肺纖維化或胸膜增厚患者的甲基化陽性，SHOX2和PTGER4基因甲基化是否也參與肺炎和纖維化，還有待于進一步探討。血漿SHOX2和PTGER4基因甲基化陽性的肺炎/支氣管炎患者應該結合影像學和其他臨床特征綜合判定，是否需要隨訪還有待于追蹤判斷。

血漿SHOX2和PTGER4基因甲基化檢測可以作為一種無創(chuàng)檢測，輔助鑒別診斷肺癌與非肺癌患者，用于目前篩查方法的補充。對于臨床病史、體征或CT提示，有增加肺癌風險的患者，最終有可能受益于血漿SHOX2和PTGER4基因甲基化檢測。