李澤林，代紅麗，沈曉靜,2，付曉萍，馮 勵(lì)，王雪峰，普岳紅，范江平

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 理學(xué)院，云南 昆明 650201)

表兒茶素(epicatechin，EC)屬于天然植物黃烷醇類化合物，廣泛存在于葡萄、藍(lán)莓、茅莓、可可、茶樹、茶葉、蘋果和麗江山荊子等食物及藥食同源植物中，具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、改善糖尿病和神經(jīng)退行性病變、預(yù)防心血管疾病和免疫調(diào)節(jié)等作用[1-3]，其中以抗氧化和抗炎活性研究為主。阮洪生等[4]在EC 對脂多糖誘導(dǎo)的小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7的抗炎作用研究中發(fā)現(xiàn)：EC 通過減少分泌炎性細(xì)胞因子的量和抑制分裂原激活的蛋白激酶(mitogen activated protein kinases，MAPK)信號通路中磷酸化的P38 分裂原激活的蛋白激酶(P38)、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)和c-jun N 端激酶(JNK)蛋白的磷酸化發(fā)揮抗炎癥作用。WANG 等[5]也對脂多糖誘導(dǎo)的小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7研究發(fā)現(xiàn)：EC 濃度為5、25 和50 μmol/L 時(shí)，可呈劑量依賴性抑制包括一氧化氮(NO)和前列腺素E2 (PGE2)在內(nèi)的促炎介質(zhì)的產(chǎn)生。AHN 等[6]發(fā)現(xiàn)表兒茶素是紅毛丹提取物中主要的抗氧化活性物質(zhì)。劉永玲等[7]對八月瓜葉、果皮和果肉中酚類含量及其抗氧化能力分析時(shí)發(fā)現(xiàn)：八月瓜果皮中主要的活性物質(zhì)是EC，并且具有較強(qiáng)的體外抗氧化活性和ABTS+自由基清除能力。然而，關(guān)于EC 體內(nèi)的抗炎和抗氧化研究報(bào)道則較少。

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是一種常見的急性呼吸窘迫綜合征，具有較高的發(fā)病率和致死率[8]。ALI的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，目前研究發(fā)現(xiàn)在機(jī)體遭受嚴(yán)重創(chuàng)傷、感染、休克和內(nèi)毒素等肺內(nèi)、外因素干擾時(shí)會(huì)造成肺損傷，肺損傷的發(fā)生會(huì)降低過氧化氫酶(catalase，CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSHPx)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)等酶的活性，使體內(nèi)的抗氧化失衡[9]，而氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)失控將會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致肺損傷的發(fā)展[10-11]。此外，肺損傷會(huì)加重炎性細(xì)胞的浸潤，釋放白細(xì)胞介素-6 (interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白細(xì)胞介素-1β (IL-1β)等促炎癥因子，同時(shí)激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路和核因子-κB (nuclear factor-κB，NF-κB)等通路[12-14]。最近，研究發(fā)現(xiàn)天然黃酮類物質(zhì)的干預(yù)可以提高體內(nèi)抗氧化酶的活性以及通過調(diào)節(jié)炎癥因子的含量和抑制相關(guān)炎癥通路的激活改善模型鼠的ALI。左文樸[15]發(fā)現(xiàn)天青葵黃酮F 呈劑量依賴性改善大鼠ALI 炎癥因子含量以及阻斷炎癥相關(guān)的蛋白通路激活，并從免疫、炎癥、細(xì)胞凋亡和自噬等方面闡明了天青葵黃酮F 對大鼠ALI的影響。ZHI等[16]發(fā)現(xiàn)富集黃酮的黃芩根提取物可以有效緩解流感病毒引起的ALI。

本研究通過氣管滴注法[17]滴注脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)建立ALI 模型，探索EC 對其誘導(dǎo)的ALI 小鼠氧化應(yīng)激和炎癥的調(diào)節(jié)作用，以期為EC的充分應(yīng)用與深度開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF 級雄性BALB/c 小鼠36 只，體質(zhì)量20～30 g/只，4～5 周齡，2019 年6 月5 日購于昆明醫(yī)科大學(xué)[許可證編號SCXK (滇) k2015—0002]，普通飼料飼喂。

