諶穎蓮，曾德軍，趙貴軍，封孝蘭，張承露，吳佳勇，竭 航

(重慶市藥物種植研究所，特色生物資源研究與利用川渝共建重點實驗室，重慶 408435)

麝香是一種珍貴的動物源藥材，具有較高的藥用價值和香料價值[1-4]，但其形成過程復(fù)雜且未知，限制了麝香產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和產(chǎn)香效率的提高。研究表明：麝香的化學(xué)組分包括脂肪酸類的烷烴物質(zhì)或衍生的醇類、酮類和醛類 (如麝香酮、6-甲基庚烷-1,6-二醇和十六烯醛等)以及固醇類、甾類和芳香族類物質(zhì) (如膽固醇、間甲酚和二氫雌甾酮等)[2]，這些化學(xué)組分對麝香形成至關(guān)重要，同時也是麝香藥用和香用價值的關(guān)鍵物質(zhì)。動物的脂肪酸合酶(fatty acid synthase，F(xiàn)ASN)、3-羥基-3-甲基-戊二酰輔酶A 還原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase，HMGCR)和細(xì)胞色素P450 家族11 亞家族A1 (CYP11A1)是長鏈的脂肪酸類衍生物、大環(huán)碳鏈酮類以及芳香族甾類物質(zhì)合成的關(guān)鍵酶[5-9]?；邝晗愕幕瘜W(xué)組分和合成相關(guān)化學(xué)組成的關(guān)鍵酶，在林麝(Moschus berezovskii)中篩選調(diào)控FASN、HMGCR和CYP-11A1基因表達的調(diào)控因子，對探究麝香可能的生物合成機制具有重要意義。

MicroRNA (miRNA)是一種長度約為20 nt的非編碼RNA，通過作用靶基因mRNA的3′-UTR 在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因的表達，對動物的生長和代謝等過程具有關(guān)鍵的調(diào)控作用[10-11]。篩選調(diào)控林麝FASN、HMGCR和CYP11A1基因表達的miRNAs 能夠進一步了解麝香的生物合成過程，然而現(xiàn)在已知的林麝基因序列信息非常少，缺少林麝基因的mRNA 和miRNA 序列信息[1,12]。由于牛(Bos taurus)、山羊(Capra hircus)和綿羊(Ovis aries)與林麝編碼基因的3′-UTR 序列并不完全一致，通過同源物種來推測調(diào)控林麝基因的miRNAs 獲取信息并不完整，缺少適合預(yù)測林麝miRNAs的工具。本研究通過基于Smith-Waterman 局部序列比對算法[13]編寫的SWChen系統(tǒng)對調(diào)控林麝FASN、HMGCR和CYP11A1基因表達的miRNAs 進行預(yù)測篩選，并以人(Homo sapiens)的FASN基因為例，與TargetScan、mi-RDB 和miRSytem 預(yù)測軟件和miRTarBase 數(shù)據(jù)庫比較，評價SWChen 系統(tǒng)對miRNAs 預(yù)測能力；利用代謝組學(xué)測序來確定麝香的化學(xué)成分，對與合成相關(guān)化學(xué)成分有關(guān)的FASN、HMGCR和CYP11A1基因進行miRNAs 預(yù)測，以林麝、牛、山羊和綿羊預(yù)測的結(jié)果進行集合論分析確定候選miRNAs，以期為麝香的生物合成機制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

118 頭健康成年雄性林麝 (5 歲) 飼養(yǎng)于重慶市藥物種植研究所林麝養(yǎng)殖基地(N29°，E107°，海拔678 m)，飼養(yǎng)采用精飼料和青綠飼料[紅薯藤 (Ipomoea batatas)和光葉海桐 (Pittosporum glabratum)嫩葉]相結(jié)合的方式，自由采食。精飼料包括 65%玉米、25%大豆、6%麥麩、0.4%食鹽、1.5% CaCO3、0.8% CaHPO4、0.15%維生素和0.15%礦物質(zhì)。每天17：30 混合精飼料與紅薯藤等補充飼喂。

