王嬌祥，范檸粼，施德佳，陳姝含，王璐璐，李蓮軍，李鴻輝，魏紅江

(1.云南省動物基因編輯與體細(xì)胞克隆技術(shù)重點實驗室，云南 昆明 650201；2.云南省異種器官移植工程研究中心，云南 昆明 650201；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650201；4.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201)

體細(xì)胞克隆羊“Dolly”的誕生首次證明了高度分化的成體細(xì)胞可通過卵母細(xì)胞質(zhì)重編程后獲得胚胎發(fā)育的全能性及成活的個體[1]，2000 年體細(xì)胞克隆技術(shù)在豬上取得了重要突破[2]，隨后基于同源重組技術(shù)首次實現(xiàn)豬成纖維細(xì)胞基因編輯，并結(jié)合體細(xì)胞克隆技術(shù)獲得了α-1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(alpha-1,3-galactosyltransferase，GGTA1)敲除克隆豬[3]。近年來CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)在哺乳動物基因組編輯中得到了廣泛應(yīng)用，結(jié)合體細(xì)胞克隆技術(shù)已先后獲得多種不同基因修飾的克隆豬，實現(xiàn)了豬新品種培育[4]、人類疾病模型構(gòu)建和發(fā)病機(jī)制研究[5]。因此，豬的體細(xì)胞核移植(somatic cell nuclear transfer，SCNT)在生物醫(yī)學(xué)和比較醫(yī)學(xué)的發(fā)展中具有巨大的潛力。

盡管原核顯微注射[6]、慢病毒[7]和精子介導(dǎo)的基因傳遞以及胞漿內(nèi)精子注射[8]等技術(shù)已在動物基因編輯中取得進(jìn)展，但是這些技術(shù)產(chǎn)生的基因編輯動物通常效率低下且為嵌合體。體細(xì)胞基因編輯結(jié)合SCNT 產(chǎn)生的基因編輯豬基因型明確且可遺傳給后代，是生產(chǎn)基因編輯豬的首選方法。但是，豬成纖維細(xì)胞的增殖能力有限，長時間培養(yǎng)后更容易老化[9]。同時，多基因編輯和長期細(xì)胞篩選過程造成豬基因編輯陽性細(xì)胞DNA 損傷或突變，影響基因編輯克隆豬的生產(chǎn)效率。因此，快速有效地篩選基因編輯陽性供體細(xì)胞系是獲得基因編輯克隆豬的重要前提。

在篩選基因編輯陽性細(xì)胞的過程中，首先利用構(gòu)建成功的目的基因打靶載體轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞，然后通過極度稀釋培養(yǎng)出單細(xì)胞克隆或通過流式細(xì)胞術(shù)分選后進(jìn)行單細(xì)胞培養(yǎng)，這通常需要添加相應(yīng)的抗性藥物進(jìn)行長期培養(yǎng)和篩選，直至單細(xì)胞克隆形成。該篩選過程可能對細(xì)胞造成物理損傷或化學(xué)毒性，減慢細(xì)胞的生長速度，甚至引起DNA 損傷或突變[10]。有研究報道一些單細(xì)胞克隆的形成長達(dá)22 d[11-12]，鑒定陽性基因編輯細(xì)胞系所需的細(xì)胞數(shù)量高達(dá)103個[11,13]，導(dǎo)致大量細(xì)胞衰老，可供傳代的細(xì)胞數(shù)量減少，甚至篩選出的陽性細(xì)胞無法繼續(xù)傳代而死亡，嚴(yán)重影響基因編輯克隆豬產(chǎn)生的效率?？紤]到豬基因編輯陽性細(xì)胞的篩選周期長、篩選效率低和成功率低的問題，本研究利用已知基因編輯陽性細(xì)胞系建立微量細(xì)胞鑒定陽性細(xì)胞克隆的方法，然后通過鑒定未知的基因編輯陽性細(xì)胞系證明該方法的可行性，縮短細(xì)胞篩選周期，提高豬基因編輯陽性細(xì)胞系的篩選效率，對快速生產(chǎn)基因編輯豬具有重要的參考價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究所用的野生型滇南小耳豬胎兒成纖維細(xì)胞來自云南農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗動物中心，卵巢采自云南省昆明市呈貢區(qū)鴻騰屠宰場。所有試劑耗材除特別說明外均購自Gbico、Corning、Sigma-Aldrich、BI、Solarbio、Ausbian 和Lonza 公司。所有的試驗均在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)云南省動物基因編輯與體細(xì)胞克隆技術(shù)重點實驗室完成。

