楊麒民，羅 濤，李春臣，劉 鑫，陳 衛(wèi)，陳 緣，郭 芮，張建武

川北醫(yī)學院，四川 南充637100

人參皂苷Rb1是人參二醇系皂苷，主要分布于五加科植物人參、三七、西洋參等植物中，具有多種藥理活性，是一種具有較高藥用價值的化學物質。人參、三七、西洋參都是傳統(tǒng)中藥，應用歷史悠久，人參主補五臟，能增強機體免疫力，抗休克、抗腫瘤，對肝臟疾病也有一定的治療作用［1-3］。隨著對人參主要活性成分Rb1的深入研究，醫(yī)學界對其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)及抗腫瘤、抗肝臟熱缺血再灌注等方面的研究非常廣泛［4］。裴娟慧等［5］發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rb1對大鼠心室肌細胞L-型鈣電流有明顯的抑制作用，而抑制L-型Ca2+通道是抗心律失常的重要機制，即對心肌收縮舒張具有影響。由于心肌與腸道平滑肌結構和功能上存在部分區(qū)別，且其對腸道平滑肌收縮活動的影響尚無報道，故此筆者進行了人參皂苷Rb1對正常狀態(tài)下家兔離體腸平滑肌自發(fā)性收縮活動影響的研究，為進一步開發(fā)利用人參皂苷Rb1藥用價值提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物中國白兔，體質健康，雌雄兼半，體質量（2.3±0.5）kg，由川北醫(yī)學院動物實驗中心提供，實驗動物許可證號：SYXK（川）2018-076。飼養(yǎng)條件：家兔飼養(yǎng)于23～26℃、濕度適宜的實驗室環(huán)境，12 h光照黑暗循環(huán)，實驗前動物自由飲水，但需禁食24 h。

1.2 試藥及試劑人參皂苷Rb1（成都曼斯特生物科技有限公司，批號：MUST-17060106）；釕紅（ruthenium red，RR，源葉生物科技有限公司，批號：11103-72-3）；肝素（heparin，HP，成都市科華化工試劑廠，批號：9041-08-1）；鹽酸維拉帕米注射液（Verapamil，V，上海禾豐制藥有限公司，批號：43161001，規(guī)格：2 mL∶5 mL/支）；新鮮的臺氏液（g/L）：川北醫(yī)學院機能實驗中心制劑（NaCl 40 g，10% KCl 1 g，CaCl21 g，NaHCO35 g，10%MgSO4·7H2O1.3 g，5%NaH2PO4·2H2O 0.325 g，C6H12O65.5 g RO水5000 mL）。

1.3 實驗儀器兔類通用實驗器械；BL-420型生物機能實驗系統(tǒng)（四川成都泰盟公司）；FT-100型生物張力傳感器（四川成都泰盟軟件有限公司）；HW-400E型恒溫平滑肌槽（四川成都泰盟科技有限公司）；優(yōu)普純水/超純水制造系統(tǒng)（四川優(yōu)普超純科技有限公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 人參皂苷Rb1溶液制備 預熱電子天平30 min后，準確稱量人參皂苷Rb1，加入臺氏液，定容至10～2 mol/L即成。

1.4.2 兔離體腸平滑肌標本的制備［6］取健康家兔，禁食24 h后，用木槌猛擊兔頭枕部致死。迅速沿腹中線打開腹腔，以胃幽門與十二指腸交界處為起點剪取腸管，每只兔取十二指腸同一腸段置于盛有室溫飽和臺氏液的燒杯中，洗凈腸內(nèi)容物，剪成1.5～2.0 cm的腸段作為實驗標本。

1.4.3 腸管舒縮活動的記錄 打開BL-420F生物機能實驗系統(tǒng)，調零，定標，在一通道輸入接口處安裝張力換能器。調節(jié)恒溫平滑肌槽，使水溫保持在（37±0.5）℃，將臺式液加入預管內(nèi)，藥物管加入16 mL臺式液。將標本一端固定于L-型通氣鉤上，另一端連接張力換能器，持續(xù)通入混合氣體（96%O2，4%CO2），每秒1～2個氣泡，溫度在37℃，標準負荷1 g，平衡1 h，待腸管穩(wěn)定后，開始進行實驗。

1.4.4 人參皂苷Rb1對兔離體腸平滑肌收縮的影響 待腸管收縮穩(wěn)定后，用BL-420生物機能實驗系統(tǒng)描記一段腸管正常收縮曲線，累積加入已配好的人參皂苷Rb1，使終濃度分別達到50、70、90 μmol/L，加藥間隔時間為5 min，同時設置一組空白組，于空白組中加入等量臺氏液進行實驗。觀察腸道運動曲線，用區(qū)間測量法記錄加藥前1 min和加藥后第5 min的腸道收縮數(shù)據(jù)（峰峰值、平均值、頻率）。

