王 星，吳付兵，陳國強，吳佳倫，左楊斌

胃癌是一個全球性的健康問題，每年全世界有100多萬人被診斷為新的胃癌患者，亞洲國家胃癌的發(fā)病率和死亡率逐年上升，特別是在東亞國家［1-2］。由于胃癌早期不具有特異性的癥狀，大多數(shù)患者在首次診斷時已經(jīng)處于中晚期，導致胃癌患者的預后較差［3］。盡管在過去的幾十年里，胃癌的治療取得了很大進展。然而，目前關于胃癌的惡性進展機制尚有許多未知。長鏈非編碼RNA（LncRNA）參與多種疾病以及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程［4-5］?；蜷g長鏈非編碼RNA 01207（LINC01207）是長鏈非編碼RNA中的一種。研究發(fā)現(xiàn)LINC01207對胰腺癌、肺腺癌和惡性膠質瘤的增殖和轉移等具有重要的調控作用［6-8］。但其在胃癌中的表達及對胃癌細胞生物學行為的影響仍不明確。因此，本研究通過分析LINC01207在胃癌中的表達意義以及其對胃癌細胞生物學功能的作用，以期為胃癌臨床治療提供新的靶點。

1 對象與方法

1.1 對象 收集2018年6月～2020年3月在聯(lián)勤保障部隊第九〇〇醫(yī)院莆田醫(yī)療區(qū)100例被確診為原發(fā)性胃癌并施行胃癌切除術患者的胃癌組織及癌旁組織（≥4 cm），其中女性47例，男性53例，所有患者術前均未接受放療或化療?；颊叩脑\斷和臨床病理特征包括年齡、腫瘤大小、TNM分期、淋巴轉移和靜脈血清中CEA水平、CA19-9水平、CA724水平均經(jīng)過兩位以上病理學和檢驗醫(yī)生確認。所有患者術前均知情并簽署同意書。手術切除后，所有標本做好標記并立即在液氮中儲存直到用于后續(xù)RNA提取實驗。

1.2 qRT-PCR檢測LINC01207的表達 組織或細胞中的總RNA用Trizol試劑（Invitrogen，美國）提取，采用PrimeScript RT reagent Kit（TaKaRa）將總RNA反轉錄成cDNA。PCR反應采用ABI 7500定量PCR儀和SYBR premix Ex TaqTM II Kit（TaKaRa，日本）定量檢測組織或細胞中LINC01207的表達。以U6作為內參，用2-ΔΔCt法表示LINC01207在組織或細胞中的相對表達水平。

1.3 細胞培養(yǎng)和轉染 人胃癌細胞MGC-803和BGC-823以及人胃黏膜正常細胞株GES-1（上海生命科學研究院細胞資源中心）采用含有10%胎牛血清（FBS）、1%青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液（Gibco，美國）培養(yǎng)，細胞置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。MGC-803和BGC-823細胞中靶向LINC01207的siRNA（si-LINC01207）和陰性對照siRNA（si-NC）序列（上海吉瑪制藥）轉染按照Lipofectamine 2 000轉染試劑（Invitrogen，美國）說明書進行操作。細胞分為無處理組、對照組和干擾組。轉染24 h后，收集細胞參照qRT-PCR方法檢測轉染效率。

1.4 Transwell實驗檢測LINC01207對胃癌細胞遷移和侵襲的影響 胃癌細胞增殖按CCK-8試劑盒（上海碧云天）進行操作。遷移實驗：將轉染后各組細胞按4 000個/100μl無血清培養(yǎng)基/孔接種于Transwell小室上室，下室加入800μl含10%胎牛血清（FBS）的血清培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后，將Tanswell上室取出，用4%多聚甲醛溶液對小室膜下面的細胞進行固定，然后用0.1%結晶紫染色，濕棉簽小心擦掉上室內膜表面的細胞。顯微鏡（OLYMPUS）下拍照并計數(shù)。侵襲實驗：在小室的內部膜一預先鋪上一層Matrige基質膠，Matrigel基質膠按照說明書進行配制和處理，其余同遷移實驗。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)通過正態(tài)分布檢驗后復合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析后兩組比較采用Tukey's檢驗。LINC01207表達在胃癌中的診斷意義采用受試者工作特征曲線（ROC曲線）分析。兩組間比較采用獨立t檢驗。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 LINC01207在胃癌組織中的表達 qRT-PCR結果顯示，與正常組織（1.64±0.620）相比，胃癌組織中的LINC01207相對表達水平（5.12±2.239）顯著上調，差異有統(tǒng)計學意義（t=14.99，P＜0.001）。

