史改玲，郭 瑩，李景輝，王國(guó)明，尹翠娟，李秋志，張翠英,

（1.工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2.承德避暑山莊企業(yè)集團(tuán)股份有限公司，河北 承德 067500）

中國(guó)傳統(tǒng)白酒以高粱、玉米、紅薯等高淀粉谷物為原料，酒曲作為糖化發(fā)酵劑，采用多菌種固態(tài)、半固態(tài)或液態(tài)發(fā)酵方式，結(jié)合蒸餾、勾調(diào)技術(shù)及后續(xù)貯存體系，給白酒帶來(lái)豐富的微量成分，這些成分或構(gòu)成白酒骨架香氣、或賦予白酒獨(dú)特風(fēng)格和口感、有的賦予白酒多種功效作用[1-2]。白酒中的萜烯類化合物具有重要生理功能或生物活性，如檸檬烯在酒體中能抑制蛋白質(zhì)的異戊二烯化，具有一定抗癌作用[3]；對(duì)傘花烴是右旋檸檬烯轉(zhuǎn)變來(lái)的芳香烴化合物，有緩解骨骼疼痛、促進(jìn)血液循環(huán)等功效[4-5]。Bourgou[6]、Wang Chungyi[7]、張倩[8]等國(guó)內(nèi)外學(xué)者通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證明了萜烯類化合物的抗氧化活性；Schepetkin等[9]研究表明一定濃度的萜烯類化合物還具有調(diào)節(jié)人體嗜中性粒細(xì)胞反應(yīng)的功效。酚類化合物不僅是白酒中重要的風(fēng)味物質(zhì)，更是一類具有生理活性的功能成分，4-甲基愈創(chuàng)木酚和4-乙基愈創(chuàng)木酚不僅是良好的抗氧化成分，還可以預(yù)防疾病、延緩衰老、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、降低血糖活性[10-12]；麝香草酚具有抗菌活性、祛痰治咳等作用[13]；異丁香酚具有抗氧化、防腐功效[14]。四甲基吡嗪是白酒中重要的健康功能因子，具有調(diào)節(jié)心臟收縮、抗氧化、保護(hù)大腦、預(yù)防脊髓損傷、抗腫瘤、預(yù)防糖尿病，修復(fù)損傷肝腎等作用[15-17]。亞油酸乙酯等高級(jí)脂肪酸酯，以膠體物膠核的形式存在于白酒中，進(jìn)入人體后分解成高級(jí)脂肪酸，降低膽固醇和血脂含量，能有效預(yù)防或減輕脈粥樣硬化癥狀[18]。

氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用技術(shù)因其分離效果好、分析速度快、樣品用量少和應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于白酒微量成分分析中，更是檢測(cè)微量功能成分的重要手段之一。劉奕霏等[18]建立了白酒中亞油酸乙酯的GC-MS檢測(cè)方法，該方法檢測(cè)高效、準(zhǔn)確、靈敏度高，能有效分析白酒中亞油酸乙酯含量。史冬梅等[19]利用GC-MS檢測(cè)103 種白酒中6 種酚類化合物，結(jié)果表明不同香型白酒中酚類化合物含量差異較大，濃香型和芝麻香型白酒中相對(duì)含量較高。李安軍等[20]采用頂空固相微萃取結(jié)合全二維氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用法檢測(cè)出白酒中吡嗪類、萜烯類、烯烴、酯類、有機(jī)酸等健康成分。

近年來(lái)白酒功能成分的研究日益受到各界學(xué)者的關(guān)注，但是多集中于白酒功能成分的定性分析或者特定某一類功能成分的定量分析，鮮有多種功能成分的綜合定量分析。本研究采用液液萃取-氣相色譜-質(zhì)譜-選擇離子掃描（liquid-liquid extraction-gas chromatography-mass spectrometry-selective ion monitoring，LLE-GC-MS-SIM）定量檢測(cè)20 種白酒中D-檸檬烯、對(duì)傘花烴、葉綠醇、4-甲基愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、麝香草酚、異丁香酚、四甲基吡嗪及亞油酸乙酯含量，旨在為白酒微量功能活性物質(zhì)的研究提供一定數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