1.4.5 HP、RR和維拉帕米預處理腸管后對人參皂苷Rb1作用于腸管收縮活動的影響 待腸管收縮曲線穩(wěn)定后，隨機分成對照組、釕紅組、肝素組、維拉帕米組。分別加入肌漿網(wǎng)ryanodine受體阻斷劑釕紅（ruthenium red，RR）10 μmol/L，IP3受體阻斷劑肝素（heparin，HP）50 mg/L，L-型Ca2+通道拮抗劑維拉帕米（verapamil）0.1 μmol/L孵育15 min，同時設置一組對照組，用等量臺式液孵育15 min，當各組孵育后的平滑肌收縮達到平臺期后再累計加入人參皂苷Rb1，使終濃度分別達到50、70、90 μmol/L，加藥間隔為5 min，記錄加入人參皂苷Rb1后第5 min腸管收縮的平均收縮力的變化。

1.5 統(tǒng)計學方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件處理實驗數(shù)據(jù)，計量資料采用±s表示，采用t檢驗，計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兔離體小腸平滑肌的收縮活動在空白組中加入溶劑臺式液，對兔離體腸平滑肌的自發(fā)性收縮活動并無明顯的影響（P＞0.05）。人參皂苷Rb1在50～90 μmol/L濃度梯度內(nèi)能劑量依賴性的抑制兔離體小腸平滑肌的收縮（P＜0.05）。見圖1。

圖1 人參皂苷Rb1對兔小腸平滑肌收縮的影響

2.2 兔離體小腸平滑肌運動的收縮頻率、收縮張力、收縮振幅與給藥前比較，人參皂苷Rb1對腸管收縮的頻率無影響（P＞0.05）；較低濃度的人參皂苷Rb1（50 μmol/L）對腸管的收縮張力具有抑制作用，隨濃度增加，腸管的收縮張力明顯受到抑制（P＜0.01）；較低濃度的人參皂苷Rb1（50 μmol/L）對腸管的收縮幅度具有抑制作用，隨濃度的增加，腸管的收縮幅度明顯受到抑制（P＜0.01）。見表1。

表1 不同劑量人參皂苷Rb1對兔離體小腸平滑肌的收縮頻率、收縮張力、收縮振幅的影響（±s）

表1 不同劑量人參皂苷Rb1對兔離體小腸平滑肌的收縮頻率、收縮張力、收縮振幅的影響（±s）

注：與給藥前（人參皂苷Rb10 μmol/L）比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01

?

2.3 HP、RR和維拉帕米預處理腸管后對人參皂苷Rb1作用于離體腸管活動的影響與對照組比較，在釕紅組中，用ryanodine受體阻斷劑RR預孵后，離體小腸平滑肌的收縮未有明顯的變化（P＞0.05），再累積加入人參皂苷Rb1，在低濃度時離體腸平滑肌的收縮受到抑制的程度增強（P＜0.05），隨著人參皂苷Rb1的濃度增加，離體腸平滑肌的收縮受到抑制的程度增強更為明顯（P＜0.01），表明人參皂苷Rb1對離體腸平滑肌收縮的抑制作用可能與抑制ryanodine受體有關。2）與對照組比較，在肝素組中，用IP3受體阻斷劑HP預孵后，離體腸平滑肌的收縮未有明顯的變化（P＞0.05），再累積加入人參皂苷Rb1，濃度達到70 μmol/L時，離體小腸平滑肌的收縮受到抑制的程度增強（P＜0.05），表明人參皂苷Rb1對離體腸平滑肌收縮的抑制作用可能與抑制IP3受體有關。3）與對照組比較，在維拉帕米組中，用L-型Ca2+通道拮抗劑維拉帕米預孵后，離體腸平滑肌的收縮未有明顯的變化（P＞0.05），再累積加入人參皂苷Rb1，離體腸平滑肌的收縮受到抑制的程度明顯增強（P＜0.01），表明人參皂苷Rb1對離體腸平滑肌收縮的抑制作用可能與阻斷L-型Ca2+通道有關。見表2。

表2 釕紅、肝素、維拉帕米預處理后人參皂苷Rb1對兔離體小腸平滑肌活動的影響（±s）

表2 釕紅、肝素、維拉帕米預處理后人參皂苷Rb1對兔離體小腸平滑肌活動的影響（±s）

注：與給藥前（人參皂苷Rb10 μmol/L）比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01

?

