朱洪霞，劉 歡，張亞鵬，劉 鑫，范天一，王 芳，鄧 利

(北京化工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 北京市生物加工過程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100029)

少根根霉(Rhizopusarrhizus)是一種常見的絲狀真菌，廣泛存在于植物、動(dòng)物及土壤中。少根根霉的研究始于20世紀(jì)，因其具有產(chǎn)物種類多、營養(yǎng)要求簡(jiǎn)單、環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)、生長(zhǎng)迅速等優(yōu)點(diǎn)而被應(yīng)用于多種領(lǐng)域。少根根霉應(yīng)用最廣泛的異名是米根霉，可分為原變種、東京變種和德氏變種這3個(gè)變種[1]，其發(fā)酵產(chǎn)物包括有機(jī)酸及酶類，可作為重要的原料和高效催化劑應(yīng)用于化工、醫(yī)藥及食品領(lǐng)域。同時(shí)，少根根霉菌絲體在作為酶固定化載體和有害物質(zhì)吸附介質(zhì)方面有較大的利用價(jià)值。

近年來，富馬酸的市場(chǎng)需求量逐漸增大，尤其是在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域：富馬酸可作為酸味劑用于食品加工，富馬酸及其聚合物作為醫(yī)用材料的前體在醫(yī)藥領(lǐng)域也逐漸得到應(yīng)用[2]。少根根霉是發(fā)酵產(chǎn)富馬酸的主要微生物，其酶系豐富，可產(chǎn)脂肪酶、淀粉酶等，具有廣泛的底物適應(yīng)性。目前，發(fā)酵用于廉價(jià)可再生原料綠色生制造平臺(tái)化合物(如富馬酸、脂肪酶、淀粉酶、纖溶酶及乙醇等)的底物有葡萄糖、甘油、木糖、木質(zhì)纖維素及餐廚廢棄物等[3-5]。由于添加不同底物，少根根霉生長(zhǎng)狀態(tài)各有不同，其偏重產(chǎn)物也有所差別，所以本文對(duì)少根根霉生產(chǎn)不同產(chǎn)物的研究進(jìn)行總結(jié)，并對(duì)其產(chǎn)物及菌絲體的利用進(jìn)行介紹。

1 少根根霉產(chǎn)富馬酸

富馬酸是一種天然存在的有機(jī)酸，是三羧酸循環(huán)的一個(gè)中間體，也是美國能源部?jī)?yōu)先發(fā)展的十二種平臺(tái)化合物之一[6]。富馬酸因分子量小、緩沖能力強(qiáng)，可作為檸檬酸的替代品[7]，它不僅可作為酸味劑、防腐劑添加到食品中，還可作為多種藥物合成的前體[8-9]。早在1911年，Ehrlich就發(fā)現(xiàn)根霉菌具有生產(chǎn)富馬酸的能力，隨后Foster等[10]從8個(gè)不同種屬的微生物中篩選了41株菌，經(jīng)鑒定后發(fā)現(xiàn)根霉菌的富馬酸產(chǎn)量最高。目前報(bào)道的富馬酸生產(chǎn)有化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法[11]，相比于化學(xué)合成法，微生物發(fā)酵法以其原料可再生、綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)成為常用的工業(yè)化生產(chǎn)富馬酸的方法[12]，少根根霉因富馬酸產(chǎn)量高也成為發(fā)酵產(chǎn)富馬酸的優(yōu)勢(shì)菌。

1.1 少根根霉產(chǎn)富馬酸的代謝機(jī)制

富馬酸在根霉體內(nèi)的積累機(jī)制一直受到廣泛關(guān)注，目前公認(rèn)的是Osmani等[13]提出的“胞液途徑”學(xué)說。Wright等[14]利用同位素標(biāo)記法建立了根霉菌以葡萄糖為碳源的代謝模型，利用14C同位素標(biāo)記葡萄糖，分析根霉菌代謝過程中的各種產(chǎn)物，證實(shí)了富馬酸是由胞液途徑轉(zhuǎn)化而來。甘油、木糖、淀粉等碳源經(jīng)糖酵解等途徑轉(zhuǎn)化為丙酮酸，其中一部分流向線粒體，經(jīng)氧化后進(jìn)入三羧酸循環(huán)，為細(xì)胞生長(zhǎng)提供能量，另一部分留在胞質(zhì)中轉(zhuǎn)化為草酰乙酸，進(jìn)一步經(jīng)蘋果酸生成富馬酸，同時(shí)，丙酮酸也可在胞質(zhì)中轉(zhuǎn)化為乙醇、乙酸和乳酸等其他產(chǎn)物，代謝途徑如圖1所示。