1.2 基因編輯豬成纖維細(xì)胞系的梯度計數(shù)

將基因編輯的滇南小耳豬成纖維細(xì)胞系進(jìn)行傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至40%～60%的匯合度時，用0.25%的胰蛋白酶消化后置于顯微操作系統(tǒng)，按20、50、100、150 和200 個細(xì)胞計數(shù)后分別轉(zhuǎn)移至含2 μL 細(xì)胞裂解液的PCR 管中用于基因型鑒定，每個梯度3 個重復(fù)。

1.3 細(xì)胞基因型鑒定并確定鑒定所需最低細(xì)胞量

將計數(shù)的20、50、100、150 和200 個細(xì)胞用細(xì)胞裂解液分別裂解后提取細(xì)胞基因組DNA，進(jìn)行目的基因片段的PCR 擴(kuò)增、T7EN1酶切和Sanger 測序，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。利用Image Lab 軟件(Bio-Rad v6.0)進(jìn)行電泳條帶的灰度值分析，測序結(jié)果利用SnapGene 軟件(GSL Biotech v3.2.1.0)進(jìn)行序列比對，確定細(xì)胞基因型鑒定所需的最低細(xì)胞量。

1.4 基因靶向載體的轉(zhuǎn)染和單細(xì)胞克隆培養(yǎng)

為驗證微量細(xì)胞鑒定方法的可行性，我們設(shè)計了基于CRISPR/Cas9的基因編輯載體來靶向豬IPO13基因(sgRNA1：ACATCAAGATCTCTCGCTAT；sgRNA2：GCAGCTACTGCAGCCCGACA)。轉(zhuǎn)染前2 d，將野生型滇南小耳豬胎兒成纖維細(xì)胞解凍并傳代。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到40%～60%匯合度時，用0.25%胰蛋白酶消化。然后加入2%FBS 終止消化，并將細(xì)胞在室溫下以1 200 r/min離心3 min，收集細(xì)胞沉淀并準(zhǔn)確計數(shù)。取大約3×105PFF，再次離心，收集沉淀。將載體(mCas9：msgRNA＝2∶1)與電穿孔緩沖液充分混合。將細(xì)胞溫育5 min，充分混合并轉(zhuǎn)移至電擊杯中，在設(shè)定的Lonza-4D 核轉(zhuǎn)染儀程序下進(jìn)行轉(zhuǎn)染。電擊完成后，加入約80 μL 完全細(xì)胞培養(yǎng)液，將電擊杯置于5% CO2、38 ℃培養(yǎng)箱中靜置15 min，輕輕將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至加有完全培養(yǎng)液的6 cm 培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)。48 h 后，加入2.0 μg/mL的 Puromycin 維持篩選2 d 后，極度稀釋至10 cm 培養(yǎng)皿進(jìn)行單克隆培養(yǎng)，每3 d 換液1 次，約9 d 時單細(xì)胞克隆形成，在顯微鏡下用記號筆圈出單克隆，棄除上清液，PBS 清洗2 遍，將單細(xì)胞克隆用0.25%胰蛋白酶消化后，挑取單細(xì)胞克隆于96 孔板繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)，選取細(xì)胞生長匯合度為70%～80%的孔消化，取20 μL 細(xì)胞懸液準(zhǔn)確挑取既定數(shù)量的細(xì)胞至PCR 管中，進(jìn)行后續(xù)的細(xì)胞基因型鑒定。

