徐素素，高 靜，陳軍文，赫京生，劉祥宇，張敬麗

(1.云南農業(yè)大學 園林園藝學院，云南 昆明 650201；2.云南農業(yè)大學 西南中藥材種質創(chuàng)新與利用國家地方聯合工程研究中心，云南 昆明 650201；3.云南農業(yè)大學 云南省藥用植物生物學重點試驗室，云南 昆明 650201；4.云南農業(yè)大學 農學與生物技術學院，云南 昆明 650201)

石斛屬(DendrobiumSw.)植物為蘭科(Orchidaceae)附生草本，中國有76種，主要分布在華南及西南地區(qū)，其中可作藥用的有40 余種[1]?，F代藥理學研究表明：石斛富含多糖、生物堿和香豆素等化學成分，具有抗衰老、抑制腫瘤和降血糖等功效[2-5]。由于石斛屬植物集觀賞和藥用價值于一體，市場需求量大，無節(jié)制的采摘導致野生石斛資源匱乏甚至滅絕[6-7]。此外，石斛屬植物近緣種間形態(tài)特征十分相似，石斛藥材中常混有金石斛屬、石仙桃屬和石豆蘭屬的某些物種[8]。石斛具有益胃生津和滋陰清熱等功效，用于治療熱病津傷，口干煩渴，胃陰不足，食少干嘔，病后虛熱不退，陰虛火旺，骨蒸勞熱，目暗不明，筋骨痿軟[9]；而石仙桃具有養(yǎng)陰清肺和利濕消瘀等功效，用于治療眩暈，頭痛，咳嗽，吐血，夢遺，痢疾，白帶，疳積[10]?？梢?，石斛與石仙桃的主治功能截然不同，而且干燥后的石斛藥材僅憑傳統形態(tài)學鑒定更加困難。為了保證藥用石斛的臨床療效和安全應用，亟須一種簡單、高效的鑒定方法對其進行準確的鑒定。

傳統的鑒定方法難以完全實現對中藥材的準確鑒定。DNA 條形碼(DNA barcoding)是一種分子診斷技術，于2003 年由加拿大大學的HEBERT教授首次提出[11]，主要利用基因組中1 段公認標準的、相對較短的DNA 片段，對不同物種進行快速、準確地識別和鑒定。DNA 條形碼技術簡單、快速和高效，避免了主觀和客觀等因素，被認為是物種鑒定及系統進化分析的有效手段[12-16]。目前，國際上公認的植物DNA 條形碼候選序列主要有ITS、ITS2、psbA-trnH、matK 和rbcL[17]。《中國藥典》2015 年版收載DNA 條形碼技術指導原則建立了植物類采用ITS2/ITS 為主、葉綠體psbA-trnH 為輔的中藥材鑒定體系。CHEN等[15,18]首次建立了以ITS2 為核心、psbA-trnH 為輔的植物類藥材的DNA 條形碼鑒定體系，并提出以ITS2 序列作為植物通用DNA 條形碼，極大提升了中藥材鑒定能力。

DNA 條形碼技術在石斛屬中的應用越來越廣泛[19]。相關研究利用DNA 條形碼技術已成功區(qū)分多個石斛屬物種[20-22]。本研究以金釵石斛(D.nobile)、流蘇石斛(D.fimbriatum)和密花石斛(D.densiflorum)等12種藥用石斛共82 個樣品為研究材料，以核基因片段ITS 和ITS2 序列以及葉綠體基因片段psbA-trnH 和matK 序列為研究對象，并從GenBank 數據庫中下載44 條相關石斛及混偽品序列，以期尋找最適于藥用石斛及其混偽品高效準確的鑒定方法，為藥用石斛的臨床療效和安全應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究用于DNA 條形碼分析的82 份藥用石斛材料均來自云南野蘭堂生物科技有限公司蘭科植物種質資源圃，樣品主要采自云南、廣西、海南和四川等省的野外并且來自多個居群，所有樣品均由云南農業(yè)大學中藥材研究所和中國科學院昆明植物研究所相關專家進行鑒定(表1)，憑證標本保留在云南農業(yè)大學云南省藥用植物生物學重點實驗室。所選12種石斛在分布范圍上屬于狹域分布，參考高連明等[23]關于DNA 條形碼采集規(guī)范，建議狹域分布物種樣本數量需采集5種以上，故本研究對每種植株隨機采集5～7 株植物個體的當年生新鮮葉片，能夠代表所采物種整個分布區(qū)的不同居群的遺傳多樣性。用75%的乙醇清洗葉片表面，并正確標記采樣名稱及采樣編號，然后用硅膠快速干燥放入-80 ℃冰箱低溫保存。從GenBank 數據庫中下載相關石斛種及混偽品的序列44 條(表2)用于后續(xù)分析。