1.2 樣品采集

在5—6 月泌香盛期，采用微創(chuàng)香腺采集法獲取林麝香腺組織樣本，立刻放入RNA 保存液中并轉(zhuǎn)移至-80 ℃保存；在11—12 月麝香成熟階段，通過“活麝取香”法采取林麝成熟麝香3 份，置于離心管內(nèi)保存。

1.3 代謝組檢測

將采集到的麝香樣品送至上海百趣生物有限公司采用GC-MS 進行非靶標(biāo)代謝組學(xué)檢測，使用甲醇—氯仿(體積比為3∶1)溶液進行萃取，通過總離子流圖信號獲取麝香的主要化學(xué)成分及相對含量。

1.4 轉(zhuǎn)錄組測定及序列分析

通過總RNA 提取后，送樣至上海生工生物科技有限公司采用Hi-seq 2500 測序。然后將測序數(shù)據(jù)進行Trinity 拼接、序列比對和功能注釋等獲得FASN、HMGCR和CYP11A1基因mRNA 序列并進行結(jié)構(gòu)分析，確定3′-UTR 序列以及林麝miRNAs 序列數(shù)據(jù)；以牛、山羊和綿羊為參考，對3 個基因的3′-UTR 序列進行比對，并使用MEGA 6.0 及最大似然法構(gòu)建進化樹；通過RNA 二級結(jié)構(gòu)分析(unafold.rna.albany.edu)了解各物種基因3′-UTR 序列的差異情況。

1.5 SWChen 系統(tǒng)對miRNAs 預(yù)測準(zhǔn)確性的驗證

由于目前常用的miRNAs 預(yù)測軟件如miRSystem (mirsystem.cgm.ntu.edu)、TargetScan (www.targetscan.org)和miRDB (mirdb.org)僅預(yù)測部分常見物種的miRNAs，無法對調(diào)控林麝基因的miRNA 進行準(zhǔn)確預(yù)測，因此，本研究在miRBase 數(shù)據(jù)庫(www.mirbase.org)下載人的miRNAs序列，并在GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)查詢?nèi)薋ASN基因3′-UTR 序列(NM_0041 04.5)，利用SWChen系統(tǒng) (https://github.com/YLCHEN1992/SWChen)對調(diào)控FASN表達的miRNAs 進行預(yù)測，通過與在線軟件miRSystem、TargetScan 和miRDB的預(yù)測結(jié)果比較，以miRTarbase 數(shù)據(jù)庫(mirtarbase.cuhk.edu.cn)中調(diào)控FASN表達的全部miRNAs (miRTarget_All)和具有強力證據(jù)可調(diào)控人FASN基因表達的miRNAs(miRTarget_High)作為參考，檢測SWChen 系統(tǒng)對miRNA 預(yù)測的準(zhǔn)確性。

1.6 調(diào)控FASN、HMGCR 和CYP11A1 基因表達的miRNA 預(yù)測

將得到的林麝mRNA 3′-UTR 序列及獲得的林麝miRNAs 數(shù)據(jù)庫利用SWChen 系統(tǒng)進行分析，預(yù)測調(diào)控林麝FASN、HMGCR和CYP11A1基因表達的miRNAs；在GenBank 中獲取牛、山羊和綿羊FASN、HMGCR和CYP11A1基因的mRNA序列(表1)。在miRBase 數(shù)據(jù)庫獲取牛、山羊和綿羊的miRNA 序列，由于綿羊miRNA 數(shù)量較少，將山羊和綿羊miRNA 進行整合得到羊的miRNA數(shù)據(jù)庫，共同用于山羊和綿羊miRNA的預(yù)測分析。利用SWChen 系統(tǒng)預(yù)測調(diào)控牛、山羊和綿羊FASN、HMGCR和CYP11A1基因的候選miRNAs，并通過雙閾值(種子序列匹配評分及親和程度評分同時考慮)預(yù)測調(diào)控基因表達的miRNAs，以增加預(yù)測精度，最后將預(yù)測結(jié)果進行集合論分析以期獲取麝香合成相關(guān)和候選miRNAs 分子。

