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        漢遜德巴利酵母L1-1發(fā)酵槐花提取物產(chǎn)香氣物質(zhì)及其應(yīng)用

        2021-11-05 13:56:34張倩穎李東亮丁重陽(yáng)
        生物加工過(guò)程 2021年5期
        關(guān)鍵詞:巴利槐花卷煙

        張倩穎,羅 誠(chéng),李東亮,丁重陽(yáng)

        (1.四川中煙工業(yè)有限責(zé)任公司 技術(shù)中心,四川 成都 610066;2.江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室,江蘇 無(wú)錫 214122)

        香精香料在食品、飼料、化妝品、化學(xué)和制藥等領(lǐng)域具有極其重要的作用,與人們?nèi)粘I钕⑾⑾嚓P(guān)。使用香精香料能夠改進(jìn)產(chǎn)品性能,提升品質(zhì)[1]。傳統(tǒng)香精香料的配制方法多以天然提取或化學(xué)合成的單體混合調(diào)配而成,難以形成具有獨(dú)特香氣的香精香料[2]。

        微生物發(fā)酵能夠產(chǎn)生種類(lèi)多樣的香氣物質(zhì),形成豐富而獨(dú)特的香氣[2-4]。隨著人們對(duì)綠色健康生活的追求,利用微生物制備安全綠色的天然香精香料成為研究熱點(diǎn)。目前,已有100多種利用細(xì)菌、真菌和酵母等微生物制備的天然香精香料實(shí)現(xiàn)了商品化[5]。

        本研究將德巴利酵母(Debaryomyceshansenii)L1-1、樹(shù)干畢赤酵母(Pichiastipitis)CICC1960和釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)BNCC185415這3株產(chǎn)香酵母與薰衣草、玫瑰花、紫羅蘭、菊花、槐花、桂花和白芍花這7種具有獨(dú)特香韻的花進(jìn)行組合發(fā)酵,篩選出一組菌株-花組合。在此基礎(chǔ)上以感官為導(dǎo)向,采用單因素法和田口實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化,得到一個(gè)最優(yōu)培養(yǎng)基并從中提取制備出一種風(fēng)格獨(dú)特的天然香料,分析了提取物中半揮發(fā)性成分及常見(jiàn)香氣成分。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 菌株

        漢遜德巴利酵母L1-1、樹(shù)干畢赤酵母CICC1960和釀酒酵母BNCC185415保藏于江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室。

        1.1.2 主要儀器設(shè)備

        Trace 1310-ISQ LT型三重四級(jí)桿氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,美國(guó)Thermo公司;二乙烯基苯/Carboxen/聚二甲基硅氧烷(DVB/CAR/PDMS)固相微萃取萃取頭,美國(guó)Supelco公司。

        1.2 方法

        1.2.1 菌株培養(yǎng)

        種子培養(yǎng)基:馬鈴薯200.0 g/L,葡萄糖20.0 g/L。

        菌株活化:取-80 ℃保藏的菌株轉(zhuǎn)接入種子培養(yǎng)基,28 ℃培養(yǎng)48 h,活化2代,待用。

        菌株發(fā)酵:接種活化好的菌株于發(fā)酵培養(yǎng)基28 ℃培養(yǎng)5 d。

        1.2.2 酵母-花組合篩選

        將活化后的德巴利酵母L1-1、樹(shù)干畢赤酵母CICC1960和釀酒酵母BNCC185415等3株酵母接種于滅菌的薰衣草、玫瑰花、紫羅蘭、菊花、槐花、桂花和白芍花,產(chǎn)生21種酵母-花組合,滅菌鑰勺混勻,28 ℃培養(yǎng)5 d,發(fā)酵結(jié)束后對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行提取,對(duì)提取物進(jìn)行產(chǎn)香效果評(píng)價(jià),選取對(duì)卷煙品質(zhì)具有顯著提升效果的酵母-花組合,進(jìn)行后續(xù)培養(yǎng)基優(yōu)化研究。

        1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

        單因素實(shí)驗(yàn):以槐花為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,分別添加不同質(zhì)量的葡萄糖、甘油、豆粕粉、玉米粉、土豆汁、麥芽糖、麩皮、蔗糖及果糖,發(fā)酵結(jié)束后對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行提取,對(duì)提取物進(jìn)行產(chǎn)香效果評(píng)價(jià),以篩選對(duì)產(chǎn)香有促進(jìn)作用的因子。

