簡宗輝，孫 帥，閆世雄，黃 英，葛長榮，豆騰飛，賈俊靜

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201)

云南某蛋雞場20 周齡羅曼粉商品蛋雞發(fā)生低頭縮頸、翅下垂、伏地不起、閉眼昏睡以及排黃綠色稀便等現(xiàn)象，為死亡率高達(dá)20%的傳染性疾病。臨床剖檢可見個別雞腿肌條紋狀出血；肝臟灰黃腫大，質(zhì)脆易碎，有出血斑；腹腔有少量透明淡黃色積液；心包透明淡黃色積液明顯，心肌柔軟松弛，并伴有心冠脂肪出血；腎稍腫，部分呈花斑狀；腺胃乳頭充血、出血。臨床上多種疾病均可表現(xiàn)上述癥狀，例如：I 群禽腺病毒(fowl adenovirus，F(xiàn)AdV)感染造成肝臟受損，引發(fā)心包積液，導(dǎo)致心臟衰竭而造成雞只大量死亡[1]，還能引起以肝炎、肝細(xì)胞內(nèi)形成核內(nèi)包涵體、貧血和肌肉出血為特征的包涵體肝炎[2]；傳染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus，IBDV)感染出現(xiàn)胸肌和腿肌條紋狀出血，法氏囊出血腫大等臨床癥狀[3-4]；新城疫病毒(newcastle disease virus，NDV)感染引起腺胃乳頭出血和心冠脂肪出血；高致病性禽流感(highly pathogenic avian influenza，HPAI) H5N1 感染以各器官出血為特征，且死亡率較高。另外，彎曲桿菌和大腸桿菌感染均能引起肝臟病變，如肝臟腫大、質(zhì)脆易碎，肝表面有纖維素性滲出物[5]。因此，臨床發(fā)現(xiàn)上述病理變化的病例時，僅依靠臨床及解剖癥狀對該疾病鑒別診斷極為困難，有必要借助實(shí)驗(yàn)室技術(shù)對該疾病輔助診斷。

為進(jìn)一步確定該場病原，本試驗(yàn)無菌采集臨床癥狀明顯發(fā)病雞只的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腺胃、法氏囊和小腸等組織樣品。用血瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱培養(yǎng)基對肝臟和脾臟等組織樣品進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，再通過形態(tài)學(xué)方法和生化試驗(yàn)鑒定病原菌并進(jìn)行藥敏試驗(yàn)；同時應(yīng)用PCR/RT-PCR 擴(kuò)增技術(shù)及TA 克隆測序?qū)M織樣品進(jìn)行FAdV、IBDV、NDV 和H5N1 鑒定，以指導(dǎo)臨床診斷治療。

1 材料與方法

1.1 病料采集

病料來源于云南省某暴發(fā)疫病的羅曼粉蛋雞場。隨機(jī)挑選10 只臨床癥狀明顯的發(fā)病雞，頸部放血處死，隨后用75%酒精浸泡雞只5～10 min，采集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腺胃和法氏囊等組織樣品，各組織樣分別置于消毒后的離心管中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩２蓸邮褂闷餍得恐浑u均進(jìn)行更換。

1.2 細(xì)菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

將肝臟和脾臟等組織樣中加入生理鹽水研磨制備組織懸液，取上清后分別涂布在麥康凱培養(yǎng)基和血瓊脂培養(yǎng)基(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)表面的角落處，用接種環(huán)劃線，37 ℃培養(yǎng)24 h，參照GB 4789.6—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 致瀉大腸埃希氏菌檢驗(yàn)》和GB 4789.10—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》進(jìn)行試驗(yàn)。

革蘭氏染色：挑取固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h的單菌落常規(guī)涂片、干燥和固定。滴加結(jié)晶紫(以剛好將菌膜覆蓋為宜)染色1 min，水洗；用碘液沖去殘水，并用碘液覆蓋約1 min，水洗；加75%乙醇脫色30 s，立即水洗；番紅復(fù)染約2 min，水洗；干燥后用油鏡觀察并拍照。

藥敏試驗(yàn)：將組織懸液上清均勻地涂布在MH 固體培養(yǎng)基(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)上，待其略干后取阿莫西林、氨芐西林、硫酸粘桿菌素、林可大觀霉素、多西環(huán)素、卡那霉素、泰樂菌素和安普霉素等8種常用抗生素進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。將藥敏片輕輕地放在培養(yǎng)基上，置于恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h 后觀察結(jié)果，并測量抑菌圈的大小?？咕Ч卸?biāo)準(zhǔn)為：≤21 mm 為耐藥，≥22 mm 為敏感；敏感質(zhì)控菌株應(yīng)在22～29 mm，耐藥質(zhì)控菌株應(yīng)≤21 mm[6]。

