辛 靜，高麗云，徐 劍，趙文植，王正德，李衛(wèi)英，王 飛，辛培堯

(1.西南林業(yè)大學(xué) 國家林業(yè)局西南風(fēng)景園林工程技術(shù)研究中心，云南 昆明 650224；2.西南林業(yè)大學(xué) 西南地區(qū)生物多樣性保育國家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224)

分子標(biāo)記輔助育種為包括林木在內(nèi)的植物遺傳育種提供了先進(jìn)有效的技術(shù)手段，相比于傳統(tǒng)育種技術(shù)而言具有跟蹤目標(biāo)基因(性狀)、周期短和育種效率高等優(yōu)點(diǎn)，目前在遺傳多樣性分析、品種鑒定、遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建以及分子標(biāo)記輔助育種方面展現(xiàn)了廣闊的應(yīng)用前景[1-3]。SSR(simple sequence repeat)分子標(biāo)記又稱短串聯(lián)重復(fù)或微衛(wèi)星DNA，是由1～6 個核苷酸組成的基序(motif)串聯(lián)重復(fù)組成的DNA 序列，其長度一般在100 bp 以內(nèi)。SSR 廣泛分布于真核生物整個基因組中，微衛(wèi)星的突變率很高，從而產(chǎn)生很多等位基因，導(dǎo)致微衛(wèi)星的高度多態(tài)性[4-5]。SSR 分子標(biāo)記呈共顯性，重復(fù)性好，且在種屬間擁有良好的通用性，已被大量運(yùn)用于林木遺傳學(xué)研究[6-10]。

華山松(Pinus armandiiFranch.)是松科(Pinaceae)松屬(Pinus)的高大常綠喬木，是中國獨(dú)有的材、果多用途樹種之一，也是中國西部中山至亞高山地區(qū)以及長江中上游防護(hù)林體系的重要綠化造林樹種[11-12]?，F(xiàn)有的大部分華山松人工林分結(jié)實(shí)量低、長勢衰弱、高產(chǎn)林分少、病蟲害增加，已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足現(xiàn)今林業(yè)發(fā)展的要求[13]。種子園作為林木良種繁育的主要形式之一，在現(xiàn)代林業(yè)生產(chǎn)中有著舉足輕重的地位。云南省楚雄市紫溪山華山松無性系種子園建于1986 年，總面積為33.3 hm2，為國家級林木良種基地[14]。然而，該種子園自建園以來，雜交親本的選配多以形態(tài)或地理位置遠(yuǎn)近為主要依據(jù)，尚未利用較新的技術(shù)手段對種子園內(nèi)無性系開展DNA 水平上較全面的、深入的種質(zhì)資源評價工作，這顯然具有很大的局限性。因此，為了日后種子園更快捷有效的開展雜交育種工作，明確該種子園的遺傳分化情況及不同種源間的親緣關(guān)系顯得尤為重要。近年來，中國研究者積極開展了華山松優(yōu)良基因資源發(fā)掘的相關(guān)工作。劉成等[15]曾利用SRAP 分子標(biāo)記對紫溪山華山松種子園內(nèi)部分無性系的遺傳多樣性及親緣關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果表明：該種子園遺傳多樣性較豐富，可在種源內(nèi)進(jìn)行親本的選配以提高雜種后代基因的豐度。此外，朱曉丹[16]和趙揚(yáng)等[17]也對華山松開展了優(yōu)樹選擇和遺傳多樣性分析等相關(guān)工作。

基于目前紫溪山華山松無性系種子園的生產(chǎn)現(xiàn)狀，本研究選取6 個種源共計97 份華山松優(yōu)良無性系為材料，運(yùn)用SSR 分子標(biāo)記技術(shù)對其進(jìn)行遺傳多樣性分析，明確各無性系遺傳變異情況，探討不同種源間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，研究結(jié)果可為華山松育種親本的選配提供理論依據(jù)與實(shí)踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

于楚雄市紫溪山華山松無性系種子園內(nèi)采集來自6 個種源的97 株無性系葉樣(表1)。挑選無病蟲害的新鮮幼嫩針葉，分別按單株裝入自封袋，并做好標(biāo)記和編號，備用。

表1 華山松的采樣信息Tab.1 Sampling information of Pinus armandii

1.2 華山松基因組DNA 提取與檢測

選取5～8 根無病害的華山松葉樣，采用改良CTAB 法[5]進(jìn)行華山松基因組DNA的提取，并利用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳和超微量紫外分光光度計進(jìn)行檢測，將質(zhì)量濃度較高的華山松DNA稀釋到50 ng/μL，放于-20 ℃冰箱保存，備用。

