陳禮穎，柴宜均，姚靜新，陳善瑜，周紫峣，劉海峰，鐘志軍，彭廣能

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611130)

芽囊原蟲(chóng)(Blastocystissp.)是引起腸易激綜合征(IBS)、炎癥性腸病(IBD)和腹瀉等臨床癥狀的重要病原[1-3]。據(jù)估計(jì)，芽囊原蟲(chóng)在發(fā)展中國(guó)家對(duì)人的感染率高達(dá)30%～60%，其中在易與動(dòng)物接觸以及與糞—口傳播有關(guān)的地區(qū)具有更高的感染率[1,4-5]。自首次描述芽囊原蟲(chóng)以來(lái)，現(xiàn)已報(bào)道芽囊原蟲(chóng)可在多種動(dòng)物體內(nèi)被檢測(cè)到，其中包括野生動(dòng)物、寵物和家畜等[6-9]。

目前已有關(guān)于圈養(yǎng)野生動(dòng)物的芽囊原蟲(chóng)感染情況的相關(guān)研究。胡雄峰[7]調(diào)查顯示：秦嶺地區(qū)野生動(dòng)物感染芽囊原蟲(chóng)中非人靈長(zhǎng)類(lèi)(75.9%)和有袋類(lèi)(72.7%)感染率較高；喬繼英等[10]對(duì)陜西地區(qū)圈養(yǎng)珍稀野生動(dòng)物的腸道寄生蟲(chóng)感染情況進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)芽囊原蟲(chóng)感染率最高(46.7%)；LI等[11]研究發(fā)現(xiàn)：孟加拉國(guó)家動(dòng)物園內(nèi)的圈養(yǎng)野生動(dòng)物的芽囊原蟲(chóng)感染率為15.5%，其中靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物感染率達(dá)到31.8%。但目前對(duì)于貴陽(yáng)地區(qū)圈養(yǎng)野生動(dòng)物芽囊原蟲(chóng)感染的研究調(diào)查較少。鑒于近期發(fā)現(xiàn)野生動(dòng)物在傳播芽囊原蟲(chóng)的過(guò)程中扮演重要角色[12]以及可作為帶蟲(chóng)宿主對(duì)人類(lèi)健康造成威脅，對(duì)貴陽(yáng)某野生動(dòng)物園的圈養(yǎng)野生動(dòng)物進(jìn)行芽囊原蟲(chóng)感染情況調(diào)查，并評(píng)估人畜共患風(fēng)險(xiǎn)。

1 材料與方法

1.1 糞便樣本采集

收集貴陽(yáng)某野生動(dòng)物園野生動(dòng)物的新鮮糞便樣本共203 份，每份樣品50～70 g，所采集的動(dòng)物種類(lèi)及數(shù)量見(jiàn)表1，且均為無(wú)腹瀉癥狀的個(gè)體。每份糞便單獨(dú)用無(wú)菌塑料密封袋包裝，并記錄動(dòng)物種類(lèi)及編號(hào)，低溫保存并送至四川農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

1.2 糞樣基因組DNA 提取與PCR 擴(kuò)增

用蒸餾水從糞便標(biāo)本中分離重鉻酸鉀，3 500 r/min 離心10 min。使用糞便DNA 提取試劑盒(購(gòu)自O(shè)mega 公司)從每個(gè)糞便標(biāo)本中提取200 mg 基因組DNA，于-20 ℃保存。

參照SANTíN 等[13]的引物序列：上游引物RD5：5′-ATCTGGTTGATCCTGCCAGT-3′，下游引 物BhRDr:5′-GAGCTTTTTAACTGCAACAACG-3′，擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)度約為600 bp。以提取的DNA 為模板，PCR 擴(kuò)增SSUrRNA 基因序列。PCR 反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；93 ℃ 1 min；59 ℃ 1 min；72 ℃ 1 min；循環(huán)30 次；72 ℃ 3 min。PCR 經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所有陽(yáng)性樣品的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物均交由上海生工生物技術(shù)有限公司測(cè)序。試驗(yàn)所用的2×TaqPCR Master Mix 購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；DL2000 Maker 和ExTaqPCR Master Mix 均購(gòu)自日本TaKaRa 公司；瓊脂糖凝膠購(gòu)自法國(guó) BLOWEST 公司；Tris-Base和溴化乙啶(EB)均購(gòu)自萬(wàn)科化學(xué)試劑公司；飽和蔗糖溶液由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室自制。