20 種酒樣詳細(xì)信息見(jiàn)表1，酒樣W01～W09來(lái)自山莊酒廠，W10～W20為市售酒樣。標(biāo)準(zhǔn)品D-檸檬烯、對(duì)傘花烴、四甲基吡嗪、4-甲基愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、麝香草酚、異丁香酚、亞油酸乙酯、葉綠醇均購(gòu)自阿拉丁試劑（上海）有限公司。

表1 酒樣信息Table 1 Information of Baijiu samples tested in this study

1.2 儀器與設(shè)備

Trace 1310-ISQ氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)賽默飛公司；SE812型氮吹儀 北京帥恩科技有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品制備

以正己烷為溶劑配制亞油酸乙酯質(zhì)量濃度為100.00 mg/L，葉綠醇、麝香草酚、異丁香酚質(zhì)量濃度為10.00 mg/L，其余5 種物質(zhì)質(zhì)量濃度為50.00 mg/L的單標(biāo)母液，將這9 種單標(biāo)稀釋配制成亞油酸乙酯質(zhì)量濃度為10 mg/L，葉綠醇、麝香草酚、異丁香酚質(zhì)量濃度為1.00 mg/L，其余標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為5.00 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)母液并分別稀釋5、25、100、500、1 000 倍作為梯度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。

1.3.2 樣品前處理

超純水稀釋酒樣至乙醇體積分?jǐn)?shù)10%；吸取20 mL稀釋酒樣于100 mL分液漏斗中，分別用等量正己烷、乙醚、乙醚-戊烷（1∶1，V/V）分3 次萃取后合并有機(jī)相，加入無(wú)水硫酸鈉，－20 ℃條件下靜置吸水1 h后過(guò)濾得到純有機(jī)相，氮吹濃縮至2 mL，0.22 μm濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣，每個(gè)樣品3 次重復(fù)。

1.3.3 GC-MS檢測(cè)分析

色譜條件：Agilent InnonWax型毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.2 μm）；進(jìn)樣口溫度250 ℃，載氣為He，流速1 mL/min，不分流模式，進(jìn)樣量1 μL；升溫程序：50 ℃保持3 min，以4 ℃/min的速率升溫至170 ℃，保持2 min，再以6 ℃/min的速率升溫至230 ℃，保持5 min。

質(zhì)譜條件：電子電離源，電子能量70 eV；離子源溫度250 ℃，激活電壓1.5 V；溶劑延遲5 min；定性采用全掃描模式，掃描范圍30.00～350.00 u。

1.3.4 定量分析

定量采用SIM模式，以待定量物質(zhì)峰面積（y）為縱坐標(biāo)，待定量物質(zhì)質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性相關(guān)系數(shù)進(jìn)行評(píng)估，計(jì)算酒樣中功能成分的含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析及表格制作采用軟件Microsoft Excel。

2 結(jié)果與分析

2.1 SIM參數(shù)選擇

9 種功能成分標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖、質(zhì)譜圖如圖1、2所示，定量分析采用的SIM參數(shù)見(jiàn)表2。

圖1 9 種功能成分的總離子流色譜圖 Fig. 1 Total ion current chromatogram of nine functional components

表2 SIM模式參數(shù)Table 2 SIM parameters for nine functional components

圖2 9 種功能成分標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜圖Fig. 2 Mass spectra of nine functional component standards