1.3 SSR-PCR 擴(kuò)增

使用生物學(xué)信息方法從(GIGA)nDB 數(shù)據(jù)庫中下載部分火炬松序列骨架，利用在線搜索SSR位點(diǎn)工具Imperfect SSR Finder DocumentationNWISRL main page、Primer 5.0 和Oligo 7等相關(guān)軟件進(jìn)行引物設(shè)計、分析及修飾，共設(shè)計20 對SSR 引物，再借鑒已報道的22 對SSR 引物[18-19]，共計42 對SSR 引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。華山松SSR-PCR 反應(yīng)體系(20 μL)為：引物0.35 μL，DNA 模板1.00 μL，dNTPs 2.00 μL，TaqDNA 聚合酶1.20 μL，10×PCR Buffer 2.00 μL，用ddH2O 補(bǔ)足至20.00 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 50 s，52 ℃ 90 s，72 ℃ 1 min，進(jìn)行30 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，擴(kuò)增產(chǎn)物于4 ℃保存。

1.4 引物篩選

利用42 對引物對6 個種源各1 個華山松無性系DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行結(jié)果檢測，最終獲得33 條條帶清晰、明亮的引物，然后再對33 對引物進(jìn)行8%聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，經(jīng)過初篩和復(fù)篩，最終獲得26 對多態(tài)性高的引物 (表2)，可用于遺傳多樣性的分析。

表2 供試SSR 引物序列Tab.2 SSR primer sequences for test

1.5 數(shù)據(jù)分析

將在復(fù)篩中篩選出的多態(tài)性較好的引物與6 個種源地的每一個無性系DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物按照每個種源地、每個引物的順序排列，在8%的聚丙烯酰胺凝膠上檢測，檢測結(jié)果按照主擴(kuò)增條帶的遷移變化讀帶，將所得數(shù)據(jù)錄入Excel 建立原始數(shù)據(jù)矩陣。

通過POPGEN 1.32 分析軟件分別計算各個種源的等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Nei’s 基因多樣性指數(shù)和Shannon 信息指數(shù)等；再利用NTSYS 2.10 軟件構(gòu)建UPGMA 聚類圖；使用Structure 2.3.1 軟件，利用MCMC 方法評估多態(tài)位點(diǎn)的基因數(shù)據(jù)并建模聚類，估計最佳群體群組數(shù)值(K)，其中K的估計值范圍為1～13，每個K值重復(fù)數(shù)為20 次，不作數(shù)迭代設(shè)定為10 000 次，不作數(shù)迭代后的MCMC 設(shè)定為10 000 次，得到數(shù)據(jù)后將數(shù)據(jù)上傳至Structure 2.3.1 Harvester 進(jìn)行分析，采用Clumpp 1.1.2 軟件對Structure 2.3.1 Harvester 分析后得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和分析，以似然數(shù)最大為原則確定最佳K值，通過Distruct 1.1 繪制聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 華山松基因組DNA 提取結(jié)果

由圖1 可知：所提取的樣本DNA 條帶明亮、清晰、無明顯拖尾現(xiàn)象，可以用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 部分華山松樣本DNA 瓊脂糖電泳檢測結(jié)果Fig.1 Agarose gel electrophoresis detection result of Pinus armandii DNA

2.2 遺傳多樣性分析

由表3 可知：6 個種源的觀測等位基因數(shù)范圍為3.730 8 (南華縣)～4.807 7 (巍山縣)，平均觀測等位基因數(shù)為4.237 1。有效等位基因數(shù)的范圍為2.574 0 (南華縣)～3.087 6 (楚雄市)，平均有效等位基因數(shù)為2.901 1。Shannon 多樣性指數(shù)范圍為1.069 1 (南華縣)～1.242 4 (楚雄市)，平均數(shù)為1.186 5，所有群體的多樣性指數(shù)均大于1，6 個種源均具有較高的多態(tài)性。Nei’s 基因多樣性指數(shù)的范圍為：0.583 3 (南華縣)～0.664 4 (楚雄市)，平均數(shù)為0.637 6，表明雖然6 個種源在各項(xiàng)遺傳參數(shù)上存在一定差異，但各個種源均擁有較高的遺傳多樣性。