EC (純度＞98%，貨號：SE8100—20 mg)、LPS(貨號：L8880—10 mg)、CAT 試劑盒(貨號：BC0 200)、GSH-Px 試劑盒(貨號：BC1190)、丙二醛試劑盒(MDA，貨號：BC0020)、SOD 試劑盒(貨號：BC0175)、蛋白質(zhì)羰基含量檢測試劑盒(貨號：BC1275)和NO 含量檢測試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司；IL-1β (貨號：KE10 003)、IL-6 (貨號：KE10007)、TNF-α (貨號：KE10 002)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒、p38 MAPK (貨號：14064-1-AP—50 μL)、p44/42 (ERK1/2，貨號：4370T)、JNK (貨 號：4668T)、β-actin (貨號：66009-1-Ig—100 μL)一抗、HRP-Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)和HRP-Goat Anti-Mouse IgG(H+L)二抗(貨號：SA00001-2—100 μL、SA000 01-2—100 μL)購自美國Proteintech 公司；Phospho-p44/42 (ERK1/2，貨 號：4370T)、Phospho-SAPK/JNK (貨號：4668T)和Phospho-p38 MAPK(貨號：4511T)一抗購自美國Cell Signaling Technology 公司；預(yù)制膠購自美國BIAO-RAD 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DHG-9203AD 恒溫干燥箱：上海覽浩儀器設(shè)備有限公司；Nikon Eclipse E100 正置光學(xué)顯微鏡：日本尼康公司；Multiskan FC 酶標(biāo)儀：美國ThermoFisher 公司；1658001 電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀和ChemiDoc? Touch 化學(xué)發(fā)光儀：美國Bio-RAD公司。

1.3 方法

1.3.1小鼠ALI 模型的建立

小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d 后隨機(jī)分為空白對照組(CK，n=6)、脂多糖(LPS，10 mg/kg，n=6)模型組和脂多糖+表兒茶素(LPS+EC，n=6)預(yù)處理組。其中LPS+EC 預(yù)處理組連續(xù)腹腔注射給藥EC (40 mg/kg)，CK 組和LPS 組給等量生理鹽水。連續(xù)給藥3 d，且最后一次給藥前4 h 斷食、斷水后，腹腔注射水合氯醛麻醉小鼠，手術(shù)滴注LPS，建模處理6 h后用乙醚迷暈小鼠，眼球取血后立即頸椎脫臼處死小鼠，每組隨機(jī)抽取6 只小鼠右肺用于肺組織濕/干質(zhì)量比值(W/D)測定，采集另外一半肺組織的支氣管肺泡灌洗液(BALF)，其余6 只則進(jìn)行Western-blot 等相關(guān)指標(biāo)測定。

1.3.2小鼠肺濕干質(zhì)量比的測定

除去右肺上葉組織的水分和部分血液后放入已稱好質(zhì)量的EP 管中稱量其濕質(zhì)量；再將其置于60 ℃的恒溫烘箱中干燥72 h，烘干至恒重，稱量其干質(zhì)量。計(jì)算小鼠肺組織濕/干質(zhì)量比值(W/D)。

1.3.3抗氧化和炎癥因子的測定

按照CAT、GSH-Px、MDA、SOD、蛋白質(zhì)羰基含量檢測試劑盒、NO 含量檢測試劑盒、IL-1β、IL-6 以及TNF-α 酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒說明書分別進(jìn)行CAT、GSH-Px、MDA、SOD、蛋白質(zhì)羰基含量、NO 含量、IL-1β、IL-6 和TNFα 等相關(guān)指標(biāo)的測定。

1.3.4磷酸化蛋白表達(dá)的測定

提取肺部蛋白，BCA 測定其蛋白含量后用BIAO-RAD 預(yù)制膠在300 V 條件下電泳20 min，轉(zhuǎn)膜10 min；5%脫脂牛奶封閉2 h，滴加ERK(1∶1 000)、P38 (1∶1 000)、JNK (1∶2 000)、p-P38 (1∶1 000)、p-ERK (1∶1 000)、p-JNK (1∶2 000)一抗，4 ℃孵育48 h；用含0.1% Tween 20的TBS 沖洗后，滴加二抗(1∶5 000)室溫下孵育2 h，再用0.1% TBST 沖洗后化學(xué)發(fā)光成像，用圖像分析軟件Image J 分析其蛋白表達(dá)。

1.3.5數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用Image J 軟件進(jìn)行蛋白條帶灰度值換算，所有試驗(yàn)均重復(fù)3 次，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 EC 對小鼠肺組織濕干質(zhì)量比的影響

