張世侖，王大威，尹榆鈞，靖 波，王秀軍

(1. 海洋石油高效開發(fā)國家重點實驗室，北京 100028；2.中海油研究總院有限責(zé)任公司，北京 100028；3. 南開大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 分子微生物學(xué)與技術(shù)教育部重點實驗室，天津 300071)

目前，從油田中分離出來的硫酸鹽還原古菌只有屬于廣古菌門的極端嗜熱菌——古球菌(Archaeoglobus)，它能以硫酸鹽和硫代硫酸鹽為電子受體而利用脂肪酸(C4～C8)[16-17]。盡管古菌在地下生物圈的占比很小[18]，但其所具備的硫酸鹽還原功能可追溯至生命起源的早期，亦不可忽視。

本研究通過高通量測序技術(shù)，對渤海S油田油藏內(nèi)源古菌的群落組成和多樣性進行分析，構(gòu)建硫酸鹽還原功能基因的分子進化樹，并且比較油田H2S治理井與非治理井之間古菌群落組成的差異，以期證實古菌對油藏環(huán)境的酸蝕作用，進而有助于工業(yè)系統(tǒng)因地制宜地選擇適當(dāng)?shù)腟RPs生物抑制策略。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

SpectroBlue型電感耦合等離子發(fā)射光譜儀，德國Spectro公司；ICS-1100型離子色譜儀，Thermo Fisher公司；AxyPrepTM細(xì)菌基因組DNA試劑盒，Axygen Biosciences公司；EmeraldAmp?PCR反應(yīng)混合物，TaKaRa公司；ABI GeneAmp?9700型熱循環(huán)儀，Applied Biosystems公司；IlluminaMiseq測序平臺，上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 油田采出液取樣

取1只容量為25 L的塑料桶，用醫(yī)用酒精洗2～3次；根據(jù)井口壓力選擇性接上高(低)壓取樣器，打開取樣閥，讓采出液流出5～10 min并沖洗塑料桶2～3次；將采出液灌滿塑料桶，每口井25 L(其中原油至少1 L，地層水至少10 L)，擰緊蓋子密閉常溫保存(注意：冬季防凍結(jié)、夏季防暴曬)；樣品采集后盡快運送至實驗室進行預(yù)處理。

1.2.2 樣品離子參數(shù)檢測

將采出液樣品進行離心(12 000 r/min 離心5 min)，取中間清液通過0.22 μm濾膜，收集濾液，使用電感耦合等離子發(fā)射光譜儀、離子色譜儀分別對濾液中的陽、陰離子含量進行檢測。

1.2.3 樣品菌體收集

針對采集樣品的水相部分，直接采用離心法(12 000 r/min，離心5 min)收集其中的菌體；針對油相部分，預(yù)先與異辛烷混合，充分溶解得到單一相，再進行離心(12 000 r/min，離心20 min)收集沉淀；將上層液相通過0.22 μm濾膜，過濾收集菌體。

1.2.4 樣品DNA提取

取菌液20 mL于離心管中，12 000 r/min離心10 min；菌體用1 mL Lysis buffer洗2次后用0.6 mL Lysis buffer重懸并加入0.2 g玻璃珠研磨1 min，重復(fù)3次，加入終質(zhì)量濃度為10 mg/mL的溶菌酶在37 ℃下反應(yīng)1 h；加入120 μL 200 g/L的SDS在65 ℃下反應(yīng)1 h；使用AxyPrepTM細(xì)菌基因組DNA試劑盒完成后續(xù)提取(具體方法步驟參照說明書)。

1.2.5 古菌群落組成分析

使用通用引物524F10extF(5’-TGYCAGCCGCCGCGGTAA-3’)和Arch958RmodR(5’-YCCGGCGTTGAVTCCAATT-3’)對上述樣品的DNA進行古菌16S rRNA基因PCR擴增[19]，PCR反應(yīng)體系(2×Taq PCR Master Mix 10 μL，重蒸水12 μL，正、反向引物各1 μL，DNA 1 μL)，PCR反應(yīng)程序(預(yù)變性溫度95 ℃，保持5 min；35個循環(huán)：變性溫度95 ℃，保持30 s；退火溫度52 ℃，保持30 s；延伸溫度72 ℃，保持1 min；終延伸溫度72 ℃，保持10 min)；PCR產(chǎn)物送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行微生物群落組成和多樣性分析。

