王明月，孫澤銳，安孟飛，申 暢，胡財江，趙云麗，王宣軍，盛 軍

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，普洱茶學(xué)教育部重點實驗室，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；3.云南大學(xué) 化學(xué)科學(xué)與工程學(xué)院，教育部自然資源藥物化學(xué)重點實驗室，云南省天然產(chǎn)物轉(zhuǎn)化與應(yīng)用重點實驗室，云南 昆明 650091；4.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 理學(xué)院，云南 昆明 650201)

骨頭是一種不斷被塑造、形成與修復(fù)的剛性但有活力的器官，它是構(gòu)成脊椎動物內(nèi)骨骼的關(guān)鍵部分[1-2]。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量減少、骨折風(fēng)險增加以及骨結(jié)構(gòu)潛在變化為特征，由骨內(nèi)穩(wěn)態(tài)破壞引起的骨代謝疾病[3-4]。由于婦女絕經(jīng)后會導(dǎo)致體內(nèi)雌激素分泌水平降低從而導(dǎo)致骨量減少，因此絕經(jīng)后的婦女成為骨質(zhì)疏松癥發(fā)病率最高的人群[5-7]。目前臨床上治療骨質(zhì)疏松癥的方法主要是采取藥物治療，隨著對天然植物高效、低副作用的報道，人們把目光轉(zhuǎn)向了藥食兩用的植物。

鐵皮石斛(Dendrobium candidumWall.ex Lindl.)為蘭科石斛屬多年附生草本植物，是中國傳統(tǒng)的名貴中藥材，具有藥食同源性[8]。在唐代醫(yī)學(xué)經(jīng)典《道藏》中被列為“中華九大仙草之首”[9]，同時享有“藥中黃金”之美稱。鐵皮石斛具有抗炎[10]、抗腫瘤[11-12]、提高機(jī)體免疫力[13]以及預(yù)防肝損傷[14]等多種藥理活性，且其中的多糖成分具有抗氧化[15-16]、降血糖[17]以及降血壓[18]等功效，藥用價值頗高。茶是全球僅次于水的第二大飲料，而中國是茶的故鄉(xiāng)也是茶文化的發(fā)源地[19]。中國主要將茶葉分為六大類，即青茶(烏龍茶)、白茶、黑茶、綠茶、黃茶和紅茶[20]；其中紅茶是全球生產(chǎn)和消費最為廣泛的一種茶葉[21]。在中國，從古代開始，茶葉就已被用作藥物[22]，紅茶因含有茶黃素、茶紅素、兒茶素和黃酮等活性成分而具有一些獨特的功效，使其具有較高的藥用價值[23]。前人研究證明：紅茶具有預(yù)防高血壓[24]、降低體質(zhì)量[19]、降低患卵巢癌[21]、前列腺癌[25]、乳腺癌、肺癌和結(jié)腸癌[26]等疾病的風(fēng)險，同時還能夠改善骨質(zhì)疏松癥[27]。也有相關(guān)文獻(xiàn)報道喝紅茶的老年婦女比不喝的人骨密度要高[28]。

有文獻(xiàn)報道：單用鐵皮石斛提取物[29]和單用紅茶提取物[27]均能改善切除卵巢所致大鼠骨質(zhì)疏松，但未見關(guān)于二者聯(lián)用對骨微結(jié)構(gòu)影響的報道。因此，本研究以鐵皮石斛和紅茶提取物的聯(lián)用組方為研究對象，采用Micro-CT 技術(shù)研究其對切除卵巢致骨質(zhì)疏松模型小鼠骨微結(jié)構(gòu)的改善作用。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品

鐵皮石斛提取物呈土黃色粉末狀，提取率為23.49%，其中多糖含量為32.15%；紅茶提取物呈黑褐色粉末狀，提取率為25%，其中茶黃素含量為0.57%，以上樣品均由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)普洱茶學(xué)教育部重點實驗室提供。鐵皮石斛提取物與紅茶提取物按質(zhì)量比5∶2 混合得到所需的試驗樣品，試驗時取適量用雙蒸水混懸定容至相應(yīng)劑量備用。戊酸雌二醇片購自拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司，研磨成粉后取適量用雙蒸水定容備用。

