梁益軍，韋雪亮，劉春雨

(1.桂林電子科技大學(xué) 體育部，廣西 桂林 541004；2.廣西大學(xué) 體育學(xué)院，廣西 南寧 540003；3.玉林師范學(xué)院 體育健康學(xué)院，廣西 玉林 537000)

亞健康已成為當(dāng)代突出的社會(huì)問(wèn)題。疲勞是亞健康主要癥狀之一，導(dǎo)致機(jī)體精力或體力減弱和喪失[1]。疲勞狀態(tài)的累積和惡化可造成“過(guò)勞”現(xiàn)象，已發(fā)展成為常見(jiàn)生理、精神、心理和社會(huì)問(wèn)題，其可導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)分泌紊亂和免疫抵抗能力的下降，繼而發(fā)展成慢性疲勞綜合征和過(guò)度訓(xùn)練綜合征等，嚴(yán)重威脅人類健康[2-3]。長(zhǎng)時(shí)間或高強(qiáng)度體力活動(dòng)使肌群處于長(zhǎng)時(shí)間過(guò)度收縮狀態(tài)，伴隨持續(xù)能量消耗及氧化代謝產(chǎn)物堆積，因機(jī)體代謝失衡，產(chǎn)物隨血液運(yùn)行至全身，刺激中樞神經(jīng)系統(tǒng)，加重疲勞狀態(tài)[4]。能量耗竭—代謝產(chǎn)物堆積—氧自由基和脂質(zhì)過(guò)氧化已成為機(jī)體疲勞的主要理論[5]。傳統(tǒng)抗疲勞物質(zhì)多為營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化生物制劑以及補(bǔ)益功能提取物[6]。前者在提高運(yùn)動(dòng)能力和延緩疲勞的作用已得到證實(shí)，但其不可避免的副作用及興奮劑成分給機(jī)體造成嚴(yán)重危害，且使用存在一定局限性[7]。

構(gòu)建恰當(dāng)動(dòng)物疲勞模型是研究評(píng)估抗疲勞物質(zhì)作用的前提，如負(fù)重游泳試驗(yàn)和轉(zhuǎn)棒試驗(yàn)，可有助于客觀反映機(jī)體運(yùn)動(dòng)耐力[8]。疲勞作為一種常見(jiàn)但非特異性的生理狀態(tài)，可通過(guò)功能和代謝監(jiān)測(cè)表征，但慢性疲勞的診斷主觀性較強(qiáng)。因此，了解其生物學(xué)機(jī)制并依據(jù)相關(guān)生物學(xué)標(biāo)志物對(duì)運(yùn)動(dòng)疲勞診治具有重要臨床意義。

Glu、BUN、Lac、糖原、MDA、T-SOD 及GSH-Px 等均是研究疲勞發(fā)生機(jī)制的常見(jiàn)指標(biāo)，而尋找更為安全有效的抗疲勞物質(zhì)勢(shì)在必行。近階段研究將抗疲勞物質(zhì)的探索轉(zhuǎn)向傳統(tǒng)植物，其溫和而毒副作用小。山葵(Eutrema yunnanense)是一種富含維生素和礦物質(zhì)的喬木，具有多重生物學(xué)活性，如防癌、抗炎和抗氧化等，奠定了其在醫(yī)藥和食品領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的基礎(chǔ)[9]。鑒于其抗疲勞機(jī)制報(bào)道較為少見(jiàn)，本研究通過(guò)構(gòu)建小鼠運(yùn)動(dòng)性疲勞動(dòng)物模型對(duì)山葵樹葉有效成分進(jìn)行深入研究，驗(yàn)證山葵樹葉提取物的抗疲勞功能及作用機(jī)制，為新型功能性營(yíng)養(yǎng)制劑的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1試驗(yàn)動(dòng)物

動(dòng)物試驗(yàn)?zāi)Ｐ凸灿?jì)納入60 只4～5 周齡健康清潔級(jí)雄性BALB/c 小鼠，體質(zhì)量18～20 g [SCXK(滬) 2016-0006、SYXK (滬) 2015-0011，復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部]。試驗(yàn)小鼠以普通基礎(chǔ)飼料進(jìn)行分籠，適應(yīng)性喂養(yǎng)于干潔、通風(fēng)和溫、濕控制(溫度20～25 ℃，相對(duì)濕度40%～70%)的晝夜節(jié)律均衡環(huán)境中。小鼠自由飲水進(jìn)食，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后體質(zhì)量達(dá)(25.00±1.44) g/只。本試驗(yàn)方案經(jīng)廣西大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用委員會(huì)(IACUC)審批(2017—015)；動(dòng)物試驗(yàn)方法和操作程序符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)以及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與使用指南[10]，并以“3R 原則”為指導(dǎo)。

