李世軍，李 昂，張 璐，王曉娜

心肌肥厚和心肌組織纖維化是心力衰竭的主要病理環(huán)節(jié)，高血壓左室肥厚向心力衰竭發(fā)展的決定因素是心肌膠原的過度沉積，即心肌纖維化，防止或逆轉(zhuǎn)心肌纖維化可能有助于維護心臟功能。交感神經(jīng)系統(tǒng)過度活化在心肌肥厚、心肌纖維化過程中發(fā)揮重要作用。交感神經(jīng)系統(tǒng)亢進在高血壓心肌肥厚的形成中極其重要，神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的激活可誘發(fā)心室重構(gòu)。研究顯示，心臟交感神經(jīng)切除減緩自發(fā)性高血壓大鼠心肌肥厚與心肌纖維化［1］；勿動蛋白（Nogo）A-RhoA/Rho相關(guān)蛋白激酶（ROCK）信號通路參與自發(fā)性高血壓大鼠心肌肥厚與纖維化的調(diào)節(jié)［2］。勿動蛋白（Nogo）A是髓鞘相關(guān)軸突生長抑制蛋白，抑制神經(jīng)細胞的遷移和擴散，NogoA通過與Nogo受體結(jié)合，激活RhoA及其效應(yīng)子Rho相關(guān)蛋白激酶（ROCK），抑制軸突生長。ROCK抑制劑法舒地爾上調(diào)腎上腺髓質(zhì)細胞Ca2+依賴性或諾考達唑敏感途徑的去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運蛋白（NET）功能［3］。本研究擬探討Nogo與ROCK對心臟交感神經(jīng)重塑與NET表達的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料和實驗動物 胰島素、4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、胰蛋白酶購自美國Sigma公司；DMEM F-12（1∶1）、胎 牛 血 清、B-27supplement、antibiotic antimycotic購自美國Gibco公司；去甲腎上腺素購自美國J&K公司、Nogo-66購自美國BIOSS公司、去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運蛋白抑制劑（Edivoxetine）購自美國AdooQ公司、選擇性的Rho抑制劑（Fasudil）與ROCK特異性抑制劑（Y-27632）購自美國Selleck公司、酪氨酸羥化酶（TH）抗體購自英國Abcam公司、去甲腎上腺素ELISA試劑盒購自武漢華美生物工程有限（CUSABIO BIOTECH）公司。出生后1～3 d齡SD乳鼠36只，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司（許可證編號：SYXK（京）2017-0022）。

1.2 方法

1.2.1 心肌細胞分離培養(yǎng) SD乳鼠在75%酒精中浸泡后，開胸取出心室肌，用無血清DMEM培養(yǎng)基清洗3～4次。將心臟用眼科尖剪剪成約1 mm大小的碎塊，用分次消化法將心肌碎塊用0.25%胰蛋白酶消化成心肌細胞懸液，每次消化10 min，將每次消化得到的心肌細胞懸液用200目的尼龍網(wǎng)濾去細胞團塊。將上述細胞懸液離心后用培養(yǎng)液稀釋成細胞密度約2×105個/ml，然后將其種植于小培養(yǎng)瓶內(nèi)，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2～3 h，以使成纖維細胞貼壁，將懸浮細胞液轉(zhuǎn)染至新的細胞培養(yǎng)皿內(nèi)，37℃5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)。在種植心肌細胞之前，每個小培養(yǎng)皿內(nèi)預(yù)先放置一個涂有鼠尾膠的直徑為24 mm的圓蓋片，將這些標(biāo)本放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育72或96 h，中間48 h更換1次培養(yǎng)液。用作聯(lián)合培養(yǎng)的心肌細胞培養(yǎng)的懸液留待后用。

1.2.2 脊髓背根神經(jīng)元細胞分離培養(yǎng) 出生3 d內(nèi)的SD大鼠，用2%戊巴比妥鈉麻醉（30 mg/kg，ip）后，在無菌條件取雙側(cè)脊髓胸腰段背根神經(jīng)節(jié)，放入盛有4℃無血清DMEM/F12培養(yǎng)基液的平皿中，眼科剪將神經(jīng)節(jié)剪至0.5 mm3大小的組織塊，并用無血清DMEM/F12培養(yǎng)基沖洗3遍。將組織塊移入加有0.25%胰蛋白酶的離心管中，37°C培養(yǎng)箱中消化20 min。加入胎牛血清終止消化并吹打，200目濾網(wǎng)過濾。細胞懸液以離心半徑19.0 cm、1 000 r/min離心10 min，棄上清。用DMEM-F12重懸細胞，并接種入培養(yǎng)皿內(nèi)，差速貼壁50 min。小心收集細胞懸液，再次以離心半徑19.0 cm、1 000 r/min離心10 min。用神經(jīng)元細胞完全培養(yǎng)基重懸（含1%胎牛血清，2%B27添加劑和2 mmol/L谷氨酞胺的NeuralBasal培養(yǎng)基）重懸細胞，對細胞進行計數(shù)，調(diào)整細胞密度為5×105個/ml。接種于預(yù)先以多聚賴氨酸和層粘連蛋白包被的細胞培養(yǎng)皿中，在37℃5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后更換含5-氟鳥嘧啶的神經(jīng)元細胞培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 細胞鑒定-免疫熒光 待細胞生長至80%以上時，常規(guī)胰酶消化終止后，按5×105個/ml的量將細胞鋪于24孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)。24 h后，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次。用4%多聚甲醛室溫固定細胞10 min。PBS洗滌3次，加入1∶200稀釋的cTnT抗體（用于心肌細胞鑒定）和Nestin抗體（用于神經(jīng)元細胞鑒定），4℃過夜反應(yīng)。PBS洗滌3次×5 min，加入1：200稀釋的Goat Anti-Rabbit IgG H&L（Alexa Fluor 488），室溫避光反應(yīng)45 min。PBS洗滌3次，加入DAPi工作液，避光反應(yīng)15 min。PBS洗滌10次×5 min后，在倒置熒光顯微鏡下進行觀察拍照。

