喻 涓，范 艷，楊榆青，何 丹，宋 波，姚 政△

1云南師范大學(xué)醫(yī)院，云南 昆明650500；2云南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；3昆明醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院

隨著人們飲食結(jié)構(gòu)的變化，非酒精性脂肪肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）發(fā)病率逐年升高［1］。NAFLD疾病譜較廣，包括單純性NAFLD、非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic fatty hepatitis，NASH）、非酒精性肝纖維化、肝硬化等，主要病理特征為肝臟脂肪蓄積和肝細(xì)胞實(shí)質(zhì)脂肪變性［2］。有研究顯示，NAFLD已經(jīng)成為世界各國最常見的慢性肝病，甚至也成為肝纖維化和肝硬化的主要病因［3］。對(duì)于本病，臨床中并沒有特效藥，因此開發(fā)新的藥物對(duì)于本病意義重大。金釵石斛是我國經(jīng)典名貴中藥材之一［3］，相關(guān)研究［4-5］表明，金釵石斛多糖是金釵石斛主要的有效藥理成分之一，其在抗腫瘤、促進(jìn)免疫反應(yīng)、抗氧化以及消炎方面均具有很好的效果。目前金釵石斛多糖對(duì)NAFLD的作用尚無文獻(xiàn)報(bào)道，為此本研究采用高脂高糖飲食構(gòu)建NAFLD大鼠模型，觀察其對(duì)肝功能、炎性因子的影響，并從TLR4和HO-1蛋白分析和探討其可能的作用機(jī)制，為金釵石斛多糖的開發(fā)和NAFLD的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康雄性清潔級(jí)SD大鼠72只，體質(zhì)量160～180 g，購于昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK-（云）2011-004，大鼠購買后飼養(yǎng)于云南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)房，由專業(yè)人員統(tǒng)一飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)室溫度、濕度及光照時(shí)間按照標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一設(shè)定。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器PT-3502型酶標(biāo)儀（北京普天新橋技術(shù)有限公司）；752N型分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；XSP-9CA型光學(xué)顯微鏡（上海光學(xué)儀器廠）；EMUC7型石蠟切片機(jī)（德國徠卡）；PPDT-12C1型梯度脫水機(jī)（湖北徠克醫(yī)療儀器有限公司）；Mini-PROTEAN Tetra型蛋白電泳儀（美國伯樂）；StepOne TM型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）。

1.3 藥物及試劑普通飼料、高脂飼料［昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：蘇飼證（2018）10030］；金釵石斛多糖（濃度98%，上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，批號(hào)：180615）；多烯磷脂酰膽堿膠囊［賽諾菲（北京）制藥有限公司，批號(hào)：180726］；多聚甲醛（淄博齊星化學(xué)科技有限公司，批號(hào)：180707）；天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：180822）；血清白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6，批號(hào)：180911）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）（武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)：180706）；BCA蛋白定量試劑盒（上海澤葉生物科技有限公司，批號(hào)：181009）；Toll樣受體4（Toll-like receptors-4，TLR4）、血紅素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1）［賽信通（上海）生物試劑有限公司，批號(hào)：181115、181205］；引物（上海生物生工）。

1.4 分組及造模1）所有大鼠購買后按照隨機(jī)數(shù)字法分為正常組，模型組，多烯磷脂酰膽堿組，金釵石斛多糖高、中、低劑量組，每組12只，分組后適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后給予相應(yīng)飼料造模。除正常組外，其余各組給予高脂飼料喂養(yǎng)制備NAFLD大鼠模型，8周后每組各取2只檢驗(yàn)造模是否成功，造模成功標(biāo)準(zhǔn)為大鼠肝臟切片HE染色有明顯脂肪顆粒浸潤，同時(shí)血清肝功能AST和ALT明顯升高。2）正常組和模型組給予2 mL生理鹽水灌胃，多烯磷脂酰膽堿組給予23 mg/（kg·d）多烯磷脂酰膽堿灌胃，灌胃時(shí)將其溶于2 mL的生理鹽水中，金釵石斛多糖低、中和高劑量組分別給予金釵石斛多糖50、100、200 mg/（kg·d）灌胃，灌胃時(shí)將其溶于2 mL的生理鹽水中，灌胃4周后處死大鼠，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.5 觀察指標(biāo)大鼠于處死前夜禁食不禁水12 h，然后采用3%的戊巴比妥溶液8 mL腹腔注射麻醉，麻醉后將其固定于解剖版，采用腹主動(dòng)脈取血法收集血液，血液收集后于4℃、離心半徑6 cm，4000 r/min離心10 min，收集血清，將其置入超低溫冰箱中用于相關(guān)生化指標(biāo)的檢測(cè)，完成后取出肝臟，切取肝臟組織約2 mm3，置入4%的多聚甲醛溶液中用于組織病理學(xué)檢測(cè)，其余組織置入超低溫冰箱中，用于TLR4和HO-1蛋白和mRNA的檢測(cè)。