表1 石斛屬植物樣本采集信息Tab.1 Sample information of Dendrobium species

表2 從GenBank 中下載序列信息Tab.2 The information of sequences downloaded from GenBank

1.2 植物基因組DNA的提取

在研缽中放入0.2 g 石斛新鮮葉片，加入液氮冷凍，快速將葉片研磨成粉，參考李金璐等[24]改良的CTAB 法進行總DNA的提取，并長期保存在-20 ℃冰箱，防止DNA 發(fā)生降解。

通用引物和PCR 反應條件參考CHEN 等[15]的研究，通用引物在擎科生物科技有限公司昆明分部合成。ITS、ITS2、psbA-trnH 及matK 擴增引物見表3。PCR 擴增體系總體積為25 μL：2×TaqPCR Mix 12.5 μL，DNA 模板2 μL，正、反向引物各1 μL，ddH2O 8.5 μL。擴增完成后，用1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR 產物進行檢測。將擴增成的PCR 產物送至擎科生物科技有限公司，進行雙向測序。

表3 序列引物Tab.3 The sequence primers

1.3 數據處理

通過序列拼接軟件Seq Man 對試驗獲得的雙向測序結果進行校對拼接，去除低質量序列及引物區(qū)?；陔[馬爾科夫模型(HMMer)的注釋方法[25]，去除5.8S 和28S 區(qū)段獲得ITS2 間隔區(qū)序列。使用MEGA 7.0 (molecular evolutionary genetics analysis)軟件進行序列特征、DNA 條形碼序列間隔(barcoding gap)和系統發(fā)育分析；利用Edit seq 軟件對4 條序列進行組合，基于Kimura 2-parameter (K2P)模型計算種內和種間遺傳距離及構建NJ 系統發(fā)育樹，用自舉檢驗法(bootstrap test)檢驗系統各分支的置信度，共循環(huán)1 000次，支持率僅展示≥60%的數值。

2 結果與分析

2.1 總DNA 提取、PCR 擴增及測序

對提取的82 個樣品的總DNA 進行檢測，DNA 條帶均明亮且清晰；利用4 對通用引物對總DNA 片段進行PCR 擴增，擴增產物均呈現整齊、單一明亮的條帶，4 條序列的擴增成功率均為100% (圖1)。測序結果表明：大多數序列的檢測結果較為理想，峰圖清晰、基線平整；ITS 與ITS2 序列測序成功率最高為97.6%，其次是matK序列為96.3%，psbA-trnH 序列最低為95.1%；4 條序列的測序成功率都高達95%以上，均可用于后續(xù)試驗數據分析。

圖1 部分樣品PCR 擴增瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis with PCR amplification of some samples

2.2 序列特征分析

由表4 可知：用于分析的ITS 序列有93 條、ITS2 序列91 條、psbA-trnH 序列93 條和matK 序列82 條，其中包括從GenBank 數據庫中下載的11 條ITS 序列、11 條ITS2 序列和9 條psbA-trnH序列。比對后的序列長度為matK＞psbA-trnH＞ITS＞ITS2，均小于1 000 bp，滿足理想的DNA 條形碼長度的要求。GC 平均含量為ITS＞ITS2＞psbA-trnH＞matK，其中ITS 和ITS2 序列的GC 含量與psbA-trnH 和matK的GC 含量差異較大。ITS2 序列的變異位點最多，占總位點數的65.6%；ITS 序列變異位點占總位點數的58.9%；psbAtrnH 序列變異位點占總位點數的14.9%；matK 序列的變異位點最少，僅占總位點數的11.5%。