2.2 線性范圍、檢出限和定量限

6 個(gè)梯度的功能成分混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行GC-MS分析，以質(zhì)量濃度-峰面積進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，9 種功能成分在各自的線性范圍內(nèi)R2均大于0.990 0，線性關(guān)系良好（表3）。以目標(biāo)化合物色譜峰信噪比大于3的質(zhì)量濃度確定為檢出限，信噪比大于10的質(zhì)量濃度確定為定量限，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 9 種功能成分的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限Table 3 Calibration curve equations, linear ranges, correlation coefficients, LODs and LOQs for nine functional components

2.3 回收率和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

制備亞油酸乙酯終質(zhì)量濃度為100、400、1 000 μg/L， 其余8 種功能性成分終質(zhì)量濃度為50、250、1 000 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，計(jì)算目標(biāo)化合物在特定質(zhì)量濃度下的回收率和精密度。表4表明，9 種功能性成分的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均低于6.00%，加標(biāo)回收率在81.80%～109.30%之間，表明該方法對(duì)于檢測(cè)這9 種功能成分具有很好的準(zhǔn)確性和精確性，完全能夠滿足分析要求。

表4 9 種功能成分的回收率和精密度Table 4 Recoveries and precision RSD for nine functional components

2.4 酒樣檢測(cè)結(jié)果

酒廠濃香型、醬香型、芝麻香型和市售濃香型共計(jì)20 種白酒酒樣的9 種微量功能成分定量分析結(jié)果如表5所示，典型酒樣的總離子流圖見(jiàn)圖3。白酒中的萜烯類物質(zhì)主要來(lái)源于兩方面：釀酒原料及大曲中含有的萜烯類化合物在微生物的作用下不斷溶入酒體；少數(shù)底物在某些微生物作用下發(fā)生特異性碳原子遷移和骨架重排反應(yīng)，從而轉(zhuǎn)化成萜烯類化合物[21]。山莊酒廠濃香型酒樣的D-檸檬烯質(zhì)量濃度在2 371.46～2 552.92 μg/L范圍內(nèi)，市售酒樣最高也可達(dá)到2 456.23 μg/L，醬香型酒樣含量不在檢測(cè)范圍內(nèi)，而芝麻香白酒中未檢測(cè)到，這可能是由于濃香型白酒用曲量較低，所以較好地保留了來(lái)自原料的萜烯類成分[22]。對(duì)傘花烴在20 種酒樣中均可被檢出，市售酒樣W17、W19及W20質(zhì)量濃度分別為27.77、40.80 μg/L及36.88 μg/L，其余17 種酒樣皆維持高水平（1 525.85～5 369.18 μg/L）。葉綠醇作為一種二萜類化合物，在酒廠酒樣及市售酒樣W11～W14和W16中被檢出，且在濃香型酒樣中含量較其他2 種香型豐富，W01樣品中質(zhì)量濃度高達(dá)5 643.23 μg/L。

表5 酒樣中9 種功能成分定量結(jié)果Table 5 Quantitative results of nine functional components in different Baijiu samples

圖3 典型樣品的總離子流色譜圖 Fig. 3 Total ion current chromatogram of typical Baijiu sample

酚類物質(zhì)或是由高粱、小麥、大曲等釀酒原料中的單寧、木質(zhì)素、蛋白質(zhì)等物質(zhì)分解而來(lái)，或經(jīng)由發(fā)酵過(guò)程中微生物直接代謝生成、或是由釀造過(guò)程中形成的氨基酸和阿魏酸等中間產(chǎn)物經(jīng)酵母菌或細(xì)菌代謝生成[23]。4-甲基愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、麝香草酚、異丁香酚是優(yōu)良的自由基清除劑，具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、提高免疫力、阻斷致癌物形成等功能[24-25]。 芝麻香型白酒的4-甲基愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚和異丁香酚質(zhì)量濃度范圍分別為1 153.08～2 086.04、1 202.05～1 273.91 μg/L和752.86～1 013.52 μg/L，顯著高于其他香型酒樣。Zheng Yang等[22]通過(guò)不同香型白酒的香氣重組和缺失實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，4-乙基愈創(chuàng)木酚在芝麻香型白酒中比重最高且其香味特點(diǎn)突出，香味保留時(shí)間長(zhǎng)，是名優(yōu)酒優(yōu)雅、醇厚等風(fēng)味的重要因素[26]。麝香草酚在20 種酒樣中含量差異較大，其中酒樣W11中質(zhì)量濃度最高，為108.51 μg/L。