1.3 引物設(shè)計

本研究檢測所用引物均來自相關(guān)文獻(xiàn)，由華大基因公司合成。引物信息見表1。

表1 引物序列信息Tab.1 Primer sequence information

1.4 病毒核酸的PCR 擴(kuò)增

參照DNA 提取試劑盒(寶生物工程有限公司)說明書提取病料的基因組DNA，然后通過PCR 方法對組織樣本進(jìn)行FAdV的特異性核酸檢測。FAdV 核酸的PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μL：2×TaqPCR Mix 12.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，模板1 μL，ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，共35 個循環(huán)，72 ℃ 延伸10 min。

參照RNA 提取試劑盒(寶生物工程有限公司)說明書提取病料RNA，然后參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(寶生物工程有限公司)說明書合成cDNA，再通過PCR 方法對組織樣本進(jìn)行IBDV、H5N1和NDV 特異性核酸檢測。IBDV、H5N1 和NDV核酸PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系均為25 μL：2×TaqPCR Mix 12.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，模板1 μL，ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)條件：94 ℃5 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 40 s (IBDV)/52 ℃ 30 s(H5N1)/45 ℃ 30 s (NDV)，72 ℃ 40 s，共35 個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。

TA 克隆及測序分析，將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒(寶生物工程有限公司)純化，按連接反應(yīng)體系將純化產(chǎn)物與pMD18-T 載體連接。連接體系10 μL：pMD18-T 1 μL，膠回收產(chǎn)物4 μL，SolutionⅠ 5 μL。16 ℃連接2 h，轉(zhuǎn)化。將連接產(chǎn)物10 μL 加到100 mL 大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30 min；42 ℃熱應(yīng)激90 s，立即冰浴2 min，加入600 μL 含Amp的LB 培養(yǎng)基(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)于37 ℃培養(yǎng)2 h，取100～300 μL 涂LB (Amp+)平板，37 ℃培養(yǎng)過夜。挑取單個白色菌落于LB 液體培養(yǎng)基，37 ℃搖菌過夜培養(yǎng)，再經(jīng)PCR 擴(kuò)增鑒定，隨后送鑒定成功樣品至華大基因公司進(jìn)行質(zhì)粒DNA 測序分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離鑒定

組織樣品上清液在麥康凱培養(yǎng)基上形成粉紅色菌落，乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基中顯黃色，革蘭氏染色呈陰性短桿菌，符合大腸桿菌特征(圖1)。血液瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)生溶血，血漿凝固酶試驗(yàn)陽性，革蘭氏染色陽性，菌體呈球狀，符合金黃色葡萄球菌特征(圖2)。血液瓊脂培養(yǎng)基上呈中等大小、邊緣整齊中央突起的圓形白色、半透明菌落，產(chǎn)生β 溶血圈；革蘭氏染色陽性，菌體呈細(xì)小桿狀，在麥康凱培養(yǎng)基上幾乎不生長，符合鴨源雞桿菌特征(圖3)。

圖1 大腸桿菌分離培養(yǎng)及鑒定結(jié)果Fig.1 Isolation,culture and identification of Escherichia coli

圖2 金黃色葡萄球菌分離培養(yǎng)及鑒定結(jié)果Fig.2 Isolation,culture and identification of Staphylococcus aureus

圖3 鴨源雞桿菌分離培養(yǎng)及鑒定結(jié)果Fig.3 Isolation,culture and identification of Gallibacterium anatis

2.2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

藥敏試驗(yàn)結(jié)果(表2)顯示：大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鴨源雞桿菌只對硫酸粘桿菌素和多西環(huán)素敏感，對氨芐西林、林可大觀霉素、卡那霉素和安普霉素均有耐藥性。

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Antimicrobial susceptibility test results

2.3 病毒核酸PCR 擴(kuò)增結(jié)果

對病雞組織樣品提取病毒核酸，進(jìn)行PCR/RT-PCR 擴(kuò)增。由圖4 所示：FAdV 樣品擴(kuò)增條帶長約500 bp，與預(yù)期片段大小相符；IBDV、H5N1 和NDV 樣品結(jié)果為陰性，陰性結(jié)果未展示。

圖4 FAdV 核酸PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 PCR amplification of FAdV nucleic acid

將擴(kuò)增獲得的基因片段與GenBank 中登錄的FAdV 全基因序列比對發(fā)現(xiàn)：FAdV-D-Yunnan株與FAdV-C-4 毒株同處于一個小分支，親緣關(guān)系最近(圖5)，同源性高達(dá)100% (圖6)。

圖5 FAdV-D-Yunnan hexon 基因核苷酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 FAdV-D-Yunnan hexon gene nucleotide sequence phyletic tree

圖6 FAdV-D-Yunnan hexon 基因序列同源性Fig.6 Homology of FAdV-D-Yunnan hexon gene sequence

