龍遠(yuǎn)雄，歐陽(yáng)林旗，房 赤，彭 俊，王勝玫，陳 鎮(zhèn)，陳新宇，鄧桂明

湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙410007

新型冠狀病毒肺炎新型冠狀病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019，COVID-19）（簡(jiǎn)稱新冠肺炎）［1］是一種經(jīng)呼吸道傳播的新型傳染病，目前臨床上尚未發(fā)現(xiàn)特效治療藥物。中醫(yī)將其歸屬為“疫病”范疇［2］，國(guó)醫(yī)大師熊繼柏認(rèn)為此次新冠肺炎屬于溫?zé)釢岫局O氣引起的疫病，并將病程分為輕癥期、重癥期、危重期、恢復(fù)期，在其牽頭制定的《湖南省新型冠狀病毒感染的肺炎中醫(yī)藥診療方案（試行）第三版》中，推薦使用桑貝止嗽散、桑菊飲、銀翹散、霍樸夏苓湯方劑治療新冠肺炎不同時(shí)期患者。其中桑貝止嗽散主要用于初熱期咳嗽微喘型患者的治療，組方為桑貝散合止嗽散，藥物組成：桑白皮、浙貝母、百部、紫菀、白前、桔梗、荊芥、陳皮、苦杏仁、甘草，本方中百部、紫菀為原止嗽散兩味君藥，桑白皮、浙貝母為桑貝散的核心藥對(duì)［3-5］。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法篩選桑貝止嗽散中4味核心藥物的有效成分，運(yùn)用TCMSP、GeneCards等數(shù)據(jù)庫(kù)收集其治療新冠肺炎的相關(guān)靶點(diǎn)，構(gòu)建“活性成分-靶點(diǎn)”和蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，分析其作用功能通路，為進(jìn)一步開(kāi)展桑貝止嗽散藥理機(jī)理和臨床推廣提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 桑貝止嗽散核心藥物活性化合物提取篩選本研究通過(guò)中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)平臺(tái)檢索桑白皮、浙貝母、百部、紫菀四味核心藥物的化學(xué)成分，并以口服吸收利用度（OB）≥30%，藥物相似性（DL）≥0.18為篩選條件，提取各味中藥的主要活性化合物。

1.2 桑貝止嗽散核心藥物治療新型冠狀病毒肺炎靶點(diǎn)預(yù)測(cè)利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)通過(guò)化合物MOL-ID編號(hào)檢索其作用靶標(biāo)，并通過(guò)Uniport數(shù)據(jù)庫(kù)檢索各靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的基因名；基于GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)，以“viral pneumonia”為關(guān)鍵詞檢索與新型冠狀病毒肺炎相關(guān)的基因，并與藥物活性化合物靶點(diǎn)取交集，得到桑貝止嗽散核心藥物治療新冠肺炎的作用靶點(diǎn)。

1.3 “活性化合物-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析將

桑貝止嗽散核心藥物活性化合物及其作用于新冠肺炎的相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape3.7.1軟件中，并利用“Network Analyzer”功能對(duì)中藥化學(xué)成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析。根據(jù)化合物與靶點(diǎn)連接情況篩選出桑貝止嗽散核心藥物對(duì)作用于新冠肺炎的關(guān)鍵化合物。

1.4 蛋白互作（protein protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STING數(shù)據(jù)庫(kù)中，限定研究物種為人類，得到桑貝止嗽散核心藥物作用于新冠肺炎的PPI網(wǎng)絡(luò)。借助Cytoscape軟件對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，選取度（Degree），介數(shù)（betweenness）和中心性（closeness）都大于平均值的靶點(diǎn)為關(guān)鍵靶點(diǎn)。度（degree）值為某節(jié)點(diǎn)直接相連的節(jié)點(diǎn)數(shù)，值越大，說(shuō)明與其發(fā)生關(guān)聯(lián)的節(jié)點(diǎn)越多，該節(jié)點(diǎn)越重要；介度（betweenness）指的是圖中有路徑相連的兩個(gè)節(jié)點(diǎn)這樣的邊中有多少條邊經(jīng)過(guò)本節(jié)點(diǎn)；中心性（closeness）計(jì)算的是節(jié)點(diǎn)處于圖中間位置的程度。這三個(gè)值共同決定某節(jié)點(diǎn)關(guān)鍵程度，值越大，越關(guān)鍵。