表1 物種基因序列GenBank 編號Tab.1 GenBank No.of species gene sequence

2 結(jié)果與分析

2.1 SWChen 系統(tǒng)miRNA 功能預(yù)測結(jié)果

由圖1 可知：SWChen 通過種子區(qū)匹配預(yù)測(single)調(diào)控人FASN的基因共有193 條，其中匹配miRTarget_All 數(shù)據(jù)8 條，匹配miRTarget_High數(shù)據(jù)3 條，而調(diào)高miRNA 與mRNA 親和力判定閾值后(雙閾值)與miRTarbase 數(shù)據(jù)庫不匹配；TargetScan 在線軟件預(yù)測有745 條，其中匹配miRTarget_All 數(shù)據(jù)15 條，匹配miRTarget_High數(shù)據(jù)3 條；miRSystem 在線軟件預(yù)測有62 條，其中匹配miRTarget_All 數(shù)據(jù)4 條，匹配miRTarget_High 數(shù)據(jù)4 條；miRDB 在線軟件預(yù)測有47條，其中匹配miRTarget_All 數(shù)據(jù)6 條，匹配miRTarget_High 數(shù)據(jù)2 條。4 個軟件預(yù)測的miRNAs結(jié)果集合統(tǒng)計(圖2)顯示：TargetScan 出現(xiàn)530條獨立miRNAs，miRSystem 和miRDB 分別出現(xiàn)10 條和1 條獨立的miRNAs；SWChen 系統(tǒng)總共出現(xiàn)3 條獨立的miRNAs，有186 條與Target-Scan 結(jié)果重疊，31 條與miRSystem 結(jié)果重疊，39 條與miRDB 結(jié)果重疊，雙閾值SWChen 結(jié)果除miRSystem 均包含在其他軟件預(yù)測結(jié)果中。

圖1 4種miRNA 預(yù)測軟件與miRTarget 數(shù)據(jù)庫匹配情況Fig.1 Comparing prediction results of four miRNA prediction softwares by using miRTarget database match

圖2 4種miRNA 預(yù)測軟件預(yù)測結(jié)果集合統(tǒng)計Fig.2 The gather statistic to resuls of four miRNA prediction softwares

2.2 林麝成熟麝香代謝組測序分析結(jié)果

林麝麝香化學(xué)組分含量最高的前10 個物質(zhì)列于表2。結(jié)果顯示：成熟麝香中的主要成分為長碳鏈的酮和醛等物質(zhì)、特殊脂肪酸碳鏈的環(huán)酮類物質(zhì)以及芳香族和甾類物質(zhì)。

表2 成熟麝香主要化學(xué)組分Tab.2 The main chemical components of matured musk

2.3 物種基因序列進化樹構(gòu)建及RNA 二級結(jié)構(gòu)分析

由圖3 可知：同一基因之間3′-UTR 序列存在差異較小，其中林麝FASN和HMGCR基因3′-UTR 序列與牛和羊被分為兩類，而林麝CYP11A1基因3′-UTR 序列與山羊和綿羊被歸為一類。進一步對各基因的3′-UTR 序列進行RNA 二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，結(jié)果(圖4)顯示：林麝、牛、山羊和綿羊FASN基因3′-UTR 序列RNA 二級結(jié)構(gòu)的最小自由能分別為-222.80、-234.60、-229.10 和-234.70 kcal/mol，HMGCR基因3 ′-UTR序列RNA 二級結(jié)構(gòu)的最小自由能分別為-466.00、-477.60、-267.20 和-1 417.30 kcal/mol，CYP11A1基因3′-UTR 序列RNA 二級結(jié)構(gòu)的最小自由能分別為-110.10、-112.90、-105.50 和-112.00 kcal/mol，其中林麝和牛FASN基因3′-UTR 與山羊和綿羊相比出現(xiàn)較多的單鏈空泡。