        田口實(shí)驗(yàn):根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取對(duì)菌株產(chǎn)香具有促進(jìn)作用的因子進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。綜合田口實(shí)驗(yàn)原理,以評(píng)吸結(jié)果為響應(yīng)值,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)分析皆采用JMP軟件(version 10.0,SAS Institute Inc.),因素編碼及自變量水平見(jiàn)表1。

        表1 田口實(shí)驗(yàn)變量及編碼水平

        1.2.4 產(chǎn)香效果評(píng)價(jià)

        由經(jīng)驗(yàn)豐富的卷煙感官評(píng)定專(zhuān)家對(duì)提取物進(jìn)行嗅香,篩選出香味與煙香協(xié)調(diào)、對(duì)卷煙品質(zhì)可能有提升的提取物,加入卷煙進(jìn)行卷煙加香評(píng)吸。

        卷煙加香評(píng)吸:取2 μL提取物加入卷煙煙絲,在恒溫恒濕箱內(nèi)調(diào)節(jié)煙支水分48 h,溫度(22±1) ℃,相對(duì)濕度60%±3%。參照《YC/T 138—1998煙草及煙草制品·感官評(píng)價(jià)方法》[6],由經(jīng)驗(yàn)豐富的感官評(píng)定專(zhuān)家,對(duì)卷煙樣品進(jìn)行評(píng)吸。

        根據(jù)評(píng)吸結(jié)果,由香氣特征、煙氣特征及口感特征這三方面進(jìn)行賦分,81~95分為極顯著提高卷煙質(zhì)量(+++),66~80分為顯著提高卷煙質(zhì)量(++),51~65分為提高卷煙質(zhì)量(++),36~50分為與空白對(duì)照組相似(±),21~35分為降低卷煙感官質(zhì)量(-),6~20分為顯著降低卷煙感官質(zhì)量(--)。

        1.2.5 發(fā)酵液中半揮發(fā)性物質(zhì)分析

        采用頂空固相微萃取結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用(SPME-GC/MS)測(cè)定提取物中半揮發(fā)性物質(zhì),以2-辛醇為內(nèi)標(biāo)。頂空固相微萃取條件:萃取頭在GC進(jìn)樣口老化至無(wú)雜峰,在60 ℃下萃取30 min,被吸附的半揮發(fā)性化合物在GC進(jìn)樣口260 ℃解吸1 min,沖入GC色譜柱,同時(shí)啟動(dòng)儀器采集數(shù)據(jù)。氣相色譜條件:色譜柱為DB/WAX,載氣為He,流速為1.2 mL/min;程序升溫條件為50 ℃維持2 min,3 ℃/min升溫至180 ℃,15 ℃/min升溫至230 ℃,維持8 min。質(zhì)譜條件:接口溫度230 ℃,離子源溫度260 ℃,四級(jí)桿溫度150 ℃,電離電勢(shì)70 eV,離子化模式EI+,質(zhì)量掃描范圍(m/z)為33~350。檢測(cè)獲得的質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)與NIST標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜檢索庫(kù)進(jìn)行檢索比對(duì)鑒定,由內(nèi)標(biāo)法計(jì)算各組分的相對(duì)含量。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 酵母-花組合篩選

        將3株產(chǎn)香效果較好的酵母菌接種于7種特色植物進(jìn)行發(fā)酵,觀察酵母發(fā)酵情況,發(fā)現(xiàn)從第2天開(kāi)始,酵母菌在7種植物組成的培養(yǎng)基中均有明顯生長(zhǎng)。選取菌株長(zhǎng)勢(shì)良好的培養(yǎng)物進(jìn)行提取,選取嗅香較好且可能對(duì)卷煙品質(zhì)具有顯著提升的樣品進(jìn)行卷煙加香評(píng)吸,嗅香及評(píng)吸結(jié)果見(jiàn)表2。