肺細(xì)胞和毛細(xì)血管遭到破壞其通透性增加，大量的細(xì)胞內(nèi)液和毛細(xì)血管血釋放進(jìn)入到肺泡間質(zhì)和肺泡腔內(nèi)，甚至進(jìn)入到支氣管中造成水腫。如表1 所示：與空白對照組相比，LPS 模型組W/D 值顯著上升(P＜0.05)，其上升率為39.46%，而LPS+EC 預(yù)處理組則減緩其比值的上升，其減緩比率為20.12%。說明LPS 可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生肺部水腫并使小鼠肺組織產(chǎn)生炎癥，而EC 預(yù)處理可抑制小鼠肺組織毛細(xì)血管通透性的改變，降低其肺組織的水腫程度。

表1 EC 對小鼠肺組織濕干質(zhì)量比(W/D)的影響Tab.1 Effect of EC on the wet/dry weight ratio (W/D) of lung tissue in mice

2.2 EC 對LPS 致小鼠肺部氧化損傷的影響

由表2 可知：模型組小鼠中MDA 含量顯著增加(P＜0.05)，EC 預(yù)處理能夠顯著抑制小鼠肺內(nèi)MDA的產(chǎn)生(P＜0.05)。與模型組相比，EC 預(yù)處理使肺組織抗氧化酶(SOD、CAT和GSHPx)活性均顯著(P＜0.05)降低；同時(shí)，EC 極顯著(P＜0.01)地抑制蛋白質(zhì)羰基的產(chǎn)生，一定程度維持了正常的蛋白質(zhì)功能。這說明EC能維持小鼠肺內(nèi)抗氧化系統(tǒng)穩(wěn)定，維持蛋白正常功能，同時(shí)降低脂質(zhì)過氧化，緩解LPS 導(dǎo)致的小鼠ALI。

表2 EC 對LPS 致小鼠肺部氧化損傷的影響Tab.2 Effect of EC on LPS-induced oxidative damage in lungs of mice

2.3 EC 對小鼠肺組織NO 含量的影響

由表3 可知：LPS的刺激使肺組織內(nèi)NO的含量極顯著增加(P＜0.01)，而EC 預(yù)處理可以極顯著(P＜0.01)抑制LPS 誘導(dǎo)的NO 產(chǎn)生，抑制率達(dá)36.20%。這說明EC 能有效抑制LPS 誘導(dǎo)ALI小鼠肺組織內(nèi)NO 含量的增加。

表3 EC 對小鼠肺組織NO 含量的影響Tab.3 Effect of EC on the NO content of lung tissue in mice

2.4 EC 對小鼠血清、BALF 和肺組織中炎癥因子的影響

當(dāng)肺部發(fā)生損傷時(shí)其內(nèi)部抗炎和促炎的動(dòng)態(tài)平衡將遭到破壞，抗炎癥介質(zhì)的分泌因藥物作用而被抑制造成促炎癥介質(zhì)大量堆積。如圖1所示：與空白組相比，LPS的刺激使小鼠血清、BALF 和肺組織中的促炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6 含量顯著增加，但LPS+EC 組與LPS 組相比促炎癥因子的含量均呈不同程度降低，說明EC 預(yù)處理能有效維持急性肺損傷小鼠血液及肺內(nèi)抗炎和促炎的動(dòng)態(tài)平衡。

圖1 EC 對小鼠血清、BALF 和肺組織勻漿炎癥因子的影響Fig.1 Effect of EC on the inflammatory factors in serum,BALF and tissues

2.5 EC 對小鼠肺組織中磷酸化P38、ERK 和JNK蛋白的影響

如圖2 所示：與空白組相比，LPS 模型組p-JNK/JNK (P＜0.05)、p-ERK/ERK (P＜0.01)和p-P38/P38 (P＜0.01)的比值顯著升高，但在LPS+EC 組中三者的比值則顯著降低。這說明EC 預(yù)處理能降低LPS 誘導(dǎo)后MAPK 信號通路中關(guān)鍵的3 個(gè)蛋白的磷酸化水平升高，EC的預(yù)處理減緩LPS誘導(dǎo)的肺損傷炎癥的加重進(jìn)程。

圖2 EC 對小鼠肺組織P38、ERK 和JNK 磷酸化水平的影響Fig.2 Effect of EC on the phosphorylated level of P38,ERK and JNK in mice lung tissues