圖3 基因3′-UTR 序列進化樹比對Fig.3 Sequence alignment of gene 3′-UTR by evolution tree construction

圖4 各物種基因3′-UTR RNA 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.4 Predicted RNA secondary structures of gene 3′-UTR sequences in respective species

2.4 SWChen 系統(tǒng)分析各物種調(diào)控FASN、HMGCR和CYP11A1 基因表達的miRNAs

通過miRNA 轉(zhuǎn)錄組序列保守分析發(fā)現(xiàn)：林麝miRNAs 數(shù)據(jù)總有1 391 條，miRBase 數(shù)據(jù)庫中查詢牛的miRNAs 數(shù)據(jù)為1 030 條，山羊和綿羊的數(shù)據(jù)為519 條。SWChen 系統(tǒng)的種子匹配預(yù)測結(jié)果顯示：調(diào)控林麝、牛、山羊和綿羊FASN基因表達的miRNAs 在相應(yīng)數(shù)據(jù)庫中的占比分別為5.25%、5.53%、1.70%和2.38%；調(diào)控HMGCR基因表達的miRNAs 占比分別為12.55%、13.11%、10.88%和6.12%；調(diào)控CYP11A1基因表達的mi-RNAs 占比分別為3.54%、3.69%、4.76%和4.22%；在林麝和牛中，調(diào)控FASN和HMGCR基因表達的miRNAs 占比高于山羊和綿羊，而調(diào)控CYP11A1基因表達的miRNAs 占比低于山羊和綿羊。集合論分析結(jié)果(圖5 和表3)顯示：在4 個物種中，調(diào)控FASN基因表達的miRNAs 交集為miR-24-3p 和miR-30b-3p；調(diào)控HMGCR基因表達的mi-RNAs 交集為miR-29b、miR-146a 和miR-2284d；調(diào)控CYP11A1基因表達的miRNAs 交集為let-7家族。

表3 調(diào)控基因的miRNA 交集Tab.3 miRNA intersection of targeting genes

圖5 4 個物種中調(diào)控FASN、HMGCR 和CYP11A1 基因表達的miRNAs 集合分析維恩圖Fig.5 Venn diagram of miRNAs regulating FASN, HMGCR and CYP11A1 genes expression intersection analysis in four species

雙閾值分析結(jié)果顯示(表4)：調(diào)控FASN基因表達的miRNAs 僅在山羊和綿羊中存在miR-874-5p 交集；調(diào)控HMGCR基因表達的miRNAs在林麝、牛和山羊中存在miR-545-3p、miR-429和miR-181b-3p 交集，調(diào)控CYP11A1基因表達的miRNAs 僅在林麝、山羊和綿羊中存在miR-532-3p的交集。

表4 在各物種中預(yù)測調(diào)控基因的miRNAs (雙閾值)Tab.4 Predicted miRNAs targeting genes in species respectively (dual thresholds)

3 討論

SWChen 系統(tǒng)是基于Smith-Waterman 局部序列比對算法和堿基互補配對原理[11,13]，預(yù)測2 條序列之間的相互作用能力和相似性情況的程序，主要基于R 語言軟件編寫，用于RNA 之間的作用情況預(yù)測[14-17]。計分規(guī)則參數(shù)使得序列比對過程中出現(xiàn)連續(xù)3～4 個的相互匹配才能抵消1 個錯配，符合miRNA 序列種子匹配規(guī)則，通過矩陣最大值進行重新回數(shù)算分即為SWChen 系統(tǒng)的最終評分，選擇適合的評分參數(shù)對于提高相互作用預(yù)測準(zhǔn)確性具有重要意義。