        表2 嗅香及評(píng)吸結(jié)果

        由表2可知:與對(duì)照相比,發(fā)酵后的樣品外香發(fā)生了明顯變化,香氣變化程度和對(duì)卷煙品質(zhì)影響程度與菌株和底物均有明顯關(guān)系。具體來(lái)說(shuō),經(jīng)過(guò)3株酵母發(fā)酵后的薰衣草組樣品和樹(shù)干畢赤酵母CICC1960發(fā)酵玫瑰花樣品中表現(xiàn)出了不愉快的香氣,氣味較未發(fā)酵樣品差;發(fā)酵后的紫羅蘭和白芍花香氣變化較大,但與對(duì)照相比,卷煙感官品質(zhì)提升不明顯,漢遜德巴利酵母L1-1發(fā)酵后的紫羅蘭和白芍花樣品甚至降低了卷煙的感官品質(zhì);經(jīng)發(fā)酵后的菊花提取物均帶有醬甜香氣,菊花組提取物在卷煙刺激和雜氣等方面有所改善;漢遜德巴利酵母L1-1和釀酒酵母BNCC185415發(fā)酵后的桂花提取物,特征香氣較未發(fā)酵提取物弱,但加入卷煙后能夠豐富卷煙煙香、改善余味和增強(qiáng)回甜感;漢遜德巴利酵母L1-1和樹(shù)干畢赤酵母CICC1960發(fā)酵后的槐花提取物均表現(xiàn)為“弱槐花特有香氣,帶清甜酒香”,但是對(duì)卷煙的感官影響差異較大,前者表現(xiàn)為“豐富香韻,增加煙氣濃度和飽滿(mǎn)度,降低刺激性(++)”,后者表現(xiàn)為“煙氣渾濁、發(fā)干,刺激增大,口腔辣苦(--)”。

        槐花(FlosSophorae)是豆科植物槐(SophorajaponicaL.)的花朵,乳白色,蝶形花冠,為我國(guó)首批藥食同源的花卉植物。槐花不僅營(yíng)養(yǎng)豐富,還含有刀豆酸、槐花二醇、蘆丁和槲皮素等活性物質(zhì)[7],且香氣素雅、清香持久[8],是一種具有開(kāi)發(fā)利用價(jià)值的香味原料。漢遜德巴利酵母為常見(jiàn)的生香酵母,發(fā)酵時(shí)會(huì)產(chǎn)生較淡的甜酯香,略帶酒香,被廣泛應(yīng)用于肉制品的制備中[9]。本研究的所有提取物中,漢遜德巴利酵母L1-1發(fā)酵槐花的提取物對(duì)卷煙品質(zhì)提升具有最顯著的影響(++),目前,尚無(wú)用漢遜德巴利酵母發(fā)酵槐花生產(chǎn)天然香精香料的報(bào)道。因此,本文選取漢遜德巴利酵母L1-1發(fā)酵槐花進(jìn)行后續(xù)培養(yǎng)基優(yōu)化。

        2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

        在槐花培養(yǎng)基中加入不同質(zhì)量濃度的常見(jiàn)食品級(jí)葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、果糖、甘油、玉米粉、豆粕粉、土豆汁和麩皮,接種漢遜德巴利酵母L1-1培養(yǎng)后,對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行提取,提取物記為HD,由經(jīng)驗(yàn)豐富的卷煙評(píng)吸專(zhuān)家進(jìn)行效果評(píng)價(jià),嗅香和評(píng)吸結(jié)果見(jiàn)表3。

        表3 嗅香及評(píng)吸結(jié)果

        根據(jù)評(píng)吸結(jié)果,初步篩選出與煙香協(xié)調(diào)且對(duì)卷煙質(zhì)量效果具有較強(qiáng)提升作用(評(píng)吸結(jié)果“++”和“+++”)的HD葡-1、HD豆-1、HD豆-3、HD玉-1、HD麥-2和HD果-1,由經(jīng)驗(yàn)豐富的卷煙評(píng)吸專(zhuān)家對(duì)卷煙進(jìn)行復(fù)評(píng),結(jié)果見(jiàn)表4。

        表4 復(fù)評(píng)結(jié)果

        根據(jù)感官評(píng)吸結(jié)果,篩選葡萄糖、豆粕粉、玉米粉、麥芽糖和果糖等5個(gè)因子進(jìn)行田口實(shí)驗(yàn)。

        2.3 田口實(shí)驗(yàn)