1.2.6 硫酸鹽還原功能基因擴增

基于硫酸鹽還原功能基因及其對應(yīng)引物：aprA(aprA-1-FW：5’-TGGCAGATCATGATYMAYGG-3’和aprA-5-RV：5’-GCGCCAACNGGDCCRTA-3’)[20]、dsrA(DSR-1Fdeg：5’-ACSCAYTGGAARCACG-3’和PJdsr853Rdeg：5’-CGGTGMAGYTCRTCCTG-3’)[21]、dsrB(DSRp2060F：5’-CAACATCGTYCAYACCCAGGG-3’和DSR4R：5’-GTGTAGCAGTTACCGCA-3’)[22]，分別對上述樣品的DNA進行PCR擴增，PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)程序與古菌16S rRNA基因PCR擴增的相同。

1.2.7 功能基因進化樹構(gòu)建

將硫酸鹽還原功能基因PCR產(chǎn)物割膠回收，純化后的DNA配制T載體連接體系(DNA 4.5 μL，Solution I 5 μL，pMD?19-T Simple Vector 0.5 μL)；從平板上挑取白色單克隆經(jīng)PCR鑒定之后送樣測序[23]；利用EMBOSS Transeq將基因序列翻譯成相應(yīng)的蛋白質(zhì)序列，使用CD-Hit Suite將蛋白質(zhì)序列分類得到不同的操作分類單元(OTU)[24]；與NCBI數(shù)據(jù)庫進行比對，獲得相似性較高的參考序列，將參考序列和OTU代表序列一起導(dǎo)入MEGA7.0軟件中，使用Neighbor-joining方法構(gòu)建功能基因進化樹[25]。

1.2.8 熱力圖聚類分析

采用距離計算算法：樣本間為spearman[26]，采用的聚類方法為hcluster(complete算法)[27]。

1.2.9 國際基因庫測序接受號

采出液樣品古菌高通量測序原始數(shù)據(jù)上傳至NCBI的SRA(Sequence Read Archive)數(shù)據(jù)庫，接受號為SRR10489661～SRR10489664、PRJNA643651。硫酸鹽還原功能基因測序數(shù)據(jù)上傳至NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫，aprA基因接受號為MN392725～MN392899，dsrA基因接受號為MN417336～MN417496，dsrB基因接受號為MN431958～MN432152。

2 結(jié)果與討論

2.1 古菌群落多樣性分析

為了研究采出液樣品古菌群落組成及多樣性信息，選取古菌16S rRNA基因測序獲得的OTU代表性序列，與NCBI數(shù)據(jù)庫進行比對獲得古菌的注釋信息。基于古菌注釋信息，計算各古菌的相對豐度，繪制古菌相對豐度分布圖，結(jié)果見圖1。由圖1可知：產(chǎn)甲烷古菌(Methanomassiliicoccales、Methanobacteriales、Methanofastidiosales和Methanomethyliales)合計占比近60%；具有硫酸鹽還原功能的熱球菌(Thermococcales)、古球菌(Archaeoglobales)和脫硫球菌(Desulfurococcales)各自占比分別為0.30%、0.59%和2.96%。

圖1 古菌相對豐度分布圖

相比于產(chǎn)甲烷古菌，硫酸鹽還原古菌雖不占優(yōu)勢，但它們能夠利用各式各樣的電子受體(硫酸鹽、硫代硫酸鹽、硫化物、硝酸鹽、亞硝酸鹽、延胡索酸鹽和CO2)，這種代謝功能多樣化的優(yōu)勢有助于它們在電子受體枯竭時，擁有在環(huán)境中存活下去的機會[28]。

2.2 硫酸鹽還原功能基因進化研究

硫酸鹽還原功能基因的分子進化樹及相對豐度如圖2所示。由圖2(a)可知：樣品aprA基因共計8個OTU，有6種類型菌。其中，OTUaprA-8源自閃爍古球菌(Archaeoglobusfulgidus)，Thermodesulfobacterium占絕對優(yōu)勢，古球菌(Archaeoglobus)占比1.71%。