表4 4 條序列在12種藥用石斛中的序列特征Tab.4 The sequence characteristics of four sequences in medicinal Dendrobium species

2.3 DNA 條形碼序列間隔分析

由圖2 可知：4 條序列的平均遺傳距離為ITS2＞ITS＞psbA-trnH＞matK，數值分別為0.238、0.180、0.031 和0.019；種內平均遺傳距離ITS2＞ITS＞psbA-trnH=matK，數值分別為0.009、0.007、0.001 和0.001；種間平均遺傳距離為ITS2＞ITS＞psbA-trnH＞matK，數值分別為0.260、0.195、0.036和0.021。經過比對可知：ITS2 序列的變異性最大，matK 和psbA-trnH 序列較保守，ITS 序列與ITS2 序列的平均種內種間遺傳距離趨勢大致相同并且重疊較少，因此，ITS 和ITS2 序列被認為具有理想DNA 條形碼的特征。

圖2 4 條序列的條形碼序列間隔圖Fig.2 The barcoding gap diagram of four sequences

2.4 系統發(fā)育分析

由圖3 可知：ITS 和ITS2 序列將系統發(fā)育樹分為13 支，將12種藥用石斛及混偽品區(qū)分開，并且具有較高支持度，可靠性高；psbA-trnH 序列將系統發(fā)育樹分為9 支，只區(qū)分出9種石斛，未能把石斛組的疊鞘石斛、雙斑疊鞘石斛和流蘇石斛及混偽品區(qū)分開；matK 序列將系統發(fā)育樹分為11 支，將10種藥用石斛及混偽品區(qū)分開，未能把石斛組的疊鞘石斛和流蘇石斛區(qū)分開。由圖4 可知：4 條序列聯合構建的系統發(fā)育樹與ITS和ITS2 單序列構建的系統發(fā)育樹分支相似，但是支持度較高。因此，ITS 和ITS2 序列對藥用石斛的鑒定效果優(yōu)于psbA-trnH 和matK 序列。

圖3 基于ITS、ITS2、psbA-trnH 和matK 單序列構建的NJ 系統發(fā)育樹Fig.3 NJ phylogenetic tree based on ITS,ITS2,psbA-trnH and matK sequences

圖4 多序列聯合構建NJ 系統發(fā)育樹Fig.4 Construction of NJ phylogenetic tree by multiple sequences.

3 討論

3.1 石斛屬植物DNA的提取、PCR 擴增及測序

PCR 擴增及測序成功率是評價DNA 條形碼技術實用性及通用性的指標。本研究中，4 條候選序列(ITS、ITS2、psbA-trnH 和matK)擴增成功率均為100%，其中ITS 和ITS2 測序成功率都為97.6%，其次是matK 為96.3%，psbA-trnH 相對較低，為95.1%；但是4 條序列的測序成功率都高達95%以上。前人研究顯示：ITS 和ITS2序列在山茶屬和委陵菜屬植物中很難擴增或者測序成功[26-27]，ITS 序列在雞血藤植物中測序成功率較低[28]，本研究中4 條序列利用通用引物進行擴增及測序成功率都很高，說明ITS、ITS2、psbA-trnH 和matK 序列在石斛屬中比較容易獲得。

3.2 序列間隔評估

序列間隔是探究某一序列作為理想條形碼的重要依據，物種的種內與種間遺傳距離應該有足夠的間隔區(qū)。本研究基于4 條序列構建的序列間隔圖中，ITS 序列與ITS2 序列的種內種間遺傳距離趨勢大致相同，ITS 和ITS2 序列在供試材料種內和種間比psbA-trnH 和matK 序列存在的重疊部分少，具有序列間隔，更傾向于理想的DNA條形碼。黃海[29]對石斛屬植物DNA 條形碼序列的篩選發(fā)現ITS 序列具有明顯的序列間隔；張忠廉等[30]對千斤拔屬藥用植物DNA 條形碼鑒定研究中發(fā)現ITS2 序列在序列間隔檢驗中具有顯著間隔，與本研究結果一致。綜上所述，ITS 和ITS2序列可以作為藥用石斛鑒定的候選DNA 條形碼序列。