3 討論

腹痛、腹瀉等胃腸道疾病通常是由胃腸平滑肌痙攣引起的。腸平滑肌細胞內(nèi)Ca2+是腸平滑肌收縮的偶聯(lián)因子，與腸平滑肌興奮-收縮偶聯(lián)存在著緊密的關系，細胞外Ca2+進入細胞平滑肌細胞內(nèi)和細胞內(nèi)Ca2+肌質網(wǎng)內(nèi)Ca2+釋放是細胞內(nèi)Ca2+升高的主要途徑［7］，當胞內(nèi)Ca2+濃度達到一定水平時，與肌鈣蛋白或肌調蛋白結合，觸發(fā)平滑肌收縮［8］。通過實驗結果發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rb1能夠濃度依賴性的抑制腸平滑肌的自發(fā)性收縮，針對人參皂苷Rb1所具有的腸平滑肌的舒張作用，對其與外Ca2+進入的通道和內(nèi)Ca2+釋放的相關受體的影響進行了初步的探究。

細胞內(nèi)Ca2+的釋放主要來自于肌漿網(wǎng)，而肌漿網(wǎng)內(nèi)釋放的Ca2+主要通過IP3和ryanodine受體來完成。當這些受體被激活后，可引起肌漿網(wǎng)內(nèi)鈣離子的釋放，從而導致細胞內(nèi)鈣離子濃度增加，誘導平滑肌收縮［9-11］。本實驗通過用ryanodine受體阻斷劑RR和IP3受體阻斷劑HP對腸管進行預處理，來探究人參皂苷Rb1對細胞內(nèi)Ca2+的釋放的相關受體的影響。ryanodine受體是存在于肌細胞肌質網(wǎng)和其他細胞內(nèi)質網(wǎng)的胞內(nèi)鈣釋放通道之一，Ca2+集合后激活RyR1使通道在開放和關閉狀態(tài)隨機轉換；進一步集合咖啡因則可將通道保持在開放狀態(tài)。ryanodine結合于孔道側壁，低濃度時可將通道鎖定在亞電導狀態(tài)（有部分離子流通過），高濃度則阻斷離子的通過［12］。實驗結果表明，使用RR預處理腸管后，再加入人參皂苷Rb1后，小腸平滑肌的收縮抑制程度明顯加強，由此推斷人參皂苷Rb1通過抑制ryanodine受體途徑，使得細胞內(nèi)Ca2+釋放減少，從而抑制腸平滑肌的收縮。HP可作用于三磷酸肌醇受體（inositol triphosphate receptor，IP3R），IP3R是廣泛存在于各種細胞內(nèi)質網(wǎng)的一種鈣釋放通道家族，當IP3R與1，4，5三磷酸肌醇和鈣離子兩種底物分子結合后，IP3R開放，Ca2+便從內(nèi)質網(wǎng)鈣庫釋放到細胞質中［13］。實驗結果表明，使用HP預處理腸管，再加入人參皂苷Rb1后，小腸平滑肌的收縮抑制程度明顯加強，由此推斷人參皂苷Rb1通過抑制IP3受體途徑，引起細胞內(nèi)Ca2+釋放減少，從而抑制腸平滑肌的收縮。

細胞外的Ca2+主要是通過細胞膜上的Ca2+通道進入細胞內(nèi)，腸平滑肌中主要的鈣通道是L型電壓依賴性Ca2+通道［14］。維拉帕米是L-型Ca2+通道拮抗劑，作用機制是阻滯外源性Ca2+經(jīng)L-型鈣離子通道進入細胞內(nèi)，降低胞內(nèi)的Ca2+濃度，而Ca2+是細胞內(nèi)重要的第二信使，高濃度的Ca2+可引起平滑肌收縮，低濃度Ca2+可引起平滑肌舒張［15］。本實驗通過用維拉帕米對腸管進行預處理，來探究人參皂苷Rb1對細胞外Ca2+的進入的相關通道的影響。實驗結果表明，使用維拉帕米處理腸管后，再加入人參皂苷Rb1后，小腸平滑肌的收縮抑制程度明顯加強，由此推斷人參皂苷Rb1阻斷L-型Ca2+通道，使進入細胞內(nèi)Ca2+減少，從而抑制腸平滑肌的收縮。

綜上所述，人參皂苷Rb1可顯著抑制兔離體腸平滑肌自發(fā)性收縮，其機制可能是阻斷L-型Ca2+通道抑制外鈣內(nèi)流，或阻斷ryanodine受體和IP3受體抑制內(nèi)鈣釋放，最終使細胞內(nèi)鈣離子濃度降低，從而抑制腸平滑肌的收縮。本實驗為人參皂苷Rb1應用于胃腸功能紊亂性疾病的治療提供了實驗依據(jù)。