Smith-Waterman 算法是評價2 條序列之間功能域和保守域的比對算法，相比BLAST 算法[18]和馬爾可夫模型[19]推算，Smith-Waterman 算法更加準(zhǔn)確，能夠滿足預(yù)測需求，但是這種算法的速度最慢，且會忽略第2 評分結(jié)合位置。miRTarBase數(shù)據(jù)庫包含了現(xiàn)有已驗證調(diào)控功能的miRNAs，而在所有物種的研究中，人FASN研究證據(jù)較多，因此以人種為對象評估SWChen 系統(tǒng)的準(zhǔn)確性具有更高的可信度。程序評估結(jié)果顯示：4種預(yù)測工具的結(jié)果差異并不大，其中SWChen 相比miRSystem 和miRDB 工具能預(yù)測出較多的候選miRNAs，匹配miRTarBase 數(shù)據(jù)庫的miRNAs條數(shù)更多；而TargetScan 預(yù)測的miRNAs 條數(shù)約為SWChen的4 倍，但匹配數(shù)據(jù)庫的miRNAs 約為SWChen的2 倍，提示SWChen的背景噪音相對TargetScan 較小。所有的miRNA 預(yù)測工具均基于miRNA 對靶基因的識別機制[11]，其中TargetScan 在計分過程中考慮結(jié)合位置的保守性和miRNA 親和程度，再去除物種序列保守性判斷之后預(yù)測的miRNAs 會增加，而SWChen 并不考慮序列保守性，同時將評分控制為80 分，即種子區(qū)域的完全匹配，占據(jù)識別機制中的大部分識別情況；而TargetScan的算法包括了miRNA 第2～8 位和第3～8 位的匹配規(guī)律[11]，因此預(yù)測出較多的候選miRNAs，但卻增加了錯誤miRNAs的噪音，這是TargetScan 和SWChen 之間預(yù)測結(jié)果差異的原因。miRSystem 系統(tǒng)為集成多種預(yù)測工具的miRNA 預(yù)測系統(tǒng)，在預(yù)測結(jié)果中獲得強有力證據(jù)的miRNAs 匹配條數(shù)最多，背景噪音相對較小，但匹配miRTarget_All 數(shù)據(jù)的數(shù)量也減少，在miRNA的靶基因研究中，miRNA 預(yù)測主要基于多工具的交集篩選，因此集成的miRSystem 會得到更多的miRTarget_High 匹配結(jié)果；雙閾值預(yù)測能夠得到較多的重疊miRNAs，暗示雙閾值的準(zhǔn)確性可能更高。SWChen 系統(tǒng)能夠滿足miRNA 靶基因預(yù)測的需求，能夠得到相對其他工具同等價值的結(jié)果，且離線預(yù)測、數(shù)據(jù)庫及參數(shù)的可變動使其更加靈活，能夠預(yù)測林麝miRNAs 對靶基因的調(diào)控情況，可為特種動物、昆蟲、植物和真菌等關(guān)鍵miRNA的篩選提供便利。

已有研究表明：麝香的形成過程主要有2種假設(shè)[1-4,12]。第一，林麝香腺分泌初香后，初香物質(zhì)儲存于香囊中經(jīng)微生物的發(fā)酵熟化后形成成熟麝香；第二，林麝香腺直接分泌麝香的主要化學(xué)成分儲存于香囊中積累，而微生物不是麝香形成的決定因素。無論林麝通過哪種方式形成成熟麝香，林麝合成和分泌的化學(xué)組分對麝香的形成至關(guān)重要。通過代謝組學(xué)的手段對麝香進行檢測，使用不同的萃取試劑得到的化學(xué)組分和含量有一定差異，在麝香的甲醇和氯仿提取物中主要成分為脂肪酸類的烷烴類、醇類、酮類、醛類、固醇類、甾類及芳香族類物質(zhì)，與其他文獻報道[2]一致。脂肪酸衍生類、環(huán)酮類、甾類和固醇類為麝香的主要成分，而FASN、HMGCR和CYP11A1是合成上述物質(zhì)的關(guān)鍵基因。