1.5 靶點(diǎn)GO功能分析KEGG通路分析為進(jìn)一步了解核心靶點(diǎn)基因功能和桑貝止嗽散核心藥物治療新冠肺炎的主要作用通路，將藥物與疾病相關(guān)靶點(diǎn)輸入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)，選定物種為“homo sapiens”，設(shè)定閾值P＜0.05進(jìn)行GO和KEGG分析，用R語(yǔ)言進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 桑貝止嗽散核心藥物主要活性化合物及對(duì)應(yīng)靶標(biāo)本研究通過(guò)TCMSP平臺(tái)檢索桑貝止嗽散4味君藥包含的主要化合物，依據(jù)OB≥30%，DL≥0.18共篩選出主要活性化合物82個(gè)，其中桑白皮24個(gè)、浙貝母7個(gè)、百部32個(gè)、紫菀19個(gè)。去掉重復(fù)值后共78個(gè)活性化合物，再通過(guò)各化合物molecule-ID尋找對(duì)相應(yīng)的靶點(diǎn)，得到各藥物靶點(diǎn)總數(shù)997個(gè)，去重后靶點(diǎn)數(shù)148個(gè)靶點(diǎn)。

2.2 桑貝止嗽散核心藥物治療新型冠狀病毒肺炎疾病靶點(diǎn)預(yù)測(cè)在Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)中以“viral pneumonia”作為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，得到與新型冠狀病毒肺炎相關(guān)的基因，將篩選得到的藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)進(jìn)行映射，獲得桑貝止嗽散核心藥物治療新冠肺炎的潛在作用靶點(diǎn)。通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)收集整理得到的新冠肺炎疾病相關(guān)基因共有3473個(gè)，通過(guò)與桑貝止嗽散核心藥物活性化合物的潛在靶標(biāo)取交集分析后，共發(fā)現(xiàn)87個(gè)桑貝止嗽散核心藥物靶點(diǎn)與新冠肺炎疾病相關(guān)，交集靶點(diǎn)見(jiàn)表1。

表1 桑貝止嗽散治療新型冠狀病毒肺炎疾病靶點(diǎn)

2.3 活性化合物-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析在桑貝止嗽散4味核心藥物78個(gè)有效化合物中作用的靶點(diǎn)中，通過(guò)與GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中3473個(gè)新冠肺炎相關(guān)靶基因進(jìn)行比對(duì)，其中交集基因數(shù)87個(gè)，對(duì)應(yīng)有效化合物68個(gè)，借助軟件Cytocsape 3.7.1構(gòu)建中藥化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖1。圖1中，紅色矩形代表有效成分節(jié)點(diǎn)，綠色菱形代表靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)，形狀越大，表示度（degree）越大。

圖1 中1度（degree）≥20的化合物共8個(gè)，度數(shù)最高的化合物為quercetin，其次為kaempferol、luteolin、beta-sitosterol、Stigmasterol、7-methoxy-3-methyl-2，5-dihydroxy-9，10-dihydrophenanthrene、formononetin、isorhamnetin，這些度值較高的化合物可能是桑貝止嗽散核心藥物治療新冠肺炎的關(guān)鍵化合物。見(jiàn)表2。

表2 桑貝止嗽散核心治療藥物與新冠肺炎關(guān)鍵化合物（Degree≥20）

圖1 有效化合物-作用靶點(diǎn)圖

2.4 蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選將藥物-疾病交集靶點(diǎn)（87個(gè)）Cytoscape軟件進(jìn)行拓?fù)浞治?，選取自由度（Degree），介數(shù)（Betweenness）和中心性（Closeness）都大于平均值的靶點(diǎn)為關(guān)鍵靶點(diǎn)。網(wǎng)絡(luò)中各節(jié)點(diǎn)的平均自由度為18.96，平均介數(shù)為88.51，平均中心度數(shù)為0.51，自由度、介數(shù)、中心度數(shù)均超過(guò)平均值的靶點(diǎn)有17個(gè)，見(jiàn)表3。推測(cè)這些靶點(diǎn)可能是桑貝止嗽散治療新冠肺炎的關(guān)鍵靶。同時(shí)將結(jié)果導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行蛋白相互作用（PPI）分析，限定研究物種為“人”，得到桑貝止嗽散核心藥物用于新冠肺炎的PPI網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖2。

表3 桑貝止嗽散核心藥物治療新型冠狀病毒肺炎疾病的關(guān)鍵靶點(diǎn)