20 種白酒中都檢測(cè)到四甲基吡嗪，但不同香型酒樣中含量差異顯著。醬香型酒樣中四甲基吡嗪含量最高（2 379.65～2 985.09 μg/L）；芝麻香型酒樣平均質(zhì)量濃度也能達(dá)到1 183.29 μg/L；濃香型中四甲基吡嗪含量最低至6.83 μg/L。孫嘯濤等[27]對(duì)67 種白酒的四甲基吡嗪含量分析也有相同結(jié)果：醬香型白酒最高質(zhì)量濃度可達(dá)到2 434.3 μg/L，濃香型白酒中四甲基吡嗪最低，僅為1.5 μg/L。醬香白酒釀造采用高溫制曲、高溫堆積、高溫發(fā)酵、高溫餾酒，發(fā)酵周期長(zhǎng)、貯存時(shí)間長(zhǎng)的“四高兩長(zhǎng)”工藝，糖與氨基酸在高溫釀造過(guò)程中發(fā)生美拉德反應(yīng)生成四甲基吡嗪，同時(shí)在芽孢桿菌、乳酸菌等微生物作用下，乙偶姻逐漸轉(zhuǎn)化生成四甲基吡嗪，并最終大量累積在醬香白酒酒體中[28]。

亞油酸乙酯隨著酒體進(jìn)入人體后，被水解或酶解成亞油酸，發(fā)揮降膽固醇、降血壓、抗血栓、抗氧化、抗癌以及提高記憶能力和免疫力等功效[29-30]，除市售酒樣W17、W19和W20外，其余酒樣中亞油酸乙酯質(zhì)量濃度為1 951.96～7 183.35 μg/L，與劉奕霏等[18]在5 種市售白酒中檢測(cè)到的6.2～8.0 mg/L結(jié)果基本一致。不同香型白酒大曲、原料及生產(chǎn)工藝大相徑庭，亞油酸乙酯含量差異顯著。同一種香型的白酒雖然生產(chǎn)工藝相似，但是由于產(chǎn)地、水質(zhì)、氣候等不同，導(dǎo)致同一香型不同品牌白酒具有不同的亞油酸乙酯含量。

3 結(jié) 論

GC-MS-SIM方法具有檢測(cè)快速、準(zhǔn)確性高、專一性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用該方法對(duì)20 種白酒中的9 種微量功能成分定量分析結(jié)果表明，3 種萜烯類物質(zhì)在濃香型酒樣中含量較高，且在山莊酒廠酒樣中含量普遍高于市售酒樣；4 種酚類物質(zhì)在芝麻香型白酒中含量最高；四甲基吡嗪在醬香型酒樣中含量較高，芝麻香型酒樣次之，在濃香型酒樣中含量最低；亞油酸乙酯在不同香型及不同品牌酒樣中含量差異較大，上述研究結(jié)果可為白酒微量功能成分研究提供一定數(shù)據(jù)支持。白酒是中華民族幾千年來(lái)智慧的結(jié)晶和瑰寶，其中的微量功能成分還有很多值得挖掘和研究之處，例如這些功能成分的產(chǎn)生機(jī)制、作用機(jī)制及酒體中組成成分的結(jié)構(gòu)優(yōu)化、互相配伍、拮抗機(jī)制等，這是中國(guó)白酒匠人和學(xué)術(shù)研究者現(xiàn)階段甚至未來(lái)幾十年的研究重點(diǎn)之一，也是中國(guó)白酒進(jìn)一步走向世界的強(qiáng)大助力。