1.2.4 細胞模型 細胞按常規(guī)消化終止后用生長培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度為1×105個/ml，其中后續(xù)用于共聚焦檢測的細胞鋪于共聚焦培養(yǎng)皿內(nèi)，150μl/皿；用于實驗的細胞鋪于6孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，1.5 ml/皿；24 h后分為4組：A組（心肌細胞+交感神經(jīng)節(jié)細胞）；B組（心肌細胞+交感神經(jīng)節(jié)細胞+Nogo-66）；C組（心肌細胞+交感神經(jīng)節(jié)細胞+C3轉(zhuǎn)移酶+Nogo-66）；D組（心肌細胞+交感神經(jīng)節(jié)細胞+Y-2763+Nogo-66）。

1.2.5 免疫熒光 細胞模型結(jié)束后，棄掉細胞原培養(yǎng)基，加入150μl細胞固定劑，室溫固定15 min；用PBS洗滌2次；加入1∶200稀釋的去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運蛋白或酪氨酸羥化酶抗體，4℃過夜反應(yīng)；用PBS洗滌3次；PBS洗滌3次×5 min，加入1∶200稀釋的Goat Anti-Rabbit IgG H&L（Alexa Fluor 488），室溫避光反應(yīng)45 min；PBS洗滌3次，加入DAPi工作液，室溫避光反應(yīng)15 min；PBS洗滌10次×5 min后，在倒置熒光顯微鏡下進行觀察拍照；通過Image J軟件分析目的蛋白熒光強度。

1.2.6 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測 蛋白濃度調(diào)整：用樣品稀釋液調(diào)整待測樣品蛋白濃度為1 mg/ml，試劑盒平衡室溫后使用。設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測樣品孔、空白孔。標(biāo)準(zhǔn)品，50μl/孔，去甲腎上腺素（NE）120、80、40、20、10、0 ng/L。待測樣品10μl/孔，同時加入40μl樣品稀釋液。直接加入100μl/孔標(biāo)記抗體工作液，37℃反應(yīng)1 h。用洗滌液洗滌酶標(biāo)板3次，拍干。加TMB顯色液，100μl/孔，37℃避光反應(yīng)15～30 min，加終止液，50μl/孔。450 nm下讀取吸光值（A），以標(biāo)準(zhǔn)品濃度和吸光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中NE。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 21.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以（±s）表示，多組之間的均數(shù)比較用單因素方差分析（ANOVA）和Bonferroni post-hoc檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組免疫熒光染色檢測TH表達 免疫熒光染色結(jié)果顯示，與A組（1.00±0.00）比較，B組（0.07±0.01）交感神經(jīng)節(jié)酪氨酸羥化酶（TH）表達明顯降低，C組（1.99±0.55）與D組（2.13±0.72）TH表達明顯增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖1）。

圖1 免疫熒光染色檢測TH表達（×200）

2.2 各組培養(yǎng)液中去甲腎上腺素含量 ELISA檢測結(jié)果顯示，與A組（117.34±2.47）ng/L比較，B組［（94.32±7.34）ng/L］去甲腎上腺素含量明顯降低，C組［（124.61±2.97）ng/L）與D組［（127.19±3.54）ng/L）去甲腎上腺素含量明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 各組NET表達 免疫熒光染色結(jié)果顯示，與A組（1.00±0.00）比較，B組（0.07±0.01）TH表達明顯降低，C組（1.99±0.55）與D組（2.13±0.72）TH表達明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖2）。