3 討論

在實(shí)際生產(chǎn)過程中，雞的很多疾病都有相似臨床癥狀和病理解剖特點(diǎn)。因此，僅僅依靠臨床癥狀及病理解剖特點(diǎn)仍不易對疾病進(jìn)行確診。本場雞群臨床癥狀主要為精神萎靡和排黃綠色稀便，并迅速死亡；臨床剖解可見胸肌和腿肌有條紋狀出血，心包有清亮黃色滲出液，并伴有肝臟、脾臟腫大和腺胃乳頭出血等。由于上述臨床和解剖特點(diǎn)可由多種病原微生物感染導(dǎo)致，例如：FAdV 感染可引起心包積液和肝臟腫大；IBDV 感染可引起胸和腿肌條紋狀出血和腺胃乳頭出血，且發(fā)病初期法氏囊病變不明顯[11]；NDV和H5N1 感染能引起肌胃乳頭出血和心冠脂肪出血[12]；葡萄球菌、彎曲桿菌和大腸桿菌等感染均能引起肝、脾和肌胃病變等[13]；與本場發(fā)病雞群的臨床癥狀和病理解剖特點(diǎn)均有相似之處，不易進(jìn)行鑒別診斷。因此，非常有必要對本場雞群進(jìn)行FAdV、IBDV、H5N1 和NDV 病毒核酸檢測、細(xì)菌分離鑒定及藥敏試驗(yàn)，以指導(dǎo)臨床診斷和治療。實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果顯示：該雞場雞群主要為FAdV-C-4 病毒感染，同時伴隨大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鴨源雞桿菌繼發(fā)性混合感染，同時，藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示：3種細(xì)菌對多種抗生素具有耐藥性，而對硫酸粘桿菌素和多西環(huán)素敏感。

FAdV 根據(jù)抗原性差異可以分為I、II 和III 群，I 群又可分為A、B、C、D 和E 5 個種，共12 個血清型，能引起雞包涵體肝炎、心包積液和肌胃糜爛等病變。本試驗(yàn)檢出毒株與I 群禽腺病毒FAdV-C-4 毒株同處于1 個小分支，親緣關(guān)系最近，同源性高達(dá)100%，即本場雞群為Ⅰ群禽腺病毒FAdV-C-4 感染。本場雞群表現(xiàn)的臨床癥狀、病理解剖癥狀及較高死亡率等特點(diǎn)與MASE 等[14]和CHEN 等[15]的研究結(jié)果相符。本病毒一年四季均可發(fā)生，死亡率為20%～75%，最高可以達(dá)到80%。董振杰[16]將2015—2017 年10 個省送檢的455 份疑似感染樣品對FAdV 進(jìn)行病毒核酸PCR 擴(kuò)增，陽性率分別是60.78%、68.50%和27.14%，結(jié)果表明：從2015 年開始該病在國內(nèi)多地流行，呈現(xiàn)大面積暴發(fā)。有調(diào)查發(fā)現(xiàn)：本病在中國多地均有發(fā)生，且各日齡、各品種的雞只均有感染，病程為1～4 周[17-19]，本試驗(yàn)雞群發(fā)病日齡與之相符。另外，腺病毒是無囊膜病毒，具有較強(qiáng)抵抗力，通過消毒方法殺滅環(huán)境中的腺病毒具有一定困難；且病毒感染途徑多樣化，如孵化、養(yǎng)殖和青年雞轉(zhuǎn)運(yùn)等環(huán)節(jié)都可能造成該病毒感染。因此，本病預(yù)防過程中消滅傳染源是關(guān)鍵，但難以實(shí)現(xiàn)；而長遠(yuǎn)的防控措施是完善生物安全工作，同時疫苗免疫能有效預(yù)防該病發(fā)生[20]。因此，全國范圍內(nèi)加速對本病毒主要流行基因型調(diào)查和疫苗研發(fā)勢在必行。本場雞群為病毒感染為主的細(xì)菌性繼發(fā)混合感染，提示本病的診療過程，不能單一考慮禽腺病毒感染，還應(yīng)該結(jié)合實(shí)際情況確定是否存在其他病毒和細(xì)菌混合感染。然而，隨著抗生素在養(yǎng)殖業(yè)中的廣泛使用，耐藥菌的不斷出現(xiàn)給細(xì)菌感染性疾病的治療帶來了巨大挑戰(zhàn)。因此，必須通過藥敏試驗(yàn)對抗生素進(jìn)行輔助選擇。藥敏試驗(yàn)不僅能對抗生素選擇提供理論依據(jù)，同時也能指導(dǎo)合理使用抗生素，避免病原菌耐藥性產(chǎn)生。本試驗(yàn)檢出的3種細(xì)菌對氨芐西林、林可大觀霉素、卡那霉素和安普霉素等4種抗生素具有耐藥性，與CHEN 等[15]、郭京蓉等[21]和李偉娟等[22]的研究結(jié)果一致，即葡萄球菌和大腸桿菌對多種抗生素具有多重耐藥性。因此，在蛋雞生產(chǎn)的各個環(huán)節(jié)中都應(yīng)加強(qiáng)生物安全工作，同時保持良好的飼養(yǎng)環(huán)境，并對雞群進(jìn)行本病毒主要流行基因型的免疫，將有助于預(yù)防本病的暴發(fā)。

4 結(jié)論

該雞場雞群主要為FAdV-C-4 病毒感染，同時伴隨大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鴨源雞桿菌繼發(fā)性混合感染，藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示：3種細(xì)菌對多種抗生素具有耐藥性，但對硫酸粘桿菌素和多西環(huán)素敏感。