1.5.1 一般情況 于每次喂食和喂水前觀察并記錄大鼠活動(dòng)狀況，同時(shí)統(tǒng)計(jì)飲食量，觀察毛色和精神狀態(tài)。

1.5.2 肝功能及炎性因子指標(biāo) 血清ALT和AST的測(cè)定嚴(yán)格按照試劑盒提供的說明書進(jìn)行，采用分光光度計(jì)測(cè)定。血清IL-6和TNF-α的測(cè)定嚴(yán)格按照試劑盒提供的說明書進(jìn)行，采用酶標(biāo)儀測(cè)定。

1.5.3 組織病理學(xué)觀察 肝臟組織病理學(xué)檢測(cè)采用HE染色法，從浸泡24 h的多聚甲醛溶液中取出肝臟組織，自來水反復(fù)沖洗24 h后，梯度酒精脫水，二甲苯透明，完成后石蠟包埋，切片機(jī)切成3～5 μm厚薄片，脫蠟后依次經(jīng)蘇木精和伊紅染色，最后中性樹膠封片即完成。

1.5.4 采用Western blot測(cè)定大鼠蛋白表達(dá) 稱取1 g肝臟組織，用組織裂解液充分裂解后取上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度后調(diào)平，然后每組各取50 μg行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳完成后，半干轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移到PVDF膜，脫脂牛奶封閉后洗滌，加入一抗［TLR4（1∶2000），HO-1（1∶1000），β-actin（1：5000）］孵育后洗滌，加入二抗（1∶5000）孵育并洗滌，暗室曝光進(jìn)行洗片和定影，結(jié)果以目的蛋白與β-actin積分光密度值比值表示，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5.5 采用QT-PCR檢測(cè)肝組織TLR4和HO-1 mRNA表達(dá) 采用總RNA試劑盒提取總RNA后，將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，每組取2 μg行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增條件為95℃2 min、94℃10 s、60℃10 s、72℃40 s，循環(huán)次數(shù)36次。分析方法選用2-ΔΔCt法，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示，經(jīng)檢驗(yàn)所有數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，多組間比較采用F檢驗(yàn)，組間比較采用q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況各組大鼠均未死亡，此外正常組精神飽滿，活潑好動(dòng)，毛色光滑，大小便正常；模型組大鼠出現(xiàn)明顯精神萎靡、活動(dòng)量降低、毛色發(fā)黃灰暗及尿液發(fā)臭，相較于模型組，多烯磷脂酰膽堿組和金釵石斛多糖各組精神狀態(tài)有一定好轉(zhuǎn)，活動(dòng)量增加，毛色較光澤。

2.2 肝功能及炎癥因子水平與正常組比較，模型組大鼠AST、ALT、IL-6、TNF-α水平均明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，多烯磷脂酰膽堿組和金釵石斛多糖各劑量組上述指標(biāo)均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；金釵石斛多糖各劑量組AST、ALT水平與多烯磷脂酰膽堿組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；金釵石斛多糖中、高劑量組IL-6和TNF-α水平明顯低于多烯磷脂酰膽堿組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠肝功能指標(biāo)及炎癥因子水平比較（±s）

表2 各組大鼠肝功能指標(biāo)及炎癥因子水平比較（±s）

注：*表示與正常組比較，P＜0.05；#表示與模型組比較，P＜0.05；△表示與多烯磷脂酰膽堿組比較，P＜0.05

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2.3 大鼠肝臟HE染色觀察正常組大鼠肝臟組織細(xì)胞核大小均一，形態(tài)正常，無纖維和組織增生；模型組大鼠則出現(xiàn)明顯被脂肪空泡，肝小葉明顯破壞，同時(shí)細(xì)胞排列紊亂，有一定程度炎癥浸潤，與模型組相比，多烯磷脂酰膽堿組和金釵石斛多糖各劑量組脂肪浸潤程度明顯降低，炎性浸潤降低，肝臟整體外觀明顯改善。其中金釵石斛多糖各劑量組肝組織病理改善最為明顯，脂肪顆粒顯著減少，且肝小葉清晰，改善程度呈現(xiàn)明顯劑量依賴性。見圖1。

圖1 各組大鼠肝臟組織切片（HE×400）

2.4 TLR4和HO-1蛋白及mRNA表達(dá)與正常組比較，模型組肝臟組織中TLR4和HO-1蛋白及mRNA表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，多烯磷脂酰膽堿組和金釵石斛多糖各劑量組TLR4和HO-1蛋白及mRNA表達(dá)均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；金釵石斛多糖中、高劑量組TLR4和HO-1蛋白及mRNA表達(dá)明顯低于多烯磷脂酰膽堿組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2、表3。