表3 華山松群體遺傳多樣性參數(shù)Tab.3 Genetic diversity parameters of P.armandii population

2.3 聚類分析

由表4 可知：華山松6 個種源的遺傳相似系數(shù)處于0.801 0～0.939 0 之間，平均遺傳相似度為0.873 4，接近1，說明各種源間的親緣關(guān)系較近；各種源間遺傳距離處于0.063 0～0.221 9 之間，遺傳距離的平均值為0.136 3，接近于0，同樣說明各種源間的親緣關(guān)系較近。其中，宜良(YL)和騰沖(TCH)之間的遺傳距離最大(D=0.221 9)，遺傳相似度最小，為0.801 0，說明宜良和騰沖之間的遺傳距離最遠(yuǎn)；巍山(WSH)和會澤(HZ)種源之間的遺傳相似系數(shù)最大，為0.939 0，遺傳距離最小(D=0.063 0)，說明巍山和會澤種源之間的遺傳差異最小。

表4 華山松6 個種源間Nei’s 遺傳相似系數(shù)(對角線上方)和遺傳距離(對角線下方)Tab.4 Nei’s genetic similarity coefficient (above diagonal) and genetic distance (below diagonal)among six provenances of P.armandii

為了進(jìn)一步分析不同種源間的親緣關(guān)系，根據(jù)6 個華山松無性系種源的遺傳一致度構(gòu)建華山松無性系6 個種源間UPGMA 聚類圖。由圖2 所示：以0.864 為閾值，可以將6 個種源分為2 類，南華縣(NH)、會澤縣(HZ)、巍山縣(WSH)、楚雄市(CHX)和騰沖市(TCH)歸為一類；宜良(YL)單獨(dú)歸為一類。以0.883 為閾值，大致將6 個種源分為3 類，南華縣(NH)、會澤縣(HZ)、巍山縣(WSH)和楚雄市(CHX)歸為一類；騰沖市(TCH)為單獨(dú)的一類；宜良縣(YL)單歸為一類。當(dāng)閾值為0.921 時，可以分成5類，南華縣(NH)、楚雄市(CHX)、騰沖市(TCH)、宜良(YL) 4 個種源各自為一類，會澤縣(HZ)、巍山縣(WSH)聚為一類，說明會澤(HZ)和巍山(WSH)之間的親緣關(guān)系較近。

圖2 華山松6 個種源聚類分析圖Fig.2 Cluster analysis of six provenances of P.armandii

2.4 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

對華山松種子園進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)分析可知：6 個無性系種源的遺傳分化系數(shù)(Gst)為0.056 8，介于0.05%～0.15%之間，表明種源間存在中等程度的遺傳分化，華山松6 個種源的遺傳變異主要是來自各個種源內(nèi)的遺傳變異，且其基因流Nm為4.150 3＞1。由此可知：種源間的遺傳交流較多，削弱了各種源間的遺傳差異，高水平的基因流可能是導(dǎo)致華山松種源間產(chǎn)生較低遺傳分化的原因。

利用Structure 2.3.1 軟件分析97 個華山松無性系的群體遺傳結(jié)構(gòu)。由圖3 所示：LnP(D)值隨著K值的增加而整體降低，LnP(D)在K=2 時出現(xiàn)第1 個轉(zhuǎn)折點(diǎn)，這時的△K為最大值，根據(jù)似然數(shù)最大的原則來確定最佳的群體數(shù)目，可以將6 個華山松種源分為2 個理論群組，分別包含5 個和1 個群體，其中第1 群組包括南華縣(NH)、會澤縣(HZ)、巍山縣(WSH)、楚雄市(CHX)和騰沖市(TCH)種源，第2 群組包括宜良(YL)種源。即意味著華山松6 個種源分化為2 個不同的基因型族。由圖4 可知：橫坐標(biāo)表示97 個無性系，縱坐標(biāo)表示Q值分布，華山松被劃分為2 個亞群體 (紅、綠)。以Q值0.6 為界限，97 個無性系中Q≥0.6的有37 個，占38.1%，說明這些無性系親緣關(guān)系較為單一，遺傳相似度較高；而Q＜0.6的有60 個無性系，占61.9%，說明其基因滲透較高，遺傳構(gòu)成較為多樣，親緣關(guān)系比較復(fù)雜。綜上所述，華山松6 個無性系種源具有較為復(fù)雜的群體遺傳結(jié)構(gòu)，并且具有基因滲透的現(xiàn)象。