2.2 LINC01207的表達與胃癌患者臨床病理特征的關系 組織中LINC01207表達水平與胃癌患者年齡、性別和分化程度之間沒有明顯的相關性，但與腫瘤大小、淋巴轉移、TNM分期、CEA水平、CA19-9水平和CA724水平呈顯著相關性（表1）。

表1 LINC01207在胃癌患者中的表達與臨床病理特征的關系（±s）

表1 LINC01207在胃癌患者中的表達與臨床病理特征的關系（±s）

臨床特征 例數(shù) LINC01207表達 t值 P值年齡 0.948 0.345＜55 26 5.48±2.136≥55 74 5.00±2.271性別 0.337 0.737女34 5.23±2.078男66 5.07±2.331分化程度 1.137 0.258中和高分化 33 4.76±2.241低分化 67 5.303±2.333腫瘤大小 4.278 ＜0.001≥5 cm 47 4.81±2.036＜5 cm 53 5.96±2.092淋巴轉移 3.161 0.002否32 4.14±2.258是68 5.59±2.089 TNM分期 3.375 0.001 I+II 40 4.24±2.034 III+IV 60 5.71±2.191 CEA水平 5.022 ＜0.001正常（＜10μg/L） 27 3.47±1.904高（≥10μg/L） 73 5.74±2.043 CA19-9水平 5.178 ＜0.001正常（＜35kU/L） 35 3.72±1.951高（≥35kU/L） 65 5..88±2.017 CA724水平 5.085 ＜0.001正常（＜8.2kU/L） 23 3.26±2.134高（≥8.2kU/L） 77 5.68±1.962

2.3 ROC曲線分析 ROC曲線分析表明曲線下面積為0.902（95%CI：0.859～0.957）。當胃組織中LINC01207表達水平的截斷值為2.975時，靈敏度為84.0%，特異性為100.0%。

2.4 LINC01207在胃癌細胞中表達 與GES-1細胞（1.00±0.080）相比，MGC-803和BGC-823細胞中的LINC01207相對表達水平（4.23±0.470；5.53±0.437）顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義 （t=13.54，17.68，P＜0.001）。

2.5 干擾對胃癌細胞中LINC01207表達的影響MGC-803和BGC-823細胞經(jīng)轉染24 h后，qRTPCR結果顯示3組之間LINC01207表達差異顯著（P＜0.001）。與對照相比，干擾后MGC-803和BGC-823細胞中LINC01207相對表達水平均顯著下調，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001，表2）。

表2 轉染si-LINC01207后MGC-803和BGC-823細胞中LINC01207相對表達（±s）

表2 轉染si-LINC01207后MGC-803和BGC-823細胞中LINC01207相對表達（±s）

項目 無處理組 對照組 干擾組 F值 P值MGC-803 1.01±0.060 0.98±0.073 0.32±0.008 185.5 ＜0.001 BGC-823 1.00±0.025 1.02±0.023 0.29±0.025 864.5 ＜0.001

2.6 干擾LINC01207表達對胃癌細胞增殖的影響干擾的MGC-803和BGC-823細胞培養(yǎng)24 h后，3組間增殖率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。與對照組的細胞增殖率相比，干擾組胃癌MGC-803和BGC-823細胞增殖率顯著降低，細胞生長明顯受到抑制，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001，表3）。

表3 干擾LINC01207表達對MGC-803和BGC-823細胞增殖率的影響（±s）

表3 干擾LINC01207表達對MGC-803和BGC-823細胞增殖率的影響（±s）

項目 無處理組 對照組 干擾組 F值 P值MGC-803 1.00±0.032 0.99±0.045 0.73±0.056 68.46 ＜0.001 BGC-823 1.00±0.052 1.03±0.033 0.78±0.033 63.44 ＜0.001

2.7 干擾LINC01207表達對胃癌細胞遷移和侵襲的影響 3組間遷移和侵襲細胞差異顯著，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。與對照組平均遷移細胞數(shù)和平均侵襲細胞數(shù)相比，干擾組胃癌MGC-803和BGC-823細胞視野平均遷移細胞數(shù)和平均侵襲細胞數(shù)均顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），見表4。