FASN基因?qū)τ陂L鏈脂肪酸的合成和活化過程具有重要作用[5,9,20-22]，如碳鏈的延伸、末端酰基的活化和雙鍵的還原等，特別是與麝香酮(3-甲基環(huán)十五酮)碳鏈骨架的形成具有較強的關(guān)聯(lián)性；同時FASN 合成的亞基酶對碳鏈的轉(zhuǎn)運、去飽和、脫羥基和碳鏈活化等具有重要作用，如酰基載體蛋白β-酮酰ACP 還原酶和β-酮酰ACP水解酶等。對于固醇類和甾類物質(zhì)而言，HMGCR是其合成的限速酶[8-9]，它參與甲羥戊酸的合成，而甲羥戊酸作為基礎(chǔ)物質(zhì)進一步形成異戊烯基焦磷酸、鯊烯、羊毛固醇和膽固醇等產(chǎn)物，對于類固醇物質(zhì)的合成和分泌具有重要作用。CYP11A1是膽固醇的側(cè)鏈裂解的關(guān)鍵酶[4,8,23]，對于孕烯酮、雄烯二酮和脫氫雄甾酮等物質(zhì)合成至關(guān)重要，而在麝香檢測到大量的雄性激素前體物質(zhì)，如反式-脫氫雄甾酮，其合成同時需要HMGCR和CYP11A1的參與。因此，F(xiàn)ASN、HMGCR和CYP11A1對于麝香的生物合成有較強的關(guān)聯(lián)性，具有較大的研究價值和潛力。miRNAs 是基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的關(guān)鍵因子[10-11]，對生物代謝組分的調(diào)控具有關(guān)鍵作用。1 個基因可受多條miRNAs調(diào)控，同時1 條miRNAs 可調(diào)控多個基因的表達，預(yù)測共同靶向林麝多個麝香合成相關(guān)基因表達的miRNAs 對探究麝香生物合成機制具有重要意義，同時也為牛和羊的肉質(zhì)和繁殖性狀相關(guān)研究提供參考。

林麝、牛、山羊和綿羊的FASN、HMGCR和CYP11A1基因3′-UTR 序列差異較小，同源物種之間基因的3′-UTR 有保守性，保守區(qū)域可能為共同的miRNAs 作用位點，同時也驗證了序列拼接的正確性[12]；較高的自由能及更多的單鏈空泡結(jié)構(gòu)將增加miRNA 與mRNA的結(jié)合概率[14-15]。通過SWChen 系統(tǒng)分別對4 個物種中調(diào)控FASN、HMGCR和CYP11A1基因的miRNAs 進行預(yù)測，在林麝和牛中，F(xiàn)ASN基因受控的miRNAs 在各自miRNA 數(shù)據(jù)庫中的占比相對山羊和綿羊較高，暗示林麝和牛FASN基因受miRNA 調(diào)控的潛力強于山羊和綿羊，與RNA 結(jié)構(gòu)分析的結(jié)果一致；林麝HMGCR基因受miRNA 調(diào)控的數(shù)量占比較高，可能與其3′-UTR 長度和序列復(fù)雜程度有關(guān)；而CYP11A1基因在4 個物種之間預(yù)測的候選miRNA 數(shù)量差異不大，且RNA 二級結(jié)構(gòu)空泡結(jié)構(gòu)及最小自由能差距不明顯，暗示4 個物種CYP11A1基因受miRNA 調(diào)控的潛力一致。候選miRNAs 數(shù)量在相應(yīng)物種總體數(shù)據(jù)庫中的占比和基因3′-UTR的RNA 二級結(jié)構(gòu)和最小自由能預(yù)測，可為分析miRNA 對基因的調(diào)控潛能提供參考。