1.1.2試驗(yàn)用山葵樹葉提取物

山葵樹葉提取物樣品由廣元市璽府生物科技有限公司(中國(guó)四川)提供，樣品原料制備成碎末狀，過(guò)篩后于低溫冰箱避光保存。稱取一定量山葵樹葉粉末，加入70%乙醇溶液，放入超聲波清洗機(jī)進(jìn)行超聲震蕩提??；3 500 r/min 離心10 min，取上清液，重復(fù)2 次，合并上清液；真空濃縮處理；凍干后獲取山葵樹葉提取物粉末(棕褐色，固體磨細(xì)粉)。

1.1.3試驗(yàn)動(dòng)物分組

將納入60 只小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法進(jìn)行分組，共計(jì)6 個(gè)組別，每組10 只小鼠。(1) 空白對(duì)照組：自由攝入水和常規(guī)基礎(chǔ)飼料，無(wú)轉(zhuǎn)棒及游泳試驗(yàn)；(2) 游泳對(duì)照組：自由飲水和常規(guī)基礎(chǔ)飼料，進(jìn)行轉(zhuǎn)棒及游泳試驗(yàn)；(3) 陽(yáng)性對(duì)照組：灌胃200 mg/kg 紅景天(取紅景天軟膠囊用雙蒸水溶解)，進(jìn)行轉(zhuǎn)棒及游泳試驗(yàn)；(4)～(6)山葵葉高、中、低劑量組：分別灌胃500、1 000 和2 000 mg/kg 山葵樹葉(取山葵樹葉提取物粉末用雙蒸水溶解)，進(jìn)行轉(zhuǎn)棒及游泳試驗(yàn)。受試物為每日現(xiàn)用現(xiàn)配，每天同一時(shí)間灌胃給藥，小鼠自由飲水，試驗(yàn)周期為4 周。試驗(yàn)用紅景天軟膠囊購(gòu)于甘肅阿爾康生物工程有限公司(中國(guó)陜西)，雙蒸水由南京億迅生物科技有限公司(中國(guó)江蘇)提供。

1.2 運(yùn)動(dòng)性疲勞試驗(yàn)

1.2.1轉(zhuǎn)棒試驗(yàn)

于小鼠給藥28 d (末次灌胃給藥)后1 h，將試驗(yàn)小鼠放于電動(dòng)轉(zhuǎn)棒(轉(zhuǎn)速40 r/min)上，試驗(yàn)觀察5 min，以保持15 s 不從轉(zhuǎn)棒上跌落為準(zhǔn)，記錄各組小鼠的轉(zhuǎn)棒時(shí)間(s)。試驗(yàn)完成后將小鼠恢復(fù)正?；\養(yǎng)狀態(tài)。

1.2.2小鼠力竭游泳試驗(yàn)

轉(zhuǎn)棒試驗(yàn)完成后，繼續(xù)對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃給藥5 d。于末次灌胃給藥5 h 后，進(jìn)行力竭游泳試驗(yàn)。試驗(yàn)環(huán)境為恒溫游泳箱(高30 cm，寬1 cm，水深20 cm，水溫25.00 ℃±0.50 ℃)。第1 周作適應(yīng)性訓(xùn)練，最初運(yùn)動(dòng)時(shí)間為20 min/d，每日遞增10 min，逐步延長(zhǎng)至60 min/d (1～2 d 為無(wú)負(fù)重適應(yīng)性游泳，后5 d 為尾部負(fù)重1%體質(zhì)量的鉛絲進(jìn)行負(fù)重適應(yīng)性游泳)。為達(dá)到運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練時(shí)間，若小鼠停留于水面漂浮休息，給予木棍劃水驅(qū)使，保持游泳狀態(tài)。試驗(yàn)時(shí)，將小鼠尾部負(fù)荷鉛絲(5%體質(zhì)量)，記錄小鼠開始下水運(yùn)動(dòng)至沉入水底不再浮起的時(shí)間，即為小鼠力竭游泳時(shí)間(min)。使用溫度計(jì)隨時(shí)監(jiān)測(cè)游泳箱水溫，保持恒溫。試驗(yàn)結(jié)束，迅速撈出小鼠并吹干，即刻采血。