圖2 硫酸鹽還原功能基因分子進化樹及相對豐度

由圖2(b)可知：樣品dsrA基因共計15個OTU，有10種類型菌，其中，OTUdsrA-12源自Archaeoglobusfulgidus，OTUdsrA-13、OTUdsrA-14和OTUdsrA-15源自Archaeoglobussulfaticallidus，古球菌(Archaeoglobus)為絕對優(yōu)勢菌，占比57.76%。

由圖2(c)可知：樣品dsrB基因共計18個OTU，有17種類型菌，多樣性較高。其中，OTUdsrB-13源自Archaeoglobusfulgidus，Desulfurispora與古球菌(Archaeoglobus)為優(yōu)勢菌，分別占比38.46%、17.44%。

綜上可知，古球菌的硫酸鹽還原功能基因以異化型亞硫酸鹽還原酶(DSR)為主，介導(dǎo)亞硫酸鹽生成硫化物這一反應(yīng)過程。

2.3 生物抑制作用對硫酸鹽還原古菌的影響

2.3.1 離子參數(shù)分析

表1 采出液樣品離子參數(shù)

2.3.2 古菌群落組成差異分析

為了比較X1、X2兩類井采出液樣品古菌群落組成的差異，研究樣品群落的情況，獲得古菌的注釋信息，再基于古菌注釋信息，繪制采出液樣品古菌相對豐度分布，結(jié)果見圖3。由圖3可知：產(chǎn)甲烷古菌(Methanosaeta、Methanothermobacter和Methanomethylicus)為優(yōu)勢菌群，在兩類井中的占比近90%。具有硫酸鹽還原功能的熱球菌(Thermococcus)在X1、X2中的豐度分別為1.51%和1.15%。由此可見，相比非治理井，硫化氫治理井中的硫酸鹽還原古菌熱球菌(Thermococcus)的豐度下降了23.84%，這說明BCX治理措施不僅對能夠還原硫酸鹽的細(xì)菌增殖有抑制作用，而且也能下調(diào)硫酸鹽還原古菌的菌群占比。

圖3 古菌相對豐度分布對比圖

2.3.3 熱力圖(Heatmap)聚類分析

圖4為樣品古菌相對豐度的熱力圖，色塊顏色越紅，該類型菌的豐度在樣品中越高。由圖4可知：硫化氫治理井X2與非治理井X1之間古生菌的組成存在明顯差異，活性相對較高的菌種有Methanosaeta、Methanothermobacter、Methanomethylicus和Thermococcus等；還可以看出Thermococcus(熱球菌)在X1井中的豐度要高于X2井中的。

色塊顏色梯度顯示樣品中各菌種的豐度，即顏色越紅，豐度越高

3 結(jié)論

我國海上油田微生物的防腐工作尚處于發(fā)展研究階段，充分認(rèn)識目標(biāo)油藏環(huán)境的微生物生態(tài)結(jié)構(gòu)和功能，是揭示油藏酸蝕機制和建立防護措施的必經(jīng)之路。本研究以渤海油田的硫化氫治理井為研究對象，借助高通量測序技術(shù)等分子生物學(xué)方法，得出以下結(jié)論：

1)對渤海S油田油藏古菌的群落結(jié)構(gòu)進行分析，找到了具有硫酸鹽還原作用的3種古菌：熱球菌(Thermococcales)、古球菌(Archaeoglobales)、脫硫球菌(Desulfurococcales)。

2)探究了硫酸鹽還原功能基因aprA、dsrA和dsrB在油田各類內(nèi)源微生物中的豐度情況，發(fā)現(xiàn)古球菌的占比在dsrA、dsrB中呈現(xiàn)優(yōu)勢，說明古球菌對異化型亞硫酸鹽還原反應(yīng)過程有著重要的影響。

3)分析了生物競爭抑制(BCX)對熱球菌豐度的影響，發(fā)現(xiàn)熱球菌在H2S治理井中的豐度要低于非治理井，說明BCX對硫酸鹽還原古菌產(chǎn)生了有效的抑制作用。

這些結(jié)果既為揭示油藏深部硫酸鹽還原反應(yīng)引發(fā)酸蝕效應(yīng)的機制提供了新視角，也有助于制定有針對性的油田次生H2S生物抑制策略。