(1)—己糖激酶；(2)—葡萄糖磷酸異構(gòu)酶；(3)—6-磷酸果糖激酶；(4)—醛縮酶；(5)—磷酸丙糖異構(gòu)酶；(6)—磷酸甘油醛脫氫酶；(7)—磷酸甘油酸激酶；(8)—磷酸甘油酸變位酶；(9)—烯醇化酶；(10)—丙酮酸激酶；(11)—丙酮酸脫氫酶系；NAD—煙酰胺腺嘌呤二核苷酸；NADP—煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸；ADP—腺嘌呤核苷二磷酸；ATP—腺嘌呤核苷三磷酸；TCA—三羧酸循環(huán)

1.2 少根根霉產(chǎn)富馬酸發(fā)酵工藝研究

少根根霉已被證明是較理想的富馬酸生產(chǎn)菌株，并且眾多研究者對(duì)其發(fā)酵生產(chǎn)過程進(jìn)行了探究和優(yōu)化。在傳統(tǒng)的發(fā)酵過程中，多以葡萄糖為發(fā)酵原料，成本較高，有與人爭(zhēng)糧、與糧爭(zhēng)地的缺點(diǎn)[15]，因此，研究少根根霉對(duì)廉價(jià)碳源的高效利用對(duì)節(jié)約資源、降低生產(chǎn)成本有重要意義。從目前的研究結(jié)果來看，木糖、木薯粉、粗甘油等可在一定程度上替代葡萄糖作為少根根霉發(fā)酵生產(chǎn)富馬酸的碳源，研究人員通過探究不通碳源條件下少根根霉發(fā)酵產(chǎn)富馬酸的狀況來擴(kuò)大少根根霉的碳源適用范圍，相關(guān)研究結(jié)果見表1[16-24]。由表1可知：少根根霉利用餐廚垃圾及水解液等原料發(fā)酵生產(chǎn)富馬酸的產(chǎn)量還較低，但我國目前存在大量的此類資源，因此對(duì)這些資源的高效利用還需進(jìn)一步研究，若能提高對(duì)餐廚垃圾及工業(yè)副產(chǎn)物水解物的利用率，這在資源的再利用方面具有重要的意義。有關(guān)少根根霉利用不同原料發(fā)酵產(chǎn)富馬酸的情況如表1所示。

表1 少根根霉發(fā)酵不同碳源產(chǎn)富馬酸

另外，為了改良發(fā)酵工藝，李鑫等[25]研究了外源添加蘋果酸、草酰乙酸、丙酮酸對(duì)米根霉產(chǎn)富馬酸的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加適當(dāng)濃度的中間代謝物均會(huì)使富馬酸產(chǎn)量提高。基于少根根霉具有良好附著性的特點(diǎn),Gu等[26]和Liu等[27]采用網(wǎng)布固定菌絲體進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間與游離態(tài)細(xì)胞發(fā)酵時(shí)間相比縮短83.3%，而富馬酸產(chǎn)量卻十分接近(分別為32.03和31.23 g/L)，這不僅改進(jìn)了富馬酸的發(fā)酵方式，也節(jié)約了發(fā)酵時(shí)間。Liu等[28]采用類似的方法進(jìn)行放大研究，在5 L攪拌式反應(yīng)器中以絲瓜瓤作為載體固定少根根霉生產(chǎn)富馬酸，其產(chǎn)量達(dá)46.8 g/L，此方法不僅解決了菌絲不耐剪切的問題，也為富馬酸的工業(yè)生產(chǎn)提供了一種新的工藝。

2 少根根霉產(chǎn)脂肪酶

脂肪酶(lipase,EC 3.1.1.3)又稱三?；视王；饷?，可將甘油三酯水解為脂肪酸、甘油二酯、單甘酯和甘油。脂肪酶的獲取途徑主要有提取法、微生物發(fā)酵法等，其中微生物發(fā)酵法因環(huán)境污染小且生產(chǎn)成本較低成為目前生產(chǎn)脂肪酶的主要方法。脂肪酶因其高度的選擇性和專一性而廣泛應(yīng)用于食品加工[29-30]、藥物合成[31]以及生物柴油轉(zhuǎn)化[32]等領(lǐng)域。