1.3 小鼠血液樣本采集

乙醚吸入式麻醉后，以毛細(xì)管伸入小鼠眼球后部靜脈叢，旋轉(zhuǎn)式取血。血液樣本采集至無(wú)菌抗凝采血管中，離心去上層血漿，分裝至離心管，-40 ℃凍存?zhèn)溆谩Ｑ簶?biāo)本采集后，行脫頸法迅速處死小鼠，暴露小鼠胸腔，迅速取肝臟。生理鹽水漂洗后濾紙吸干，凍存?zhèn)溆谩７Q取組織樣本，剪成細(xì)小組織塊，離心并冰浴，采用高通量組織勻漿機(jī)獲取組織勻漿液。

1.4 指標(biāo)測(cè)定

取低溫凍存血漿和組織標(biāo)本，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)血漿中Glu、BUN 和Lac的含量、組織中糖原和MDA的含量以及T-SOD 和GSHPx的活性。所述指標(biāo)檢測(cè)試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用SPSS 18.00 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 山葵樹葉提取物對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響

由表1 可知：各組小鼠初始(0 d)體質(zhì)量組間差異均不顯著。與空白對(duì)照組相比，游泳對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組小鼠體質(zhì)量增加，但組間差異均不顯著。與游泳對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組相比，山葵樹葉提取物高、中、低劑量組第7 天開始體質(zhì)量增長(zhǎng)，但組間差異不顯著。山葵樹葉提取物高、中、低劑量組間差異也不顯著。

表1 山葵樹葉提取物對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響Tab.1 Effects of the extract of horseradish leaves on the body weight of mice g

2.2 山葵樹葉提取物對(duì)小鼠轉(zhuǎn)棒時(shí)間的影響

由表2 可知：與游泳對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照組以及山葵樹葉提取物中劑量組和高劑量組小鼠轉(zhuǎn)棒時(shí)間顯著延長(zhǎng)；而其與低劑量組組間差異不顯著。與陽(yáng)性對(duì)照組相比，高劑量組小鼠轉(zhuǎn)棒時(shí)間顯著延長(zhǎng)，而其與中劑量組組間差異不顯著；且高劑量組小鼠轉(zhuǎn)棒時(shí)間顯著長(zhǎng)于中劑量組。

表2 山葵樹葉提取物對(duì)小鼠轉(zhuǎn)棒時(shí)間的影響Tab.2 Effect of the horseradish leaf extracts on the time of rolling stick in mice

2.3 山葵樹葉提取物對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)至力竭時(shí)間的影響

由表3 可知：與游泳對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照組以及山葵樹葉提取物中劑量組和高劑量組小鼠運(yùn)動(dòng)至力竭時(shí)間顯著延長(zhǎng)；而其與低劑量組組間差異不顯著。與陽(yáng)性對(duì)照組相比，高劑量組小鼠運(yùn)動(dòng)至力竭時(shí)間顯著延長(zhǎng)；而其與中劑量組組間差異不顯著；且高劑量組小鼠運(yùn)動(dòng)至力竭時(shí)間顯著長(zhǎng)于中劑量組。

表3 山葵樹葉提取物對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)至力竭時(shí)間的影響Tab.3 Effect of the horseradish leaf extracts on the time of exercise to exhaustion in mice

2.4 山葵樹葉提取物對(duì)小鼠血漿中Glu、BUN和Lac 含量的影響

由表4 可知：與空白對(duì)照組相比，游泳對(duì)照組Glu 含量顯著降低，BUN 和Lac 含量顯著升高。與游泳對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照組和山葵樹葉提取物低、中、高劑量組小鼠Glu 含量顯著升高；陽(yáng)性對(duì)照組和山葵樹葉提取物低劑量組小鼠BUN 和Lac 含量降低，但組間差異不顯著。與陽(yáng)性對(duì)照組相比，山葵樹葉提取物中劑量組和高劑量組Glu 含量顯著提升，但小鼠BUN 和Lac 含量均顯著降低。

表4 山葵樹葉提取物對(duì)小鼠血漿中Glu、BUN和Lac 含量的影響Tab.4 Effect of the horseradish leaf extracts on the contents of Glu,BUN and Lac in plasma in mice mmol/L