1.5 基因編輯單細(xì)胞克隆的基因型鑒定

將既定數(shù)量的細(xì)胞裂解后提取基因組DNA作為模板，利用特異性引物(IPO13-F：5′-AAGCACTTGAGCACCTTCTGAC-3′；IPO13-R：5′-AAGTTCAGGCTCTCAAGACATC-3′)進(jìn)行PCR。使用PCR 純化試劑盒(AP-PCR-50，Axygen，New York，USA)純化PCR 產(chǎn)物，進(jìn)行T7EN1酶切和Sanger 測序。將陽性細(xì)胞克隆所對應(yīng)的PCR 產(chǎn)物通過TA 克隆到pMD19 T 載體上，挑取8 個單克隆細(xì)菌菌落進(jìn)行Sanger 測序。雙等位基因缺失所對應(yīng)的細(xì)胞克隆選為供體細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，用作后續(xù)的SCNT。

1.6 胎兒成纖維細(xì)胞的分離與提取

手術(shù)獲得35 d的基因編輯胎兒，立即將其浸入含5%青霉素—鏈霉素溶液(PS)和10% FBS的DMEM 溶液中，并運(yùn)送到實驗室。在層流罩下去除胎兒的頭、尾、四肢和內(nèi)臟，用無菌PBS(含5% PS)將剩余的胎兒組織清洗3 次，并用不含PS的PBS 清洗5 次。用眼科剪刀將組織切成碎片，轉(zhuǎn)移至T25 燒瓶中，加入3 mL 膠原酶IV，并將組織在37 ℃恒溫箱的水平搖床上消化1 h。通過離心除去膠原酶后，將收集的細(xì)胞在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中用含有2% FBS 和1%PS的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)。每3 d 更換1 次培養(yǎng)基，傳代5×104細(xì)胞/mL的密度并冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 體細(xì)胞核移植和胚胎移植

體細(xì)胞核移植按已有報道的方法[14]進(jìn)行，即將體外成熟培養(yǎng)的卵母細(xì)胞利用顯微操作系統(tǒng)去核后，再將基因編輯陽性細(xì)胞注射到去核的卵母細(xì)胞中，經(jīng)過電融合和電激活后，移入PZM-3 培養(yǎng)液中進(jìn)行體外培養(yǎng)獲得重構(gòu)胚胎。將重構(gòu)胚移入至發(fā)情代孕母豬的輸卵管內(nèi)，移植后29～33 d時通過B 超(HS-101V，Japan)檢測代孕母豬的妊娠情況，確定妊娠后35 d 通過外科手術(shù)獲取IPO13KO胎兒。參照1.5 節(jié)的方法鑒定胎兒的基因型。以確定為IPO13基因編輯陽性的胎兒成纖維細(xì)胞作為供體細(xì)胞，進(jìn)行第2 輪體細(xì)胞核移植和胚胎移植，通過B 超檢測代孕母豬妊娠情況，妊娠約114 d 時代孕母豬分娩獲得IPO13克隆仔豬。用同樣的方法鑒定IPO13克隆仔豬的基因型。

1.8 統(tǒng)計分析

PCR 和T7EN1的定量數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)”表示；使用SPSS 22.0的student-t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析，包括PCR 結(jié)果、T7EN1 以及50CIM (50 cells identified method)和GM (general method)篩選時間。使用校正后的四格表卡方檢驗比較50CIM 和GM 篩選的成功率。P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01 和P＜0.001 表示差異極顯著，并使用GraphPad Prism 7 軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 最小數(shù)量基因編輯陽性細(xì)胞的確定