1.2 骨質(zhì)疏松癥模型小鼠的建立

雌性SPF 級ICR 小鼠，體質(zhì)量28～30 g，購自成都達(dá)碩實驗動物有限公司，許可證號：SYXK(滇)K2013—0004。動物飼養(yǎng)于IVC 動物實驗室(S8，蘇州蘇杭科技有限公司)，溫度(24±1)℃，相對濕度為50%～60%，12 h 晝夜交替，自由進(jìn)食與飲水。小鼠適應(yīng)環(huán)境1 周后，將72 只小鼠按照隨機(jī)區(qū)組法分為假手術(shù)組(S 組，未切除卵巢)、模型組(M 組)、雌二醇組(E2組，陽性對照)、鐵皮石斛提取物與紅茶提取物聯(lián)用低劑量組(DCE+BTE-L 組)、鐵皮石斛提取物與紅茶提取物聯(lián)用中劑量組(DCE+BTE-M 組)和鐵皮石斛提取物與紅茶提取物聯(lián)用高劑量組(DCE+BTEH 組)。分組后模型組與處理組均摘除小鼠雙側(cè)卵巢，而假手術(shù)組僅切除小鼠兩側(cè)卵巢周圍同質(zhì)量的脂肪組織。術(shù)后小鼠恢復(fù)1 周后通過灌胃的方式給予樣品，劑量分別為：E2組1.5 mg/kg、DCE+BTE-L 組0.475 g/kg，DCE+BTE-M 組0.950 g/kg，DCE+BTE-H 組1.425 g/kg。連續(xù)給藥3 個月，每周稱小鼠體質(zhì)量；解剖前禁食10 h，解剖后取小鼠左側(cè)股骨進(jìn)行Micro-CT 觀察。

1.3 影像學(xué)檢測

Micro-CT (μCT 100，瑞士SCANCO Medical AG 公司)對骨質(zhì)疏松模型小鼠的左側(cè)股骨進(jìn)行形態(tài)計量學(xué)分析。采集參數(shù)為：分辨率10 μm，曝光時間300 ms，電壓70 kV，電流200 μA。檢測小鼠左側(cè)股骨的骨小梁結(jié)構(gòu)、骨密度(BMD值)、骨小梁體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)和骨小梁分離度(Tb.Sp)。試驗重復(fù)3 次。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

試驗數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)表示，用SPSS 17.0 和Graph Pad Prime 5 處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)分析采用雙尾t-test 分析，P值小于0.05 代表有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 鐵皮石斛提取物與紅茶提取物聯(lián)用對骨質(zhì)疏松模型小鼠股骨的骨小梁結(jié)構(gòu)的影響

由圖1 可知：與假手術(shù)組相比，切除卵巢可致模型小鼠骨小梁結(jié)構(gòu)破壞；用雌二醇和鐵皮石斛提取物與紅茶提取物聯(lián)用的低、中和高劑量分別給骨質(zhì)疏松模型小鼠連續(xù)灌胃3 個月后，與模型組相比，雌二醇組小鼠骨小梁結(jié)構(gòu)略有改善，鐵皮石斛提取物與紅茶提取物聯(lián)用可明顯改善小鼠由于切除卵巢而導(dǎo)致的骨小梁結(jié)構(gòu)損傷的情況，其中以中劑量組效果更佳。

圖1 鐵皮石斛提取物與紅茶提取物聯(lián)用對去卵巢致骨質(zhì)疏松模型小鼠骨小梁結(jié)構(gòu)的影響Fig.1 The effect of combination of Dendrobium candidum extract and black tea extract to bone trabecular structure in ovariectomized osteoporosis model mice

2.2 鐵皮石斛提取物與紅茶提取物聯(lián)用對骨質(zhì)疏松模型小鼠股骨的骨密度的影響

由圖2 可知：與假手術(shù)組相比，切除卵巢可致模型小鼠股骨骨密度顯著降低(P＜0.05)；與模型組相比，雌二醇組、鐵皮石斛提取物與紅茶提取物聯(lián)用低、中和高劑量組均可增加股骨骨密度(分別為P＜0.01、P＞0.05、P＜0.05 和P＜0.01)。

2.3 鐵皮石斛提取物與紅茶提取物聯(lián)用對骨質(zhì)疏松模型小鼠股骨的骨小梁體積比的影響

由圖2 可知：與假手術(shù)組相比，切除卵巢可致模型小鼠股骨骨小梁體積比顯著減小(P＜0.05)；與模型組相比，雌二醇組小鼠股骨骨小梁體積比無明顯變化，但鐵皮石斛提取物與紅茶提取物聯(lián)用低、中和高劑量組小鼠股骨骨小梁體積有增加趨勢(P＞0.05)。

2.4 鐵皮石斛提取物與紅茶提取物聯(lián)用對骨質(zhì)疏松模型小鼠股骨的骨小梁厚度的影響

由圖2 可知：與假手術(shù)組相比，切除卵巢可致模型小鼠股骨骨小梁厚度極顯著降低(P＜0.01)；與模型組相比，連續(xù)12 周灌胃給予切除卵巢致骨質(zhì)疏松模型小鼠雌二醇和鐵皮石斛提取物與紅茶提取物聯(lián)用物，均可顯著或極顯著提高小鼠骨小梁厚度(P＜0.05 或P＜0.01)。

2.5 鐵皮石斛提取物與紅茶提取物聯(lián)用對骨質(zhì)疏松模型小鼠股骨的骨小梁分離度的影響

由圖2 可知：與假手術(shù)組相比，切除卵巢可致模型小鼠股骨骨小梁分離度增加(P＜0.05)；與模型組相比，鐵皮石斛提取物與紅茶提取物聯(lián)用低、中和高劑量組小鼠股骨骨小梁分離度有減小的趨勢(P＞0.05)，而雌二醇組小鼠股骨骨小梁分離度表現(xiàn)為增加趨勢(P＞0.05)。