2.5 山葵樹葉提取物對(duì)小鼠組織糖原和MDA 含量以及T-SOD 和GSH-Px 活性的影響

由表5 可知：與空白對(duì)照組相比，游泳對(duì)照組糖原含量以及T-SOD 和GSH-Px 活性降低，MDA 含量升高，組間差異顯著。而與游泳對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照組和山葵樹葉提取物低、中、高劑量組小鼠糖原含量以及T-SOD 和GSH-Px 活性均顯著升高；與陽(yáng)性對(duì)照組相比，中劑量組和高劑量組糖原含量以及T-SOD 和GSH-Px 活性顯著提升，且高劑量組提升趨勢(shì)更顯著。同時(shí)，與游泳對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照組和山葵樹葉提取物低劑量組小鼠MDA 含量降低，但組間差異不顯著；與陽(yáng)性對(duì)照組相比，山葵樹葉提取物中劑量組和高劑量組小鼠MDA 含量顯著降低，且高劑量組含量低于中劑量組，組間差異顯著。

表5 山葵樹葉提取物對(duì)小鼠糖原和MDA 含量以及T-SOD 和GSH-Px 活性的影響Tab.5 Effect of the horseradish leaf extracts on the contents of glycogen and MDA,and the activities of T-SOD and GSH-Px in mice

3 討論

機(jī)體生理過(guò)程中，若機(jī)能不能維持于特定含量或器官不能承受預(yù)定運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度，可出現(xiàn)疲勞。延緩疲勞和促進(jìn)機(jī)體恢復(fù)是運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)、康復(fù)醫(yī)學(xué)和保健醫(yī)學(xué)的科研重點(diǎn)?？蛊诳赏ㄟ^(guò)補(bǔ)充能量并改善代謝、提高激素含量、清除代謝產(chǎn)物和提高耐氧能力等途徑實(shí)現(xiàn)[11]。一些生物制劑已被證實(shí)具有延緩和消除疲勞的作用，但其副作用和所含成分局限了其應(yīng)用和推廣[7]。本研究目的在于尋找更為安全和有效的抗疲勞物質(zhì)。

已有研究表明：茶葉提取物(如綠茶和紅茶等)均具有一定的抗疲勞功效[12-14]。屈萍等[12]研究發(fā)現(xiàn)：綠茶提取物可有助于降低肌細(xì)胞膜通透性或減少細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化酶活性，進(jìn)而促進(jìn)氧自由基及其代謝產(chǎn)物的清除，從而降低過(guò)量自由基對(duì)機(jī)體的損傷，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，促進(jìn)運(yùn)動(dòng)性疲勞的消除。GHOSH 等[13]報(bào)道：果蔬中的天然黃酮類化合物有助于清除活性氧，減輕活性氧引起的損傷，維持機(jī)體健康，并證實(shí)紅茶提取物的抗氧化活性。俞發(fā)榮等[14]發(fā)現(xiàn)：瑪咖提取物可提高游泳大鼠SOD 和GSHPx 活性，進(jìn)而提高機(jī)體內(nèi)源性氧自由基清除能力，最終增強(qiáng)機(jī)體運(yùn)動(dòng)能力。測(cè)定機(jī)體維持運(yùn)動(dòng)至力竭的時(shí)間則可在一定程度上反映機(jī)體運(yùn)動(dòng)耐力狀況及改善程度。在本研究中，試驗(yàn)小鼠在不同干預(yù)組別和不同時(shí)間下體質(zhì)量無(wú)明顯變化，提示山葵樹葉提取物補(bǔ)給不會(huì)對(duì)小鼠生長(zhǎng)造成異常影響；轉(zhuǎn)棒試驗(yàn)和游泳至力竭試驗(yàn)均提示：與游泳對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照組和山葵樹葉提取物中劑量組和高劑量組小鼠轉(zhuǎn)棒時(shí)間和運(yùn)動(dòng)至力竭時(shí)間明顯延長(zhǎng)；與陽(yáng)性對(duì)照組相比，高劑量組小鼠轉(zhuǎn)棒時(shí)間和運(yùn)動(dòng)至力竭時(shí)間顯著延長(zhǎng)；且高劑量組小鼠運(yùn)動(dòng)至力竭時(shí)間顯著長(zhǎng)于中劑量組。該結(jié)果提示山葵樹葉提取物處理延長(zhǎng)了小鼠運(yùn)動(dòng)耐力并提高了運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度，直接反映出小鼠運(yùn)動(dòng)抗疲勞能力的提升。