3.3 DNA 條形碼的篩選及物種鑒定

DNA 條形碼的關鍵作用是能夠對不同物種進行快速準確的鑒定，前人對石斛屬植物條形碼進行了大量研究工作。王暉等[31]選擇rbcL、matK 及ITS2 序列探討石斛屬植物發(fā)育關系發(fā)現：ITS2 序列不僅具有最大的種內和種間遺傳變異，而且有明顯的序列間隔，分支支持率也最高。王暉等[31]和NGUYEN 等[32]研究表明：在石斛屬植物中ITS 和ITS2 序列鑒定能力最強。在本研究中，ITS 和ITS2 序列的變異度與種間和種內遺傳距離范圍均大于psbA-trnH 和matK 序列，序列間隔重疊少，并且能夠成功區(qū)分來自9 個組的12種藥用石斛及其混偽品；基于psbA-trnH和matK 序列構建的系統發(fā)育樹中，除了石斛組的4種石斛分布較散亂，沒有聚在1 個大支上，其余均能區(qū)分開，證明psbA-trnH 和matK 序列也具有一定的鑒別能力；通過多序列聯合構建的系統發(fā)育樹除分支支持度較高外，分類與ITS 和ITS2 單序列構建的系統發(fā)育樹相似。

栗丹等[33]利用ITS 序列對石斛進行鑒定，將傳統分組中不在石斛組的重唇石斛、鉤狀石斛、鼓槌石斛和叉唇石斛分在了石斛組；李海霞[34]對石斛屬66 條ITS 序列以及外群密花石豆蘭和云南石仙桃構建NJ 系統發(fā)育樹發(fā)現有6 個物種與傳統分類方法不一致；本研究中石斛組的金釵石斛和瘦軸組的鉤狀石斛始終聚為1 個分支，說明傳統的形態(tài)學鑒定與分子生物學鑒定存在一定的差異。因此，不同物種分類鑒定時，分子生物學鑒定需要傳統鑒定方法加以輔助，才能達到對物種精確鑒定的目的。

CHEN 等[15]通過大量的研究提出將ITS2 作為藥用植物鑒定的通用條形碼序列，中國植物DNA 條形碼研究組也建議將ITS/ITS2 序列作為種子植物的核心條形碼[35]，后續(xù)也有較多相關研究表明ITS 或ITS2 序列有較強的鑒別能力[36-40]。從本研究構建的系統發(fā)育樹分析表明：ITS 和ITS2 序列在12種藥用石斛及混偽品中的物種鑒定效率高于psbA-trnH 和matK 序列；通過多序列聯合構建的系統發(fā)育樹進一步驗證了ITS 和ITS2 單序列建樹的準確性，也證明matK 和psbA-trnH 序列能夠提高對石斛屬植物的鑒別能力。但是，DNA 條形碼技術也存在一定的局限性，對于存儲時間過長或加工過的藥材鑒定困難，也無法對天然礦物類的藥材進行鑒定[41-42]。另外，DNA 條形碼技術只能鑒別藥材真?zhèn)?，無法進行藥材質量評價[43]。至今未找到可以對所有生物進行鑒定的通用序列，因此，DNA 條形碼鑒定體系的完善需要多條序列聯合應用。

4 結論

ITS 和ITS2 測序成功率高于matK 和psbAtrnH 序列，且ITS 和ITS2 序列種內和種間存在重疊的部分較少，具有序列間隔；ITS 和ITS2 序列能夠成功區(qū)分所研究的12種藥用石斛及混偽品，psbA-trnH 和matK 序列未能把全部石斛區(qū)分開；4 條序列聯合構建的系統發(fā)育樹與ITS 和ITS2 單序列構建的系統發(fā)育樹相似。因此，以ITS 和ITS2 序列為主、psbA-trnH 和matK 序列為輔的DNA 條形碼鑒定方法能夠對藥用石斛及其混偽品進行快速準確的鑒定。