1.3 芽囊原蟲(chóng)的序列分析與亞型鑒定

將本研究獲得的芽囊原蟲(chóng)基因序列經(jīng)BLAST 比對(duì)，在GenBank 下載參考序列，利用Clustal X 2.0 程序(http://www.clustal.org/)對(duì)序列進(jìn)行比較分析后，確定芽囊原蟲(chóng)基因亞型。利用MEGA 7.0 (http://www.megasoftware.net/)軟件，采用鄰接法(neighbor-joining，NJ)和Boostrap 分析(重復(fù)次數(shù)為1 000)，以蝎虎鞭毛蟲(chóng)(Proteromonas lacertae) (GenBank 登錄號(hào)：U 37108)作為外群，對(duì)PCR 擴(kuò)增為芽囊原蟲(chóng)陽(yáng)性的SSU rRNA基因序列構(gòu)建種系發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。使用χ2分析芽囊原蟲(chóng)在類(lèi)群間的感染率差異，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSU rRNA 基因 PCR 擴(kuò)增結(jié)果

PCR 擴(kuò)增結(jié)果顯示：在203 份糞便樣品中，有 22 份糞便樣品成功擴(kuò)增出大小約 600 bp的SSUrRNA 基因序列的陽(yáng)性條帶，總檢出率為10.84%，即該園的芽囊原蟲(chóng)總感染率為10.84%。部分PCR 擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 芽囊原蟲(chóng) SSU rRNA 基因的 PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification of Blastocystis SSU rRNA gene

2.2 芽囊原蟲(chóng)感染情況

由表1 可知：受芽囊原蟲(chóng)感染率的22 份樣本包括靈長(zhǎng)類(lèi)(15.19%)、象類(lèi)(30.77%)和有袋類(lèi)(35.29%)野生動(dòng)物；經(jīng)SPSS 分析，它們之間差異不顯著(χ2=0.44，P＞ 0.05)。在偶蹄類(lèi)、食肉類(lèi)和鳥(niǎo)類(lèi)動(dòng)物中未發(fā)現(xiàn)芽囊原蟲(chóng)。

2.3 芽囊原蟲(chóng)的亞型鑒定及分布

本研究從22 份芽囊原蟲(chóng)PCR 擴(kuò)增陽(yáng)性條帶中共獲得17 份測(cè)序成功的SSUrRNA 基因序列，將測(cè)序成功的序列與參考序列進(jìn)行分析比對(duì)(圖2)發(fā)現(xiàn)：5 份基因序列之間具有100%的同源性，并且與參考序列 AB107971 (ST8)位于同一進(jìn)化支上；8 份基因序列之間的同源性為93.54%～98.44%，并且與參考序列KY929115 (ST1)位于同一進(jìn)化支上；1 份基因序列與參考序列KX351992(ST2)位于同一進(jìn)化支上，兩者之間同源性為99.64%；2 份基因序列與參考序列MN338086(ST13)位于同一進(jìn)化支上，兩者之間同源性為99.13%；1 份基因序列與參考序列AB070988(ST3)位于同一進(jìn)化支上，兩者之間同源性為98.22%，表明本研究共檢測(cè)出5種不同的芽囊原蟲(chóng)基因亞型，分別為ST1 (8/17)、ST2 (1/17)、ST3(1/17)、ST8 (5/17)和ST13 (2/17)，分布于6種野生動(dòng)物(表1)。

圖2 基于芽囊原蟲(chóng)SSU rRNA 基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree based on SSU rRNA gene of Blastocystis sp.

表1 貴陽(yáng)某野生動(dòng)物園芽囊原蟲(chóng)感染情況的檢測(cè)結(jié)果Tab.1 Blastocystis infections of wild animals in a Guiyang wildlife park

3 討論

本試驗(yàn)將研究對(duì)象分為 6 個(gè)類(lèi)群，總感染率為10.84%，其中非人靈長(zhǎng)類(lèi)(15.19%)、有袋類(lèi)(35.29%)和象類(lèi)(30.77%)存在感染。研究表明：芽囊原蟲(chóng)感染率在具有感染的動(dòng)物類(lèi)群之間差異不大，然而在偶蹄類(lèi)、食肉類(lèi)和鳥(niǎo)類(lèi)動(dòng)物中未發(fā)現(xiàn)芽囊原蟲(chóng)。說(shuō)明芽囊原蟲(chóng)感染情況在不同動(dòng)物類(lèi)群之間存在一定差異，這可能與動(dòng)物種類(lèi)采集到的樣本數(shù)量較少或宿主差異性有關(guān)。此外，感染因素可能與感染類(lèi)群所處地區(qū)的飼養(yǎng)管理?xiàng)l件、類(lèi)群免疫力、衛(wèi)生管理?xiàng)l件、食用被污染的水源和食物等有關(guān)，其中經(jīng)糞—口途徑[4,14]食用受污染的水源或食物是主要影響因素。