3 討論

急性肺損傷是一種嚴(yán)重的彌漫性肺病，目前較為有效的方法是機(jī)械通氣，但容易造成肺組織二次傷害[18]。炎癥反應(yīng)和肺內(nèi)皮屏障的損傷導(dǎo)致血管內(nèi)炎性細(xì)胞流入肺間質(zhì)及肺泡，產(chǎn)生肺組織水腫，同時(shí)促炎細(xì)胞因子大量流入肺間質(zhì)，形成炎癥級聯(lián)效應(yīng)惡化ALI[19-20]。有研究報(bào)道氣管滴注LPS 誘導(dǎo)的ALI 小鼠模型可以很好地模擬臨床上肺炎導(dǎo)致的肺損傷[21]。因此，本研究使用氣管內(nèi)滴注LPS 誘導(dǎo)小鼠建造ALI 模型以探討EC的抗炎和氧化應(yīng)激的保護(hù)作用。通過W/D 檢測以及評估表明本試驗(yàn)的ALI 模型可行，且EC 預(yù)處理可顯著抑制經(jīng)LPS 誘導(dǎo)導(dǎo)致的肺水腫以及損傷。

在LPS 刺激后內(nèi)源性抗氧化物活性的降低會(huì)導(dǎo)致氧化自由基及其消除分子之間調(diào)控失衡，促使抗氧化防御能力下降，從而誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，造成體內(nèi)MDA 累積[22]。SOD 在清除氧自由基方面發(fā)揮著重要作用，SOD的活性可間接反映肺組織內(nèi)的抗氧化活性[23]。氧化酶催化過程中的氧化還原反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生許多細(xì)胞毒性物質(zhì)過氧化氫，在ALI 過程中也會(huì)釋放過氧化氫對細(xì)胞產(chǎn)生破壞，但是CAT 可以催化過氧化氫分解保護(hù)細(xì)胞免受過氧化氫的危害，GSH-Px 同樣可以使有毒的過氧化物還原成無毒的羥基化合物保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能的完整性[24]。蛋白質(zhì)羰基是生物體損傷特征指標(biāo)之一，通過測量羰基類物質(zhì)可以估計(jì)肺組織蛋白質(zhì)的氧化損傷程度[25]。所以MDA 含量、SOD、CAT 和GSH-Px 活性以及蛋白質(zhì)羰基的含量是氧化應(yīng)激水平的良好指標(biāo)。本研究表明：與LPS 模型組相比，EC預(yù)處理可以有效提高SOD、CAT 和GSH-Px 活性并有效抑制MDA 和蛋白質(zhì)羰基的產(chǎn)生。

活性氧(reactive oxygen species，ROS)包含羥基自由基、過氧化氫氧自由基和超氧物，是自由基存在的主要形式[26]。ROS的產(chǎn)生可以促進(jìn)中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞釋放NO 并在肺組織內(nèi)積累，對肺組織造成持續(xù)損傷[27-28]。本研究表明：EC 預(yù)處理抑制了肺組織內(nèi)由LPS 刺激引起的NO 產(chǎn)生。過量的NO 積累又對中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等細(xì)胞進(jìn)行刺激從而釋放TNF-α、IL-1β 和IL-6 等促炎癥因子[29]。LPS 刺激后肺巨噬細(xì)胞大量合成并釋放NO，不僅殺傷病原體，同時(shí)對周圍正常細(xì)胞也造成損害，進(jìn)一步惡化ALI。由LPS 刺激而釋放的促炎癥因子大多都是小分子蛋白，其作用于細(xì)胞表面與細(xì)胞膜表面受體結(jié)合后能形成復(fù)合體，這些復(fù)合體會(huì)激活下游與炎癥相關(guān)的蛋白激酶，如MAPK 信號通路及P38、ERK 和JNK 信號通路等，參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)[30]。黃酮類化合物能有效地調(diào)節(jié)ALI 模型小鼠的炎癥因子含量以及阻斷相關(guān)的炎癥通路的激活來緩解其肺部損傷。CHEN 等[31]研究發(fā)現(xiàn)：苔蘚葉總黃酮通過下調(diào)小鼠血清中NO、TNF-α、IL-1β 和IL-6的含量以及阻斷MAPK 和NF-κB 信號通路的激活減輕LPS的ALI。本研究中，EC 預(yù)處理組在LPS 誘導(dǎo)后同樣能下調(diào)小鼠血清、BALF和肺組織中TNF-α、IL-1β 和IL-6 三種炎癥因子的含量，并且抑制小鼠肺組織內(nèi)MAPK 信號通路中P38、ERK 和JNK 蛋白的磷酸化表達(dá)，證明EC 能通過調(diào)節(jié)炎癥因子及相關(guān)通路改善其ALI。

4 結(jié)論

EC 預(yù)處理能顯著地抑制LPS 誘導(dǎo)的肺組織氧化應(yīng)激反應(yīng)，下調(diào)相關(guān)因子的含量，緩解LPS誘導(dǎo)的小鼠肺水腫和損傷，抑制MAPK 信號通路中P38、ERK 和JNK的磷酸化水平，緩解小鼠的ALI。