圖2 免疫熒光染色檢測NET表達（×200）

3 討論

高血壓心肌肥厚時存在交感神經(jīng)興奮性增高，心肌去甲腎上腺素含量增高，心肌去甲腎上腺素含量增高（即心臟交感神經(jīng)功能重構(gòu)）與心臟交感神經(jīng)密度降低（即心臟交感神經(jīng)結(jié)構(gòu)重構(gòu)）顯著負相關(guān)，心臟交感神經(jīng)分布與興奮性異常與高血壓心肌肥厚密切相關(guān)［1］。但是，心肌去甲腎上腺素含量長期處于較高濃度會引起神經(jīng)生長因子減少，導(dǎo)致心臟交感神經(jīng)纖維密度減低，出現(xiàn)心臟交感神經(jīng)重塑［5］?？梢?，調(diào)控心肌去甲腎上腺素含量是干預(yù)心肌肥厚的核心環(huán)節(jié)。心臟交感神經(jīng)突觸前膜上的去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運蛋白（NET）是控制心肌間質(zhì)中去甲腎上腺素濃度的最重要因子［4-6］。全身交感神經(jīng)釋放的去甲腎上腺素絕大部分通過位于腎上腺素能神經(jīng)突觸前膜NET再攝取回突觸前膜內(nèi)，NET對調(diào)控突觸間隙中的NE濃度、終止神經(jīng)沖動信號、維持受體對神經(jīng)遞質(zhì)的敏感性極為重要［7］。然而，高血壓心肌肥厚時心臟交感神經(jīng)重塑與NET表達調(diào)節(jié)的上游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制還不完全清楚。

神經(jīng)元軸突生長抑制因子Nogo有3種同源異構(gòu)體：Nogo-A、Nogo-B、Nogo-C［8］。Nogo受體（Nogo protein receptor，NgR）是由結(jié)構(gòu)相關(guān)的分子NgR1、NgR2和NgR3構(gòu)成的蛋白質(zhì)家族［9］。NgR定位于脊髓、眼和橫紋肌（包括心臟），并認為在生物演變過程中，Nogo和NgR的表達和其保守性支持Nogo信號是神經(jīng)系統(tǒng)和橫紋?。òㄐ呐K）發(fā)育的一個關(guān)鍵通路［10］。Nogo可通過激活NgR的復(fù)合受體（由NgR、p75NTR和Lingo-1組成）激活小鳥嘌呤核苷三磷酸酶（small GTPases）的Rho家族成員（rho、rac1、cdc42）及內(nèi)源性第二信使。Rho蛋白家族是真核細胞內(nèi)一類重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，是許多膜表面受體如G蛋白耦聯(lián)受體、酪氨酸激酶受體、細胞因子受體和黏附分子受體的下游效應(yīng)蛋白，在細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮著“分子開關(guān)”的作用，快速轉(zhuǎn)換于GTP結(jié)合的活化狀態(tài)和GDP結(jié)合的非活化狀態(tài)之間，將細胞外信號傳至細胞內(nèi)。Rho A與其下游效應(yīng)蛋白Rho激酶（Rho kinase，ROCK）參與調(diào)節(jié)肌動蛋白細胞骨架和粘著斑/應(yīng)力纖維形成，在交感神經(jīng)系統(tǒng)多種功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。Rho激酶（Rho kinase，ROCK）抑制劑（Fasudil）降低自發(fā)性高血壓大鼠腎上腺髓質(zhì)交感神經(jīng)活性，降低血漿兒茶酚胺、腎上腺髓質(zhì)酪氨酸羥化酶蛋白和mRNA水平。本研究Nogo抑制交感神經(jīng)節(jié)細胞生長與去甲腎上腺素的釋放；阻斷RhoA/ROCK信號通路后，Nogo對交感神經(jīng)節(jié)細胞生長與去甲腎上腺素釋放的抑制作用消失。提示，Nogo介導(dǎo)ROCK參與交感神經(jīng)節(jié)細胞生長與去甲腎上腺素釋放的調(diào)節(jié)。

RhoA/ROCK信號通路參與視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞軸突生長的調(diào)節(jié)。ROCK抑制劑（Fasudil）能夠通過腎上腺髓質(zhì)細胞Ca2+依賴性的和或諾考達唑（nocodazole）敏感途徑上調(diào)NET的再攝取功能［11］。Rho/ROCK信號通路激活也可以導(dǎo)致快速的生長錐萎陷，從而使神經(jīng)元軸突損傷后很難再生［12］。因此，推測RhoA/ROCK信號通路極可能通過調(diào)節(jié)心臟交感神經(jīng)重塑與NET表達參與高血壓心肌肥厚的調(diào)節(jié)。以往的研究提示，高血壓心肌肥厚患者心臟交感神經(jīng)分布減低，心臟神經(jīng)元軸突生長抑制因子Nogo-A表達增加，心臟交感神經(jīng)分布減低與Nogo-A表達增加呈顯著負相關(guān)。本研究進一步證明，Nogo抑制NET的表達；阻斷RhoA/ROCK信號通路后，Nogo對NET的抑制作用消失。提示，Nogo與ROCK參與心臟交感神經(jīng)重塑及NET表達的調(diào)節(jié)。