為確定用于基因型鑒定所需的最小細(xì)胞量，利用發(fā)表的已知基因型的基因編輯陽性細(xì)胞系(GHRKO)[15]來建立方法。首先，計數(shù)不同細(xì)胞數(shù)(圖1a)，然后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果顯示：各細(xì)胞組擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物都清晰可見(圖1b、d)，但T7EN1 消化后擴(kuò)增出的PCR 產(chǎn)物在20 個細(xì)胞組難以辨清，在其他組中均顯示出2 條清晰的切割條帶(175 和555 bp)(圖1c)，灰度值分析顯示：20 個細(xì)胞組與其他組間均存在顯著差異(圖1e)。由此初步確定50 個細(xì)胞為可用于基因型鑒定的細(xì)胞量。另外，將最小細(xì)胞數(shù)(50 個細(xì)胞)的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行TA 克隆和測序，GHR基因帶有47 和46 bp的缺失(圖1f)，因此認(rèn)為50 個細(xì)胞可用于基因型鑒定。

圖1 已知不同細(xì)胞量的基因編輯陽性細(xì)胞基因型鑒定結(jié)果Fig.1 Genotype identification results of gene editing positive cells with different cell mass

2.2 最小細(xì)胞數(shù)用于基因型鑒定的驗證

為驗證最小細(xì)胞數(shù)用于基因型鑒定的可行性，我們設(shè)計了2 條靶向IPO13KO基因2 號外顯子的sgRNA，2 個靶點的距離約為60 bp (圖2a)?；虬邢蜉d體轉(zhuǎn)染和單細(xì)胞克隆結(jié)果表明：4 號和17 號單細(xì)胞克隆為基因編輯陽性細(xì)胞系(圖2b～c)；4 號單細(xì)胞克隆為IPO13單等位基因缺失細(xì)胞系，其中一條鏈缺失56 bp，另一條鏈為WT；17 號單細(xì)胞克隆為IPO13雙等位基因缺失細(xì)胞系，其中2 條單鏈分別發(fā)生6 和8 bp的堿基缺失(圖2d～e)。該結(jié)果也提示在4 號單細(xì)胞克隆中，2 條sgRNA 發(fā)揮作用但只產(chǎn)生單等位基因缺失；在17 號單細(xì)胞克隆中，僅1 條sgRNA(IPO13-sgRNA2)發(fā)揮作用但產(chǎn)生了雙等位基因缺失。因此，選17 號單細(xì)胞克隆為供體細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)的SCNT。

圖2 豬IPO13KO 基因編輯陽性單細(xì)胞克隆的篩選Fig.2 Selection of porcine IPO13KO positive single-cell colonies

2.3 IPO13KO 胎兒和仔豬的產(chǎn)生

以17 號細(xì)胞系作為供體細(xì)胞進(jìn)行SCNT，在第1 輪SCNT 中共構(gòu)建了1 753 枚克隆胚，并將其移植至5 頭代孕母豬中，B 超檢測發(fā)現(xiàn)有2 頭代孕母豬妊娠，妊娠率為40%，其中1 頭代孕母豬在妊娠35 d 時通過外科手術(shù)獲得8 個成活的胎兒。建立胎兒成纖維細(xì)胞系，以1 號胎兒成纖維細(xì)胞為供體細(xì)胞進(jìn)行第2 輪SCNT，共構(gòu)建了3 260 枚克隆胚，將其移植至11 頭代孕母豬中，B 超檢測發(fā)現(xiàn)有6 頭代孕母豬妊娠，妊娠率為54.5%，4 頭分娩，共獲得9 頭克隆仔豬，6 頭成活(表1)。

表1 豬IPO13KO 克隆胚胎移植至代孕母豬中的發(fā)育情況Tab.1 Development of reconstructed IPO13KO cloned embryos after transfer to recipients