圖2 各組大鼠肝臟組織TLR4和HO-1蛋白表達(dá)

表3 各組大鼠肝臟組織中TLR4和HO-1蛋白及mRNA的相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表3 各組大鼠肝臟組織中TLR4和HO-1蛋白及mRNA的相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

注：*表示與正常組比較，P＜0.05；#表示與模型組比較，P＜0.05；△表示與多烯磷脂酰膽堿組比較，P＜0.05

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3 討論

目前文獻(xiàn)［6-11］中報(bào)道較多單純高脂和膽堿-蛋氨酸缺乏飲食誘導(dǎo)的NAFLD模型。單純高脂高糖飲食可以模擬出胰島素抵抗型動(dòng)物模型，膽堿-蛋氨酸缺乏飲食則可以誘導(dǎo)脂肪肝同時(shí)并發(fā)膽囊損壞模型。本研究根據(jù)藥物特點(diǎn)，選用了高脂高糖飲食誘導(dǎo)型，本模型目前在造模方法上已經(jīng)完全成熟，此外價(jià)格相對(duì)便宜。由于金釵石斛多糖具有一定的降血糖效果［12］，以此動(dòng)物模型來驗(yàn)證藥物效果具有針對(duì)性。

近年來，關(guān)于金釵石斛多糖藥理學(xué)研究受到越來越多學(xué)者的關(guān)注，如國內(nèi)賓捷等［13］研究發(fā)現(xiàn)金釵石斛在提高衰老小鼠機(jī)體的抗氧化能力方面具有很好的效果，可抑制血清中NDA的升高，同時(shí)增加抗氧化因子SOD和GSH的活性。此外關(guān)于金釵石斛多糖的抗癌、消炎作用有文獻(xiàn)報(bào)道［14-15］，國內(nèi)學(xué)者［16］采用金釵石斛多糖治療高脂血癥的Wistar大鼠研究結(jié)果表明，金釵石斛多糖可明顯降低血清總膽固醇和甘油三酯水平。

ALT和AST是重要的肝功能評(píng)價(jià)指標(biāo)，其中ALT主要存在于肝臟、心肌和骨骼肌。ALT能夠準(zhǔn)確反映肝細(xì)胞的損傷程度，此外ALT的升高多見于肝臟的急性損傷。AST則主要在心肌、肝及腎組織線粒體中，AST主要對(duì)應(yīng)的為肝細(xì)胞的慢性損傷［17-18］。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給予NAFLD大鼠金釵石斛多糖治療，大鼠肝功能指標(biāo)AST和ALT相較于模型組明顯降低，這證實(shí)金釵石斛多糖對(duì)NAFLD大鼠肝功能具有調(diào)節(jié)作用。在NAFLD大鼠肝功能損傷過程中TLR信號(hào)通路和HO-1信號(hào)通路參與了其炎癥反應(yīng)的進(jìn)程［19］，其中TLR屬于模式識(shí)別受體，在進(jìn)化中具有高速保守性，目前研究發(fā)現(xiàn)TLR家族主要有12個(gè)重要成員，研究最多的為TLR4，TLR4信號(hào)通路主要介導(dǎo)肝損傷過程中IL-6、TNF-α的應(yīng)答。在炎癥反應(yīng)的過程中HO家族蛋白和TLR家族蛋白相互作用，共同促進(jìn)疾病的發(fā)生和進(jìn)展，HO家族相關(guān)蛋白是身體內(nèi)重要的應(yīng)激反應(yīng)蛋白的一種，其也是一種起始酶和限速酶，可有效的催化血紅素降解過程，在NAFLD發(fā)生后，機(jī)體處于低氧狀態(tài)，同時(shí)有部分內(nèi)毒素刺激，可造成HO-1分泌的增加，HO-1分泌的增加可降低組織炎癥反應(yīng)，進(jìn)而對(duì)肝細(xì)胞起到保護(hù)作用。本次研究結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組TLR4和HO-1蛋白及mRNA表達(dá)明顯升高，同時(shí)TLR4調(diào)控的下游炎性因子IL-6和TNF-α也明顯升高，這提示在NAFLD發(fā)生和發(fā)展過程中，炎癥反應(yīng)可隨著NAFLD的發(fā)生而升高，采用金釵石斛多糖治療后，大鼠肝臟中正常組大鼠TLR4和HO-1蛋白及mRNA、IL-6和TNF-α均明顯降低，這提示金釵石斛多糖對(duì)NAFLD大鼠炎癥反應(yīng)具有改善作用。

綜上所述，金釵石斛多糖可明顯改善受損的NAFLD肝臟，改善肝功能，這與金釵石斛多糖可下調(diào)HO-1和TLR4表達(dá)，進(jìn)而降低炎癥反應(yīng)刺激有關(guān)。