圖2 PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 GO功能富集分析將藥物-疾病交集基因?qū)隓AVID6.8數(shù)據(jù)庫(kù)，輸入靶基因名稱列表，限定物種為“Homo Sapiens”，設(shè)定閾值P＜0.05，進(jìn)行GO功能分析和基于KEGG通路富集分析。結(jié)果顯示87個(gè)基因共影響110個(gè)生物學(xué)過(guò)程（其中生物進(jìn)程BP 67個(gè)，細(xì)胞組分過(guò)程CC17個(gè)，分子功能過(guò)程MF26個(gè)），富集顯著程度排名前15的生物過(guò)程見(jiàn)表4，表中PValue值越小，表示富集程度越顯著，用R軟件進(jìn)行可視化展示，見(jiàn)圖3。

表4 靶點(diǎn)GO分析結(jié)果（部分）

圖3 靶點(diǎn)GO富集分析柱狀圖

2.6 KEEG通路分析87個(gè)交集靶點(diǎn)基因富集于14條通路上（P＜0.05，F(xiàn)DR＜0.05），其中有5條通路新型冠狀病毒肺炎密切相關(guān)，見(jiàn)表5。主要包括PI3K-Akt信號(hào)通路，鈣離子信號(hào)通路，T細(xì)胞受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，TNF信號(hào)通路，VEGF信號(hào)通路，提示桑貝止嗽散核心藥物可能通過(guò)作用以上多條通路來(lái)發(fā)揮治療（初熱期咳嗽微喘型）新冠肺炎作用機(jī)制。

表5 靶點(diǎn)KEGG分析結(jié)果

3 討論

新冠肺炎因其傳染性強(qiáng)、傳播迅速，歸屬于中醫(yī)“疫病”范疇，患者為感受疫癘之氣，病位在肺，病性特點(diǎn)為“濕熱濁毒”，事實(shí)證明中醫(yī)藥對(duì)其有較好的治療效果［6］。桑貝止嗽散作為宣肺止咳的良藥，被《湖南省新型冠狀病毒感染的肺炎中醫(yī)藥中醫(yī)藥診療方案（試行第三版）》推薦使用，主要治療新冠肺炎發(fā)熱初期咳嗽微喘型患者。該方主要由止嗽散和桑貝散組成，方中桑白皮和貝母具有平喘功效，紫菀、百部可止咳化痰，諸藥相配，共奏止嗽化痰，宣肺平喘之功［5］。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)原理共篩選桑貝止嗽散中4味核心藥物（桑白皮、紫菀、浙貝母、百部）活性化合物78個(gè)，作用靶點(diǎn)148個(gè)，其中作用于新冠肺炎的有效化合物68個(gè)、靶點(diǎn)87個(gè)，說(shuō)明桑貝止嗽散治療新冠肺炎具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。通過(guò)“活性化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，篩選出Degree≥20的關(guān)鍵活性化合物8個(gè)。度值最大的為槲皮素，槲皮素本身具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗病毒等藥理作用，能有效改善肺損傷情況，同時(shí)也能降低TGF-β1、TNF-α和α-SMA活性、抑制細(xì)胞凋亡及降低細(xì)胞炎癥因子釋放，從而抑制細(xì)胞凋亡降低炎癥水平［7-8］；山奈酚是MHF的主要活性成分，與槲皮素能夠與2019-nCoV3CL水解酶、ACE2完成較好的對(duì)接，從而起到治療的效果［9］；木犀草素是一種黃酮類化合物，臨床主要用于消炎止咳、祛痰平喘等，具有消炎、抗腫瘤、抗病毒等多種藥理作用，能通過(guò)免疫調(diào)節(jié)抑制大腸埃希菌（導(dǎo)致肺炎的常見(jiàn)菌株）對(duì)呼吸道上皮細(xì)胞的感染［10-11］；β-谷甾醇和豆甾醇是常見(jiàn)的植物甾醇，兩者均具有抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤和調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用［12］；芒柄花素是一種能治療肺炎、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的活性成分，可以通過(guò)結(jié)合人體ACE2受體阻斷病毒的入侵，具有潛在抗SARSCoV-2活性［13］；7-甲氧基-3-甲基-2，5-二羥基-9，10-二氫菲能夠作用于ADRB2、AR、CCNA2等23個(gè)與新冠肺炎相關(guān)的靶標(biāo)，從而達(dá)到治療目的；異鼠李堿能夠通過(guò)MAPK和NF-KB的信號(hào)通路對(duì)LPS誘發(fā)的急性肺損傷起保護(hù)性的作用［14-15］。

蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)中篩選后，Degree＞40的靶點(diǎn)有9個(gè)：腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、血 管 內(nèi) 皮 生 長(zhǎng) 因 子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、細(xì)胞腫瘤抗原（tumor protein p53，TP53）、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、JUN激酶（Jun kinase，JUN）、前列素內(nèi)環(huán)氧化物合成酶2（prostaglandin endoperoxide synthase2，PTGS2）、絲裂原活化蛋白激酶8（recombinant mitogen activated protein kinase 8，MAPK8）、表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）。TNF在維持細(xì)胞、組織和生物體內(nèi)的穩(wěn)態(tài)方面起著重要作用，參與機(jī)體炎癥反應(yīng)與免疫反應(yīng)，可以調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)［16］。VEGFA具有改善血管通透性、促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂的作用。有研宄表明VEGFA基因與肺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)具有相關(guān)性［17］。TP53是一種抑癌基因，其關(guān)鍵功能是修復(fù)DNA損傷，在調(diào)控細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡和維持基因組穩(wěn)定的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，與非小細(xì)胞肺癌密切相關(guān)［18］。EGF能促進(jìn)多種組織的表皮細(xì)胞增殖、分化和修復(fù)，對(duì)促進(jìn)高血壓和肺血管病變的發(fā)生、發(fā)展發(fā)揮重要作用。JUN能夠促使MAPK（蛋白激酶）發(fā)生信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，調(diào)節(jié)特定的基因表達(dá)，參與細(xì)胞凋亡，對(duì)急性炎癥反應(yīng)具有調(diào)節(jié)作用［19］。研究表明，PTGS2在影響RNA病毒的復(fù)制以及在治療肺炎的過(guò)程中起關(guān)鍵作用。MAPK1和MAPK8屬M(fèi)APK家族，MAPK的通路亞家族包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK1/2）和p38等，它們參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡和炎癥。表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）信號(hào)傳導(dǎo)的肺損傷會(huì)引起肺纖維化，而抑制EGFR信號(hào)反應(yīng)可以防止SARS及其他呼吸道病毒感染肺部纖維化的反應(yīng)，EGFR突變是非小細(xì)胞肺癌患者最常見(jiàn)的靶基因異常［18］。

GO功能富集分析結(jié)果表明，桑貝止嗽散作用于新冠肺炎的生物過(guò)程主要涉及蛋白表達(dá)、信號(hào)通路傳導(dǎo)、炎癥反應(yīng)等110個(gè)，其中脂多糖介導(dǎo)的信號(hào)通路、細(xì)胞外間隙、蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、缺氧反應(yīng)、基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控、血紅素結(jié)合等生物過(guò)程在治療新冠肺炎中可能發(fā)揮關(guān)鍵作用。KEGG通路分析結(jié)果顯示，桑貝止嗽散治療新冠肺炎的潛在作用靶點(diǎn)主要涉及PI3K-Akt信號(hào)通路，鈣離子信號(hào)通路，多巴胺能突觸等6條，涵蓋病毒、免疫調(diào)節(jié)、炎癥等各個(gè)方面，通路上富集靶點(diǎn)越多，發(fā)揮的作用可能越大。本研究中PI3K-Akt信號(hào)通路富集靶點(diǎn)數(shù)最多，說(shuō)明其作用最為關(guān)鍵，PI3K-Akt信號(hào)通路參與增殖、分化、凋亡和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)等多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)，已有研究表明PI3K信號(hào)通路在調(diào)控重癥肺Treg/Th17平衡中的能發(fā)揮重要作用［20-22］；其次富集靶點(diǎn)數(shù)較多通路還有鈣離子信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等，說(shuō)明桑貝止嗽散可能通過(guò)作用于這些通路的相關(guān)靶點(diǎn)發(fā)揮治療作用。

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法從理論分析得到桑貝止嗽散核心藥物治療新冠肺炎的關(guān)鍵化合物及其作用的潛在靶點(diǎn)、影響的生物功能過(guò)程和通路，同時(shí)也得出桑貝止嗽散治療新冠肺炎是多成分、多靶點(diǎn)、多途徑相互作用的結(jié)果，可以為臨床提供理論依據(jù)，但其作用機(jī)制還需通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究驗(yàn)證。