2.4 IPO13KO 胎兒及仔豬基因型鑒定

結(jié)果(圖3a～c)顯示：8 個胎兒的IPO13KO基因片段PCR 產(chǎn)物均為785 bp，進(jìn)一步通過T7EN1 酶切后分別可見470 和315 bp的分裂條帶。Sanger 測序結(jié)果顯示：在IPO13KO基因靶點的位置分別可見8 和6 bp的堿基缺失，證明所獲得的胎兒基因型與17 號供體細(xì)胞的基因型完全一致(圖3e)。同樣，9 頭仔豬PCR 產(chǎn)物也為785 bp，T7EN1 酶切后分裂條帶為470 和315 bp，Sanger 測序結(jié)果為8 和6 bp的堿基缺失，證明所獲得的克隆仔豬基因型與17 號供體細(xì)胞及克隆胎兒成纖維細(xì)胞的基因型完全一致(圖3d～e)。

圖3 克隆胎兒及仔豬IPO13KO 基因型鑒定Fig.3 Detection of IPO13KO genotypes in fetuses and piglets

2.5 豬基因編輯陽性成纖維細(xì)胞系快速篩選新方法與普通篩選方法比較

我們利用普通篩選方法先后共轉(zhuǎn)染了37種不同目的基因打靶載體至豬胎兒成纖維細(xì)胞中，經(jīng)篩選后成功獲得了GTKO[16]、GTKO/hCD55/hCD59三基因修飾[10]、GHRKO[15]、P53KO[17]、Leptin過表達(dá)[18]等9種不同基因編輯豬陽性成纖維細(xì)胞系，進(jìn)行SCNT 后均獲得了相應(yīng)的基因編輯克隆豬，篩選成功率為24.3% (9/37)，平均篩選周期為33.7 d。按照本研究中豬基因編輯陽性細(xì)胞快速篩選新方法先后共轉(zhuǎn)染了33種不同目的基因打靶載體至豬胎兒成纖維細(xì)胞中，經(jīng)篩選后成功獲得IPO13KO等29種不同基因編輯豬陽性成纖維細(xì)胞系，部分經(jīng)SCNT 后獲得了相應(yīng)基因編輯的胎兒或克隆豬，篩選成功率為87.9%(29/33) (χ2=28.38，P＜0.005)，平均篩選周期為18.9 d。2種篩選方法相比，篩選周期縮短約15 d(P＜0.001)，篩選成功率提高約4 倍(圖4)。

圖4 新篩選方法與普通篩選方法的篩選周期與篩選成功率比較Fig.4 Comparison of screening cycle and success rate between new screening method and general screening method

3 討論

因豬在解剖學(xué)、生理學(xué)及生化指標(biāo)等方面與人極為相似，基因編輯豬在人類疾病模型、異種器官移植及比較醫(yī)學(xué)等研究領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價值。目前，豬尚無真正的可供基因編輯和SCNT 用的干細(xì)胞，豬胎兒成纖維細(xì)胞系仍是豬基因編輯及SCNT 供體細(xì)胞的首選。但豬成纖維細(xì)胞增殖能力有限，培養(yǎng)過程中易發(fā)生衰老，且在篩選過程中常需在培養(yǎng)基中添加G418 和Puromycin 等抗生素，導(dǎo)致豬成纖維細(xì)胞陽性單克隆形成周期延長，甚至可長達(dá)8～10 周。此外，通過流式細(xì)胞儀分選后，易對細(xì)胞產(chǎn)生物理性損傷，不利于單細(xì)胞克隆的形成和傳代培養(yǎng)，造成豬基因編輯陽性細(xì)胞篩選的成功率及SCNT效率低下。如圖5 所示：在基因編輯陽性豬胎兒成纖維細(xì)胞篩選的過程中，普通的篩選方法需將單細(xì)胞克隆增殖至24 孔板后再收集1/2的細(xì)胞量進(jìn)行細(xì)胞基因型鑒定，然而豬成纖維細(xì)胞增殖能力有限，在此過程中，需對單細(xì)胞克隆進(jìn)行多次的胰蛋白酶消化傳代，對細(xì)胞的損傷加大，進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生衰老，細(xì)胞活力變差甚至死亡。其次，因成纖維細(xì)胞的增殖具有密度依賴性，大量的單細(xì)胞克隆被用于鑒定會致使剩余細(xì)胞密度較低，不利于長期傳代和擴(kuò)大培養(yǎng)，甚至在傳代的過程中造成細(xì)胞死亡，導(dǎo)致基因編輯陽性細(xì)胞丟失，嚴(yán)重制約了基因編輯陽性細(xì)胞系的篩選效率和基因編輯克隆豬的產(chǎn)生。