        田口設(shè)計(jì)(Taguchi design)實(shí)質(zhì)上是利用正交數(shù)組進(jìn)行設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),其能夠在眾多實(shí)驗(yàn)變量中篩選出最少變量以滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)需要[10]。在優(yōu)化設(shè)計(jì)中利用田口設(shè)計(jì)具有多個(gè)變量能夠被同時(shí)優(yōu)化,在較少的實(shí)驗(yàn)組數(shù)中能夠得到較多相關(guān)因子的定量信息等優(yōu)點(diǎn)[11],已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于發(fā)酵工業(yè)[12-14]。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以發(fā)酵提取物感官評(píng)吸平均值為響應(yīng),對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化,田口實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)培養(yǎng)基方案及評(píng)吸賦值結(jié)果見(jiàn)表5。

        對(duì)表5中實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析,結(jié)果見(jiàn)表6。

        表5 田口實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值

        表6 回歸方程方差分析

        表7 偏回歸系數(shù)及顯著性檢驗(yàn)

        由表7可知:對(duì)漢遜德巴利酵母L1-1發(fā)酵槐花發(fā)酵產(chǎn)物感官評(píng)定具有顯著影響的因素有葡萄糖、豆粕粉、麥芽糖和果糖(P<0.05)。同時(shí),軟件給出了感官評(píng)定分值最高時(shí)的最優(yōu)培養(yǎng)基配方:X1(葡萄糖)、X2(豆粕粉)、X3(玉米粉)、X4(麥芽糖)和X5(果糖)分別對(duì)應(yīng)水平L3、L2、L2、L3和L2,預(yù)測(cè)評(píng)吸值(圖1中以Y表示)為80.6分,其概率(圖1中以意愿表示)為88.06%(圖1)。意愿為達(dá)到軟件預(yù)測(cè)的感官最大值的概率。紅色的L2和L3等為軟件預(yù)測(cè)最大響應(yīng)下,即軟件預(yù)測(cè)的最大評(píng)吸值下對(duì)應(yīng)因素的水平,紅色為軟件自帶。

        圖1 軟件預(yù)測(cè)評(píng)吸最大值

        在軟件給出的最優(yōu)條件下進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn),將該培養(yǎng)基發(fā)酵提取物加入卷煙進(jìn)行評(píng)吸,與空白卷煙相比,加香卷煙煙香豐富、煙氣蓬松流暢、圓潤(rùn)、細(xì)膩,刺激性降低,得出評(píng)吸值為(88±2)分,實(shí)驗(yàn)值和理論值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為9.18%??梢?jiàn),本研究采用的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)合田口實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),對(duì)漢遜德巴利酵母L1-1發(fā)酵槐花培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化效果良好。

        2.4 發(fā)酵液半揮發(fā)性物質(zhì)測(cè)定

        測(cè)定漢遜德巴利酵母L1-1發(fā)酵槐花提取物(HD)半揮發(fā)性物質(zhì),以槐花未發(fā)酵樣品提取物(記為H)作為對(duì)照,總離子流圖見(jiàn)圖2,成分分析結(jié)果見(jiàn)表8。

        圖2 未發(fā)酵(a)與發(fā)酵(b)槐花提取物總離子流

        由表8可知:在2個(gè)樣品中共鑒定出51種半揮發(fā)性物質(zhì)。在H樣品中共鑒定出33種半揮發(fā)性物質(zhì),半揮發(fā)性物質(zhì)的總含量為2 424.00 mg/L,其中2-乙基己酸和芳樟醇為含量最高的2種物質(zhì),含量分別為334.45和332.36 mg/L。在HD中共檢出41種半揮發(fā)性物質(zhì),半揮發(fā)性物質(zhì)的總含量為8 821.7 mg/L,其中苯乙醇和芳樟醇為含量最高的2種物質(zhì),含量分別為4 293.99和1 798.64 mg/L。

        表8 半揮發(fā)性物質(zhì)