為探究山葵樹葉提取物對(duì)小鼠抗疲勞能力、運(yùn)動(dòng)耐力和能量代謝能力作用及潛在機(jī)制，本研究采集運(yùn)動(dòng)小鼠血漿和肝臟組織標(biāo)本，測(cè)定血漿中Glu、BUN 和Lac 含量、組織中糖原和MDA 含量以及T-SOD 和GSH-Px 活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與空白對(duì)照組相比，游泳對(duì)照組Glu 含量降低，BUN和Lac 含量升高，提示游泳導(dǎo)致Glu的消耗及BUN 和Lac的堆積。而與游泳對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照組和山葵樹葉提取物低、中、高劑量組小鼠Glu 含量升高；與陽(yáng)性對(duì)照組相比，中劑量組和高劑量組Glu 含量提升，且高劑量組提升趨勢(shì)更顯著。同時(shí)，現(xiàn)有研究已證實(shí)紅景天在提高運(yùn)動(dòng)耐力和抗疲勞方面的作用[15-16]。因此本研究設(shè)立已有明確藥效的紅景天作為陽(yáng)性對(duì)照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與陽(yáng)性對(duì)照組相比，山葵樹葉提取物中、高劑量組小鼠BUN 和Lac 含量降低，且高劑量組含量低于中劑量組，提示山葵樹葉提取物作用顯著，且優(yōu)于可增強(qiáng)機(jī)體運(yùn)動(dòng)耐力和抗疲勞能力的紅景天。血糖含量降低是引起疲勞的主要原因，BUN 含量與運(yùn)動(dòng)耐量呈正相關(guān)，Lac 作為無(wú)氧狀態(tài)下碳水化合物糖酵解產(chǎn)物，其含量升高導(dǎo)致乳酸堆積，增加器官負(fù)荷[17]。山葵樹葉提取物通過(guò)上述機(jī)制有效延緩疲勞的發(fā)生。

糖原是運(yùn)動(dòng)過(guò)程中的重要燃料，運(yùn)動(dòng)過(guò)程中糖原的迅速消耗使其儲(chǔ)存受限，抑制機(jī)體運(yùn)動(dòng)耐力[18]。本研究表明：與游泳對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照組和山葵樹葉提取物低、中、高劑量組小鼠糖原含量升高；與陽(yáng)性對(duì)照組相比，中劑量組和高劑量組糖原含量提升，且高劑量組提升趨勢(shì)更顯著，提示運(yùn)動(dòng)消耗糖原，而山葵樹葉提取物補(bǔ)充促進(jìn)糖原的增加，揭示該提取物對(duì)維持糖原含量的積極作用，推測(cè)其機(jī)制與促進(jìn)脂肪分解代謝相關(guān)。同時(shí)，劇烈運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致氧自由基的過(guò)度生成，必然導(dǎo)致機(jī)體氧化應(yīng)激的發(fā)生。MDA 是脂質(zhì)氧化降解產(chǎn)物之一；SOD 是機(jī)體重要抗氧化酶，作為機(jī)體垃圾清道夫，可加速氧自由基清除；GSHPx 具有抗氧化功能，可有助于延緩疲勞[19-20]。本研究測(cè)定小鼠肝臟組織中MDA 含量以及T-SOD和GSH-Px 活性變化提示：MDA 含量的升高、糖原含量以及T-SOD 和GSH-Px 活性的降低導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)能力下降是產(chǎn)生機(jī)體疲勞的主要原因。氧自由基的大量生成及脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的增強(qiáng)均誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，增加神經(jīng)和心血管系統(tǒng)負(fù)荷，導(dǎo)致機(jī)體組織器官損傷風(fēng)險(xiǎn)增大。山葵樹葉提取物有助于提高游泳訓(xùn)練后T-SOD 和GSH-Px的活性，降低MDA 含量，且高劑量組改善程度更為顯著，發(fā)揮增強(qiáng)內(nèi)源性自由基清除功能，提高機(jī)體運(yùn)動(dòng)能力。該結(jié)果提示：山葵樹葉提取物的抗氧化能力與調(diào)節(jié)MDA 含量以及T-SOD 和GSHPx 活性有關(guān)，從而發(fā)揮清除氧自由基和代謝產(chǎn)物，進(jìn)而預(yù)防因運(yùn)動(dòng)而誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

4 結(jié)論

本研究證實(shí)山葵樹葉提取物有助于小鼠抗疲勞能力、運(yùn)動(dòng)耐力和能量代謝能力，其與維持Glu 和糖原含量、增加BUN 和Lac 去除速率、降低MDA 含量及促進(jìn)T-SOD 和GSH-Px 活性的提升密切相關(guān)，具有劑量依賴性。山葵樹葉提取物具有良好的抗疲勞和抗氧化功效，未來(lái)將進(jìn)一步對(duì)其安全性展開探討，以期為山葵樹葉提取相關(guān)植物制劑的成果轉(zhuǎn)化提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。