2.1 少根根霉產(chǎn)脂肪酶菌種選育

真菌來源的脂肪酶由于其高度的穩(wěn)定性而被廣泛研究，且部分已被制成商品化酶制劑[33]。根霉所產(chǎn)的脂肪酶優(yōu)先水解飽和脂肪酸鏈，具有較強(qiáng)的sn-1,3位專一性，應(yīng)用價(jià)值較高[34]。少根根霉是一種低等真菌，想對(duì)其進(jìn)行定向的基因改造存在一定的困難，因此大部分研究仍通過誘變育種來實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)脂肪酶菌株的選育。喬紅群等[35]利用紫外線與硫酸二乙酯復(fù)合的方式對(duì)一株根霉菌進(jìn)行誘變，使其脂肪酶活提高52%。冀頤之等[36-37]分別采用原生質(zhì)體激光誘變和低能N+注入技術(shù)對(duì)少根根霉進(jìn)行誘變處理，得到的目的菌株酶活提高了165%。

2.2 少根根霉產(chǎn)脂肪酶發(fā)酵工藝研究

隨著研究的進(jìn)一步深入，研究人員對(duì)少根根霉產(chǎn)脂肪酶的發(fā)酵工藝進(jìn)行了探究，以期得到少根根霉產(chǎn)酶的最佳條件，結(jié)合發(fā)酵條件優(yōu)化，部分少根根霉菌發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶情況如表2所示。

表2 少根根霉發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶工藝研究

因?yàn)樯俑咕z發(fā)達(dá)，易纏繞成團(tuán)，所以這會(huì)影響發(fā)酵結(jié)果，表2的研究證明了固定化菌體發(fā)酵能較好地解決少根根霉發(fā)酵過程中菌體纏繞和傳質(zhì)限制的問題，可有效促進(jìn)菌體的生長(zhǎng)和脂肪酶的合成。尹春華等[40]率先采用珍珠巖和聚氨酯泡沫作為根霉發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶的固定化載體，使酶活提高了8倍。以此為基礎(chǔ)，Yang等[43]以聚氨酯泡沫為固定化載體對(duì)固定化菌絲體分批次發(fā)酵進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，固定化菌絲體可在搖瓶中完成9批次產(chǎn)酶過程，在5 L發(fā)酵罐中成功實(shí)現(xiàn)6批次的產(chǎn)酶發(fā)酵，此法既提高了對(duì)菌絲體的利用效率又增加了脂肪酶的積累量，在未來的工業(yè)化生產(chǎn)中具有較大的開發(fā)潛力。

3 少根根霉產(chǎn)其他產(chǎn)物

除富馬酸、脂肪酶外，少根根霉還可積累多種有機(jī)酸類、醇類及酶等產(chǎn)物，如乳酸、乙醇、纖溶酶及淀粉酶等[45-49]，其相關(guān)研究報(bào)道結(jié)果總結(jié)見表3。

表3 少根根霉產(chǎn)其他產(chǎn)物

因?yàn)樯俑咕哂休^廣泛的產(chǎn)物種類，所以在利用少根根霉發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸的研究中，乳酸產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度多在60～120 g/L和0.7～2.5 g/(L·h)，F(xiàn)u等[50]利用一步發(fā)酵法將少根根霉的生長(zhǎng)和產(chǎn)酸在同一培養(yǎng)基中進(jìn)行，使其持續(xù)發(fā)酵直至耗糖結(jié)束，這與傳統(tǒng)發(fā)酵法相比，菌體密度有所升高且乳酸產(chǎn)量也顯著提高。另外，少根根霉是傳統(tǒng)發(fā)酵中的可食用菌株，也是經(jīng)FDA認(rèn)證的安全菌，其糖化能力強(qiáng)，可將淀粉近乎理論值地轉(zhuǎn)化為葡萄糖。同時(shí)，少根根霉是酒曲微生物的重要組成部分，具有較好的產(chǎn)乙醇能力，現(xiàn)根霉制曲已廣泛應(yīng)用于白酒、黃酒等發(fā)酵產(chǎn)品的生產(chǎn)[49]。隨著人們對(duì)食品安全的逐步重視，少根根霉因其自身的安全性和可食用性在釀造行業(yè)具有良好的應(yīng)用前景。

4 少根根霉菌絲體的綜合利用

少根根霉不僅能用于生產(chǎn)多種產(chǎn)品，而且其菌絲體也具有重要的應(yīng)用價(jià)值。由于少根根霉菌絲體含有豐富的多糖類物質(zhì)及蛋白質(zhì)，經(jīng)加工處理后通?？勺鳛樘娲煞痔砑拥斤暳现衃51]，用于畜禽的養(yǎng)殖。除此之外，少根根霉的菌絲體也可作為廢水中重金屬離子及放射性元素的吸附劑、酶的固定化載體，還有用作生物質(zhì)保溫材料的潛力[52]。