圖3 LnP(D)和ΔK 隨K 值的變化趨勢Fig.3 Trends of LnP(D) and ΔK changed with K values

圖4 樣品材料群組遺傳結(jié)構(gòu)Fig.4 Genetic structure group of sample material

3 討論

種子園的遺傳多樣性一直是研究者關(guān)注的重點(diǎn)，是其子代遺傳品質(zhì)優(yōu)良的保證。本研究對楚雄紫溪山華山松種子園6 個種源共計97 份無性系進(jìn)行了遺傳多樣性分析，在Nei’s 基因多樣性指數(shù)、Shannon 信息指數(shù)和遺傳分化系數(shù)等各項(xiàng)遺傳參數(shù)方面，6 個種源均表現(xiàn)出較高水平的遺傳多樣性，且遺傳變異主要是來自各個種源內(nèi)。劉成等[15]利用SRAP 標(biāo)記和朱曉丹[16]利用RAPD標(biāo)記在以該種子園內(nèi)無性系為試驗(yàn)材料進(jìn)行遺傳多樣性研究中均表明：該種子園具有豐富的遺傳多樣性，各優(yōu)良無性系間存在不同程度的遺傳差異，種源內(nèi)的遺傳變異高于種源間，這一結(jié)果與本研究相一致。可見，不同標(biāo)記在對同一群體進(jìn)行遺傳分析時，在分子水平上所體現(xiàn)的遺傳多樣性程度是基本一致的。由于各種源間遺傳變異小于種源內(nèi)遺傳變異，在該種子園進(jìn)行雜交育種工作時，可在種源內(nèi)進(jìn)行親本的選配，增加雜種后代的基因型復(fù)雜程度，從而更有利于提高選擇效率。

在進(jìn)行植物遺傳多樣性分析時，遺傳距離是反映物種和種源間遺傳變異水平及遺傳分化程度的重要指標(biāo)，可為雜種優(yōu)勢提供基本遺傳參數(shù)[20]。本研究表明：6 個種源間的遺傳相似系數(shù)趨近于1，遺傳距離趨近于0，表明各個種源間的親緣關(guān)系較近，其中宜良(YL)種源與其他種源的遺傳距離最遠(yuǎn)，意味著存在一定程度的遺傳差異，而巍山(WSH)種源和會澤(HZ)種源二者之間的遺傳差異最小。劉成等[15]運(yùn)用SRAP 標(biāo)記對該種子園6 個種源60 個無性系進(jìn)行聚類分析時也發(fā)現(xiàn)種源間的親緣關(guān)系與其分布的地理距離不相符，這與本試驗(yàn)結(jié)果相似。此外，凌士鵬等[21]和王鵬等[22]分別對桃種質(zhì)資源和馬鈴薯育成品種的研究同樣發(fā)現(xiàn)：部分地理距離相距較遠(yuǎn)的品種，其遺傳距離表現(xiàn)得較為相近。因此，植物群體間當(dāng)前的遺傳結(jié)構(gòu)不僅與自然地理距離有關(guān)，還可能與該植物的進(jìn)化歷史、環(huán)境條件、人為干擾程度以及進(jìn)化過程中基因突變被保留等各種因素有關(guān)。所以，在進(jìn)行植物雜交育種時，僅以兩親本地理位置的遠(yuǎn)近為選配親本的主要依據(jù)存在較大的局限性。在今后的育種工作中，應(yīng)以DNA 水平分析的結(jié)果為主要依據(jù)，結(jié)合形態(tài)和地理位置等綜合評判，最后確定較為理想的親本組合。

基因流(gene flow)是決定物種遺傳多樣性的關(guān)鍵因素之一，較大的基因流可以阻礙群體間的遺傳分化。本研究結(jié)果表明：紫溪山華山松種子園內(nèi)無性系的基因流(Nm)=4.150 3＞1，說明群體間的遺傳交流較多，遺傳交流削弱了各種源間的遺傳差異，華山松種源的遺傳變異主要存在于種源內(nèi)，因此，華山松種源間產(chǎn)生較低遺傳分化的原因可能是各種源間存在一定程度的基因滲透現(xiàn)象。基因流的大小受種子流與花粉流的影響，食果動物的遠(yuǎn)距離傳播、單位間的調(diào)種以及飛播造林等均能將不同基因型進(jìn)行擴(kuò)散，從而在擴(kuò)大各種源間無性系遺傳交流的同時，削弱了種源間的遺傳變異。

4 結(jié)論

華山松無性系種源間遺傳變異不高，其主要遺傳變異存在于種源內(nèi)，研究結(jié)果可為利用該種子園內(nèi)的不同無性系進(jìn)行華山松遺傳改良工作提供理論依據(jù)及實(shí)踐指導(dǎo)。