在世界范圍內(nèi)，芽囊原蟲(chóng)在各地區(qū)的感染率有所差異。調(diào)查結(jié)果顯示：貴陽(yáng)某野生動(dòng)物園的總感染率(10.84%)低于秦嶺部分野生動(dòng)物總體感染率(40.2%)[7]，但高于中國(guó)部分地區(qū)人類(lèi)感染芽囊原蟲(chóng)的總感染率(4%)[15]；園區(qū)內(nèi)偶蹄動(dòng)物并未發(fā)現(xiàn)有感染芽囊原蟲(chóng)的跡象，而在陜西部分地區(qū)犢牛[1]存在感染該原蟲(chóng)的情況；貴陽(yáng)該動(dòng)物園的亞洲象為芽囊原蟲(chóng)陽(yáng)性，與澳大利亞動(dòng)物園的亞洲象芽囊原蟲(chóng)[16]感染陽(yáng)性相似；山魈和駱駝并未發(fā)現(xiàn)感染，而秦嶺地區(qū)的山魈和駱駝分別存在25.0%和50.0%的感染率[7]；狒狒和袋鼠在貴陽(yáng)和秦嶺兩地都存在感染芽囊原蟲(chóng)的情況；另外，園區(qū)袋鼠感染率(35.29%)低于澳大利亞袋鼠感染率(50%)[16]。這些不同國(guó)家地區(qū)的同種野生動(dòng)物中芽囊原蟲(chóng)感染情況的差異提示：該原蟲(chóng)的分布除地理因素外，也有可能存在樣本的偶然性。同一地區(qū)不同動(dòng)物之間變化較大的感染率也反映了該原蟲(chóng)的宿主特異性。

本研究在貴陽(yáng)某野生動(dòng)物園共獲得5種亞型(ST1、ST2、ST3、ST8 和ST13)，其中ST1(36.36%)是優(yōu)勢(shì)亞型，分布于園區(qū)內(nèi)狒狒、長(zhǎng)臂猿、黑猴和亞洲象中，表明貴陽(yáng)園區(qū)該亞型的廣泛分布。在世界各地也有過(guò)多例ST1 感染人的報(bào)道[1,4]，本研究首次在中國(guó)黑猴體內(nèi)檢測(cè)出芽囊原蟲(chóng)ST1 亞型，表明黑猴在向人類(lèi)傳播芽囊原蟲(chóng)的過(guò)程中可能發(fā)揮潛在作用。動(dòng)物與飼養(yǎng)人員的密切接觸可能會(huì)增加人患芽囊原蟲(chóng)病的患病率。西澳大利亞動(dòng)物園和澳大利亞昆士蘭州東南部(SEQ)的大型集約化豬場(chǎng)的工作人員芽囊原蟲(chóng)病患病率分別為63%和76.7%[14-16]，并且在SEQ 豬場(chǎng)工作人員中，83.3%是芽囊原蟲(chóng)攜帶者[15]。還有研究表明：法國(guó)某動(dòng)物園的大多數(shù)哺乳動(dòng)物常感染芽囊原蟲(chóng)人畜共患亞型，因此無(wú)法確定其傳播方向，說(shuō)明控制芽囊原蟲(chóng)病具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義[16]。但目前尚未在貴陽(yáng)該園區(qū)發(fā)現(xiàn)飼養(yǎng)人員感染芽囊原蟲(chóng)病。ST8 (22.73%)是本研究中感染率第二的亞型，但它只感染袋鼠，分布范圍有限。ST13 只分布在金絲猴中，該亞型在澳大利亞的袋鼠中也有報(bào)道[17]，但在該園區(qū)的袋鼠中并未出現(xiàn)ST13，這一結(jié)果可能由于亞型具有宿主和地區(qū)特異性或所檢查的樣本數(shù)量少所致。長(zhǎng)臂猿和狒狒中存在ST1 亞型與其他亞型混合感染的情況，說(shuō)明該原蟲(chóng)在2種物種間可能存在相互感染。據(jù)報(bào)道，在芽囊原蟲(chóng)的17種基因亞型中，ST1～ST8 為人畜共患基因亞型[1]，提示應(yīng)加強(qiáng)監(jiān)測(cè)該園區(qū)ST1、ST2、ST3 和ST8 芽囊原蟲(chóng)感染人的風(fēng)險(xiǎn)和危害。

4 結(jié)論

本研究對(duì)貴陽(yáng)某野生動(dòng)物園的圈養(yǎng)野生動(dòng)物芽囊原蟲(chóng)的感染情況進(jìn)行調(diào)查，首次在黑猴中發(fā)現(xiàn)芽囊原蟲(chóng)感染，擴(kuò)大了已知的芽囊原蟲(chóng)宿主范圍。本次共發(fā)現(xiàn)5 個(gè)芽囊原蟲(chóng)基因型(ST1、ST2、ST3、ST8 和ST13)，其中人畜共患亞型(ST1、ST2、ST3 和ST8)的發(fā)現(xiàn)提示芽囊原蟲(chóng)在該地區(qū)具有人畜共患風(fēng)險(xiǎn)。本研究結(jié)果可幫助了解動(dòng)物園動(dòng)物及其對(duì)人類(lèi)健康的潛在影響具有公共衛(wèi)生學(xué)意義。