表4 干擾LINC01207表達對MGC-803和BGC-823細胞遷移和侵襲的影響（個，±s）

表4 干擾LINC01207表達對MGC-803和BGC-823細胞遷移和侵襲的影響（個，±s）

組別 MGC-803遷移細胞數(shù)無處理組 374.00±28.67對照組 395.80±21.17干擾組 193.20±22.08 F值 105.5 P值 ＜0.001侵襲細胞數(shù)304.00±31.81 306.00±17.59 194.00±21.74 36.55＜0.001 BGC-823遷移細胞數(shù) 侵襲細胞數(shù)353.80±33.00 236.20±24.266 340.20±32.41 252.40±23.59 224.80±21.74 133.60±20.40 28.85 39.87＜0.001 ＜0.001

3 討論

胃癌患者的總體預后較差，中晚期胃癌患者5年生存率約為25%［9］。LncRNAs在胃癌等許多惡性腫瘤的早期診斷、預后評估及臨床治療上具有重要潛在價值［11］。比如LncRNA19在胃癌中高表達，循環(huán)型LncRNA19對胃癌的診斷及預后具有重要的臨床價值［12］。最近的研究表明LINC01207在腫瘤發(fā)生和惡性進展中起著至關重要的作用。如Wang等［7］報道LINC01207在肺腺癌中的特異性高表達，在體內和體外均能促進肺腺癌細胞的存活，此外，較高的LINC01207表達水平則提示晚期TNM分期和較短的生存期。Zeng等［13］研究顯示，LINC01207參與cAMP信號轉導和粘蛋白型O-糖能生物合成途徑，可作為結腸腺癌診斷和治療的有效分子靶點。Liu等［8］研究發(fā)現(xiàn)LINC01207在胰腺癌中高表達，沉默LINC01207表達能夠抑制胰腺癌細胞生長，還能促進細胞凋亡和自噬。然而，Chi等［6］發(fā)現(xiàn)LINC01207在惡性膠質瘤細胞和癌組織中均顯著低表達，LINC01207的低表達與膠質瘤患者侵襲情況和腫瘤分級有關；此外，LINC01207明顯抑制細胞增殖和存活。以上研究證實，LINC01207在多種惡性腫瘤發(fā)揮重要的調控作用。本研究發(fā)現(xiàn)，與癌旁正常組織相比，胃癌組織中LINC01207的表達水平顯著上調，證實LINC01207在胃癌組織中高表達，可能發(fā)揮癌基因的作用。這結果與其在肺腺癌中、結腸腺癌和胰腺癌中表達一致，都是高表達，而與其在惡性膠質瘤中表達不一致。LINC01207在不同癌組織中的存在差異表達可能與其在不同腫瘤中發(fā)揮不同功能有關。本研究發(fā)現(xiàn)胃癌患者組織中LINC01207相對表達水平與腫瘤大小、淋巴轉移、TNM分期、CEA水平、CA19-9水平和CA724水平顯著相關，提示LINC01207的異常表達與胃癌發(fā)展密切相關。LINC01207表達水平診斷胃癌的ROC曲線下面積為0.902，具有較高的靈敏度和特異性。但是由以上文獻可知LINC01207在肺腺癌、胰腺癌以及結腸腺癌中也高表達，所以LINC01207對胃癌來說是非特異性的預測標志物，只能作為胃癌診斷的輔助標志物。

大量實驗證據(jù)支持lncRNA作為競爭性內源性RNA，競爭性吸附miRNA上調靶基因的表達［14］。比如，LINC01207通過競爭性吸附miR-1972，下調其表達從而上調LIM和SH3蛋白1促進前列腺癌細胞增殖、遷移、侵襲和腫瘤形成［18］。本研究發(fā)現(xiàn)，胃癌細胞中LINC01207的表達水平均顯著高于正常胃黏膜細胞。干擾LINC01207表達對胃癌細胞增殖、遷移和侵襲產(chǎn)生顯著的抑制效應。這與其在肺腺癌和胰腺癌中的作用相似，表明LINC01207在胃癌細胞中發(fā)揮癌基因的功能。關于LINC01207在胃癌中是否也通過競爭性吸附某些特定miRNA調控相應的靶基因來影響胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲的具體機制仍需要進一步研究。

綜上所述，LINC01207在胃癌中高表達，干擾LINC01207表達能夠抑制胃癌細胞增殖、遷移和侵襲，LINC01207可能成為胃癌診斷標志物以及干預治療的新靶點。