圖5 基因編輯豬陽性成纖維細(xì)胞篩選示意圖Fig.5 Diagram of selection of positive porcine gene-editing fibroblasts

供體細(xì)胞的質(zhì)量也是影響SCNT 效率及克隆胚胎發(fā)育的重要因素。在SCNT 研究過程中，供體細(xì)胞的代次[19]、細(xì)胞分化狀態(tài)[9,20]、培養(yǎng)方式[21-23]、同期化水平[24]及表觀遺傳狀態(tài)[19,25]均可影響SCNT的效率。在體外短期培養(yǎng)的供體細(xì)胞比長期培養(yǎng)的供體細(xì)胞更容易進(jìn)行核移植重編程，以早期代次的供體細(xì)胞進(jìn)行核移植后的胚胎發(fā)育率優(yōu)于晚期代次的供體細(xì)胞[26]。在山羊體細(xì)胞克隆中，隨著山羊成纖維細(xì)胞傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞形態(tài)學(xué)發(fā)生變化，高代次的細(xì)胞衰老顯著高于低代次細(xì)胞，且高代次供體細(xì)胞構(gòu)建的重構(gòu)胚的發(fā)育能力低于低代次[27]。本研究在前期大量豬基因編輯陽性細(xì)胞篩選的基礎(chǔ)上，優(yōu)化了細(xì)胞篩選的各個環(huán)節(jié)，建立了豬基因編輯陽性成纖維細(xì)胞系快速篩選方法。該方法在單細(xì)胞克隆形成的早期階段(96 孔板中)即可對單細(xì)胞克隆進(jìn)行準(zhǔn)確計數(shù)，取50 個細(xì)胞進(jìn)行基因型鑒定，鑒定為基因編輯陽性的細(xì)胞系可立即用于SCNT，從而使細(xì)胞篩選周期縮短約15 d，同時也減少了供體細(xì)胞體外培養(yǎng)時間和傳代次數(shù)，最大限度地保證了細(xì)胞的活力，提高了SCNT 重編程的效率。但是，該方法在96 孔板中(約2 000 個細(xì)胞)取出1 000 個陽性細(xì)胞作為供體細(xì)胞進(jìn)行SCNT，剩余的細(xì)胞最多還可用于3 次SCNT。若細(xì)胞用完，則需重頭進(jìn)行陽性供體細(xì)胞篩選。若通過外科手術(shù)從妊娠母豬中取胎兒并進(jìn)行基因型鑒定后，建立相應(yīng)的豬胎兒成纖維細(xì)胞系，可獲得大量具備高活力的基因編輯豬陽性細(xì)胞系，從而保證充足的SCNT 供體細(xì)胞來源。總之，本研究建立的方法在縮短篩選周期的同時，還大大提高了細(xì)胞篩選的成功率，可最大限度地維持豬成纖維細(xì)胞的增殖能力，獲得大量高活力的基因編輯陽性豬胎兒成纖維細(xì)胞系，為后續(xù)批量的SCNT 及相關(guān)基因功能驗證提供了充足的細(xì)胞資源。

4 結(jié)論

本研究建立了一種豬基因編輯陽性成纖維細(xì)胞系快速篩選的方法，并應(yīng)用該方法快速篩選獲得IPO13KO等29種不同基因編輯的豬陽性細(xì)胞系；進(jìn)一步以此為供體細(xì)胞進(jìn)行SCNT，成功獲得9 頭IPO13KO克隆豬。與普通篩選方法相比，該方法促使篩選周期縮短約15 d，篩選成功率提高約4 倍，為快速產(chǎn)生豬基因編輯克隆豬提供了重要的理論依據(jù)和借鑒方法。