        進(jìn)一步分析半揮發(fā)性物質(zhì)中常見(jiàn)的香味物質(zhì),發(fā)現(xiàn)在H和HD樣品中,共檢出29種常見(jiàn)香味物質(zhì),包括異戊醇、異丁酸、正戊醇、正己醇、乙酸異戊酯、苯甲醇、壬醛、異戊酸、苯乙烯、(E)-2-庚烯醛、苯甲醛、3-辛酮、苯乙酮、芳樟醇、脫氫芳樟醇、苯乙醇、冰片、松油烯-4-醇、α-松油醇、桃金娘烯醇、異戊酸芳樟酯、香芹醇、橙花醇、鄰氨基苯甲酸甲酯、丁香酚、γ-壬內(nèi)酯、茉莉酮、月桂醇和β-紫羅蘭酮。在H中,香味物質(zhì)包括除3-辛酮、脫氫芳樟醇、冰片、桃金娘烯醇、香芹醇、丁香酚和月桂醇外的22種物質(zhì)。這22種香味物質(zhì)總量為1 780.66 mg/L,其中含量較高的香味物質(zhì)主要有芳樟醇、松油烯-4-醇、α-松油醇、異戊醇、苯乙醇和橙花醇(332.36~110.57 mg/L),這6種物質(zhì)總量占香味物質(zhì)總量的70.1%。在HD中,也包含22種常見(jiàn)香味物質(zhì),具體為除異戊醇、異丁酸、正戊醇、正己醇、乙酸異戊酯、苯甲醇和壬醛等7種物質(zhì)以外的物質(zhì)。在HD中存在的這22種香味物質(zhì)總量為7 798.00 mg/L,其中苯乙醇、芳樟醇和α-松油醇(838.49~4 293.99 mg/L)含量較高,這3種物質(zhì)總量占香味物質(zhì)含量的88.8%。

        異戊醇、異丁酸、正戊醇、正己醇、乙酸異戊酯、苯甲醇、壬醛、(E)-2-庚烯醛、苯甲醛、松油烯-4-醇、鄰氨基苯甲酸甲酯和β-紫羅蘭酮等12種香味物質(zhì)僅在H中被鑒定出或含量高于HD中,3-辛酮、脫氫芳樟醇、冰片、桃金娘烯醇、香芹醇、丁香酚、月桂醇、異戊酸、苯乙烯、苯乙酮、異戊酸芳樟酯和γ-壬內(nèi)酯等12種香味物質(zhì)則表現(xiàn)出相反的趨勢(shì)。值得注意的是,在HD中苯乙醇、芳樟醇和α-松油醇等3種物質(zhì)分別為H的23.2倍、5.4倍和4.1倍。苯乙醇具有水果樣的味道,在卷煙中能夠掩蓋雜氣,增加細(xì)膩柔和度,提高香氣;芳樟醇具有典型的花香香氣、柔和透發(fā),在卷煙中與煙香協(xié)調(diào),能夠增加花香、清香,修飾和矯正自然風(fēng)味,吸味柔和;α-松油醇具有鮮幽香氣,稀釋后有似桃甜香,與煙香協(xié)調(diào),賦予果香和辛香,改善煙氣新鮮風(fēng)味[15]。漢遜德巴利酵母L1-1能夠通過(guò)一系列分解代謝,利用初始培養(yǎng)基中包含12種香味物質(zhì)在內(nèi)的物質(zhì),經(jīng)過(guò)合成代謝轉(zhuǎn)化為包含另外12種香味物質(zhì)在內(nèi)的產(chǎn)物,最終使得發(fā)酵后的培養(yǎng)物呈現(xiàn)出“槐花特征香韻減弱、香韻更加柔和且略帶酒香”的特征香韻。

        3 結(jié)論

        從21種酵母-花組合中,篩選得到了一種風(fēng)格獨(dú)特的具有開(kāi)發(fā)成為天然香料潛力的漢遜德巴利酵母L1-1槐花組合。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和田口實(shí)驗(yàn)得到了一種最優(yōu)培養(yǎng)基,并制備出了一種香氣獨(dú)特的天然香料。該香料能夠增加卷煙甜花香韻,使煙氣圓潤(rùn)、細(xì)膩,降低刺激性。SPME-GC/MS分析表明,該香料中共檢出41種半揮發(fā)性物質(zhì),其中包括22種常見(jiàn)香氣成分;未發(fā)酵時(shí)常見(jiàn)香味物質(zhì)含量為1 780.66 mg/L,經(jīng)過(guò)發(fā)酵處理香味物質(zhì)含量增加到了7 798.00 mg/L,苯乙醇、芳樟醇和α-松油醇含量為未發(fā)酵樣品的23.2倍、5.4倍和4.1倍。

        通過(guò)本研究的發(fā)酵策略,改變了槐花特征香氣,得到了一種香氣獨(dú)特的天然香料,但是本研究?jī)H研究了發(fā)酵前后提取物中半揮發(fā)性物質(zhì)的變化情況,德巴利酵母L1-1發(fā)酵槐花產(chǎn)香作用機(jī)制和代謝途徑等有待深入研究。

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