圖2 鐵皮石斛提取物與紅茶提取物聯(lián)用對去卵巢致骨質(zhì)疏松模型小鼠骨組織形態(tài)的影響Fig.2 The effect of combination of D.candidum extract and black tea extract to bone morphology in ovariectomized osteoporosis model mice

3 討論

鐵皮石斛是一種藥食兩用植物[30]，屬于石斛屬植物中的名貴品種，主要成分包括石斛多糖、氨基酸、菲類化合物、生物堿和微量元素等[31]，具有調(diào)節(jié)免疫和血糖、抗炎和抗腫瘤[32-35]等多種生理活性。此外，有文獻(xiàn)報道：鐵皮石斛提取物能夠抑制破骨細(xì)胞分化，亦能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖[36]。雖然文獻(xiàn)報道其具有改善骨質(zhì)疏松的活性，但因其高昂的成本限制了進(jìn)一步的產(chǎn)品開發(fā)。紅茶是全世界廣泛接受的飲品，它可以有效保護(hù)和修復(fù)切除卵巢引起的單核細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)以及骨量丟失[37]；可以通過增加切除卵巢大鼠體內(nèi)雌激素水平起到預(yù)防骨質(zhì)疏松的作用[27]，但因其咖啡因含量較高，使得產(chǎn)品研發(fā)受限。為克服上述不足，課題組前期研究了鐵皮石斛提取物與紅茶提取物聯(lián)用(DCE+BTE)對骨質(zhì)疏松癥大鼠模型的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者聯(lián)用對骨質(zhì)疏松模型大鼠的改善優(yōu)于單用鐵皮石斛和紅茶提取物[35]。本研究在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究其對骨微結(jié)構(gòu)的影響。

根據(jù)《保健食品增加骨密度功能評價方法》指導(dǎo)原則，推薦使用雙側(cè)卵巢切除誘導(dǎo)嚙齒類動物骨質(zhì)疏松模型，因為它可以模擬人體絕經(jīng)后雌激素缺乏引起的骨丟失[38-40]。Micro-CT 是以組織學(xué)檢測高分辨率與影像學(xué)檢查無創(chuàng)性為特點的技術(shù)，能夠清晰地掃描和重建骨小梁立體結(jié)構(gòu)，它不僅能夠評估整體的骨量參數(shù)，還能夠提供骨微結(jié)構(gòu)的形態(tài)計量學(xué)參數(shù)[41]。因此，本研究采用該技術(shù)評價DCE+BTE 對切除雙側(cè)卵巢所致骨質(zhì)疏松小鼠骨微結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果顯示：用DCE+BTE處理后的小鼠骨小梁分布較致密，形態(tài)結(jié)構(gòu)和斷裂現(xiàn)象較模型組有明顯改善；骨密度和骨小梁厚度升高，骨小梁體積分?jǐn)?shù)增加，骨小梁分離度降低。本研究結(jié)果為鐵皮石斛提取物與紅茶提取物聯(lián)用在骨質(zhì)疏松癥方面的應(yīng)用提供了試驗依據(jù)。

人體正常骨穩(wěn)態(tài)是由成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞之間的平衡來維持[1]，如果這種平衡被打破，即破骨細(xì)胞負(fù)責(zé)的骨吸收增加或者是成骨細(xì)胞主導(dǎo)的骨形成不足就會引發(fā)骨質(zhì)疏松癥[42]。因此，從抑制破骨細(xì)胞分化和/或促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖入手研究治療或預(yù)防骨質(zhì)疏松癥的藥物或保健品至關(guān)重要。本試驗所建立的切除小鼠雙側(cè)卵巢致絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥模型屬于破骨細(xì)胞增生型，而未對促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖的模型進(jìn)行研究，所以在將來的研究中增加對此類模型的研究可以全面闡釋DCE+BTE 改善骨質(zhì)疏松的作用。此外，本研究采用的是二者的提取物，深入開展其中有效成分的進(jìn)一步分析將對未來的產(chǎn)品研發(fā)提供質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。本研究明確了DCE+BTE 可以改善骨微結(jié)構(gòu)。已有研究顯示：與破骨細(xì)胞分化的相關(guān)信號通路主要涉及OPG/RANKL/RANK[43-44]、NF-κB[45-48]、c-Src-PI3K-AKT[49-51]以及MAPKs[52-56]等；常見的成骨細(xì)胞增殖的相關(guān)信號通路有Wnt/β-catenin[57-60]、BMP-Smads[61-63]、Notch[64-66]以 及 Hedgehog[67-68]；而DCE+BTE 中的活性成分是否是通過這些信號通路發(fā)揮作用還需通過細(xì)胞生物學(xué)以及分子生物學(xué)試驗來進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

連續(xù)12 周對切除卵巢小鼠灌胃鐵皮石斛提取物(DCE)與紅茶提取物(BTE)聯(lián)用可明顯改善骨質(zhì)疏松小鼠的骨微結(jié)構(gòu)，增加骨密度。該結(jié)果為深入開發(fā)利用DCE+BTE 提供了試驗依據(jù)。