原子能工業(yè)或其他工業(yè)產(chǎn)生的廢水中往往含有放射性元素或重金屬離子，為防止其對(duì)環(huán)境造成污染，需在排放前將其去除。少根根霉的菌絲體胞壁呈多層、微纖維結(jié)構(gòu)，存在多個(gè)離子的吸附位點(diǎn)，且吸附能力強(qiáng)，可通過物理和化學(xué)吸附、靜電作用、離子交換和絡(luò)合等方式將重金屬離子吸附到細(xì)胞表面“富集”起來，以降低廢水中重金屬離子的濃度[53]。菌絲體的吸附能力除受菌體量以及離子半徑的影響外，受pH的影響較為明顯，在不同pH條件下，菌絲體對(duì)各類重金屬離子及放射性元素的吸附效率也會(huì)不同(表4)。在相同的pH條件下，菌絲體對(duì)不同物質(zhì)的吸附率存在差異，可通過實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，調(diào)節(jié)反應(yīng)體系至最佳pH時(shí)，其吸附率可大大提高。

表4 少根根霉菌絲體對(duì)廢水中有害物質(zhì)的吸附

少根根霉的菌絲體除用于吸附重金屬離子及放射性元素外，還可作為脂肪酶的固定化載體。在生物柴油生產(chǎn)過程中，脂肪酶存在反應(yīng)速率低、應(yīng)用成本高、易失活等問題，但是來自不同真菌的菌絲結(jié)合酶是自然固定且非常穩(wěn)定的，所以以菌絲體作為酶固定化的天然載體被認(rèn)為是一種廉價(jià)的替代方法，用于脂肪酶在生物柴油和其他領(lǐng)域中，具有較大的開發(fā)潛力[58]。田嬌嬌[59]以少根根霉菌絲體為載體，經(jīng)吸附和包埋相結(jié)合的固定化方法制備了一種核殼結(jié)構(gòu)固定化酶，研究結(jié)果表明以其作為載體制備的固定化酶具有較好的穩(wěn)定性和較高的使用效率。另外，少根根霉菌絲體在生長(zhǎng)過程中能相互交聯(lián)形成纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，且其幾丁質(zhì)含量較高，具有較好的穩(wěn)定性和阻燃性[60]，如將其與珍珠巖等其他材料復(fù)合，有用于制作生物質(zhì)保溫材料的潛力。綜上，少根根霉菌絲體的應(yīng)用不僅能實(shí)現(xiàn)對(duì)發(fā)酵廢棄物的有效利用，降低生產(chǎn)成本，也可減小環(huán)境壓力。隨著研究的進(jìn)一步推進(jìn)，少根根霉菌絲體在其他領(lǐng)域的應(yīng)用也將逐步得到開發(fā)。

5 展望

少根根霉具有環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)、營養(yǎng)要求簡(jiǎn)單、酶系豐富、可積累多種天然產(chǎn)物的優(yōu)點(diǎn)，在食品、醫(yī)藥及化工等領(lǐng)域發(fā)揮越來越重要的作用，但目前仍然有幾個(gè)技術(shù)難點(diǎn)阻礙了其產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。首先，少根根霉形態(tài)發(fā)育機(jī)制不明，缺乏遺傳操作工具，想要通過對(duì)菌株進(jìn)行定向改造獲得高產(chǎn)菌還有很大的困難，若能應(yīng)用新型誘變技術(shù)——常壓室溫等離子體誘變等技術(shù)建立菌種選育方法，結(jié)合基因工程及組學(xué)的分析手段解析少根根霉細(xì)胞內(nèi)基因的表達(dá)過程，剖析影響基因表達(dá)及其關(guān)鍵酶活性的因素，可獲得穩(wěn)定性好、活性高的少根根霉生產(chǎn)菌株。其次，少根根霉為無隔低等真核生物，其菌絲體不耐剪切，在發(fā)酵放大方面仍存在一定困難，若能將固定化技術(shù)應(yīng)用到工業(yè)生產(chǎn)的發(fā)酵罐中，不僅能克服這一技術(shù)難點(diǎn)，還會(huì)在很大幾率上降低生產(chǎn)成本。最后，少根根霉發(fā)酵生產(chǎn)過程仍存在產(chǎn)率低、分離純化工藝繁瑣等問題，與傳統(tǒng)化學(xué)法相比仍缺乏競(jìng)爭(zhēng)性，關(guān)于少根根霉發(fā)酵分離耦合的研究還需進(jìn)一步推進(jìn)，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物最大限度的積累，推動(dòng)少根根霉發(fā)酵生產(chǎn)的產(chǎn)業(yè)化趨勢(shì)。