集合論分析顯示：4 個物種FASN基因共同受到miR-24-3p 和miR-30b-3p 調(diào)控，miR-24-3p 可通過調(diào)控鋅指同源基因ZHX2(zinc fingers and homeoboxes 2)影響FASN基因的表達[24]，miR-30c-5p 可調(diào)控下調(diào)FASN的表達改善肝性脂肪沉積[22]，預(yù)測miR-24-3p 和miR-30b-3p 有很大的潛力調(diào)控4 個物種的FASN基因表達。預(yù)測調(diào)控HMGCR基因表達的miRNAs 結(jié)果顯示：miR-29b、miR-146a 和miR-2284d 為4 個物種miRNA的交集部分，miR-29 能夠抑制小鼠HMGCR的表達而影響在肝臟的膽固醇沉積[25]，miR-29b 作為miR-29的同源miRNAs，具有較大的潛力調(diào)控4 個物種HMGCR的表達，miR-146a 與免疫炎癥、心血管疾病、糖尿病及總膽固醇含量等具有一定的相關(guān)性[26-29]，這些因素均與固醇類和甾類物質(zhì)合成相關(guān)，miR-146a 存在很大的潛能調(diào)控HMGCR基因的表達影響固醇類物質(zhì)的合成導(dǎo)致相應(yīng)疾病發(fā)生；通過雙閾值分析可知：調(diào)控HMGCR基因表達的miRNA 有較大可能為miR-181b-3p 和miR-429 家族，miR-181d-5p 能夠顯著下調(diào)豬的HMGCR基因[30]，而雞肝臟中的miR-429 與HMGCR的表達具有較強的相關(guān)性[31]，因此 miR-29b、miR-146a、miR-181b-3p 和 miR-429 都具有調(diào)控HMGCR表達的潛力。調(diào)控CYP11A1基因表達的miRNAs 集合分析顯示均屬于let-7 家族成員，let-7 家族是細(xì)胞中含量最為豐富的miRNA 家族，參與動物免疫、繁殖和生長發(fā)育等過程[32-34]；CYP11A1屬于雄性激素的合成限速酶[8-9]，在各物種中均有較高的保守性。結(jié)合UTR 進化樹、二級結(jié)構(gòu)和miRNA 占比可知：4 個物種CYP11A1基因的相關(guān)參數(shù)基本接近一致，暗示let-7 對保守性較強的CYP11A1有較強的調(diào)控潛能；進一步的雙閾值預(yù)測結(jié)果顯示：miR-532-3p 也能夠調(diào)控CYP11A1基因的表達，而miR-532-3p 被報道涉及女性不孕不育[35]，miR-532-3p 可能通過調(diào)控CYP11A1基因?qū)е孪嚓P(guān)生殖類疾病。而在林麝中未發(fā)現(xiàn)共同調(diào)控FASN、HMRCR和CYP11A1的miRNAs 分子，但miR-205 和miR-143 家族存在交集，有參與麝香合成調(diào)控通路的可能。研究表明：miR-205主要參與AKT 和Wnt 信號通路[36-40]，miR-143主要參與NF-kappaB 信號通路[41-43]，暗示麝香的生物合成機可能涉及miR-205 和miR-143 參與的AKT、Wnt 和NF-kappaB 信號通路。

4 結(jié)論

本研究通過自主開發(fā)的SWChen 系統(tǒng)預(yù)測發(fā)現(xiàn)：調(diào)控林麝FASN基因表達的miRNA 包括miR-24-3p 和miR-30b-3p，調(diào)控林麝HMGCR基因表達的miRNA 有miR-29b、miR-146a、miR-181b-3p 和miR-429 家族，調(diào)控林麝CYP11A1基因表達的miRNA 有miR-532-3p 和let-7 家族，共同調(diào)控林麝3 個基因表達的miRNAs 主要為miR-205 家族和miR-143 家族。研究結(jié)果可為研究林麝、牛、山羊和綿羊FASN、HMGCR和CYP11A1的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控提供參考，同時對解析林麝的麝香合成機制具有重要意義。