郝夢(mèng)真，畢 源，宋若琳，陳 錫，車(chē)會(huì)蓮

（食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

2000年初，樹(shù)堅(jiān)果過(guò)敏已成為公眾關(guān)注的公共衛(wèi)生問(wèn)題[1]，核桃過(guò)敏是常見(jiàn)的樹(shù)堅(jiān)果過(guò)敏類(lèi)型。隨著核桃進(jìn)口貿(mào)易的不斷擴(kuò)大，核桃過(guò)敏問(wèn)題也逐漸加劇，以韓國(guó)為例，截止到2016年核桃已成為引起韓國(guó)兒童過(guò)敏反應(yīng)的第三大常見(jiàn)食物[2]。目前，過(guò)敏原數(shù)據(jù)庫(kù)中已收錄了11 種核桃相關(guān)的過(guò)敏原，包括英國(guó)胡桃中的Jug r 1、Jug r 2、Jug r 3、Jug r 4、Jug r 5、Jug r 6、Jug r 6、Jug r 8。

Teuber等[3]對(duì)英國(guó)核桃中的過(guò)敏原Jug r 1進(jìn)行體外表達(dá)，發(fā)現(xiàn)約75%的核桃過(guò)敏患者血清可與Jug r 1識(shí)別結(jié)合，說(shuō)明Jug r 1是英國(guó)核桃中的主要過(guò)敏原。Jug r 1中的抗原表位具有與過(guò)敏患者血清IgE結(jié)合的活性。Wangorsch等[4]發(fā)現(xiàn)，過(guò)敏原表位中某些氨基酸殘基對(duì)過(guò)敏原結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和過(guò)敏原IgE結(jié)合活性有關(guān)鍵性作用，因此尋找過(guò)敏原表位中的關(guān)鍵氨基酸對(duì)認(rèn)識(shí)過(guò)敏原的結(jié)構(gòu)和生產(chǎn)低致敏性蛋白有重要意義。

目前，可使用不同的方法預(yù)測(cè)或識(shí)別過(guò)敏原表位中的關(guān)鍵氨基酸。免疫信息學(xué)分析是新興的預(yù)測(cè)手段?；谀繕?biāo)表位中不同氨基酸的理化性質(zhì)、相對(duì)頻率和保守程度[5-7]，免疫信息學(xué)的方法可對(duì)目標(biāo)表位中的關(guān)鍵氨基酸進(jìn)行預(yù)測(cè)。采用免疫信息學(xué)預(yù)測(cè)表位關(guān)鍵氨基酸以進(jìn)一步縮小表位中關(guān)鍵氨基酸的范圍，進(jìn)而降低定點(diǎn)突變的盲目性。然而，在表位中預(yù)測(cè)的關(guān)鍵氨基酸對(duì)表位與IgE結(jié)合活性的影響需進(jìn)一步驗(yàn)證。丙氨酸掃描誘變法是研究抗原表位關(guān)鍵氨基酸的重要方法，即用丙氨酸依次取代作用表位的氨基酸合成新的多肽[8]，然后采用酶聯(lián)免疫吸附分析法識(shí)別降低過(guò)敏原致敏性的關(guān)鍵氨基酸。丙氨酸是蛋白質(zhì)中最簡(jiǎn)單的中性氨基酸，由于其缺乏特殊的主鏈二面角偏好不會(huì)使原蛋白失活，而氨基酸中結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的甘氨酸由于其側(cè)鏈組成簡(jiǎn)單，會(huì)使蛋白質(zhì)主鏈具有構(gòu)象靈活性。因此丙氨酸常用于氨基酸替代方法中以構(gòu)建丙氨酸掃描突變體[9]。利用免疫信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)合丙氨酸掃描誘變法可提高過(guò)敏原表位關(guān)鍵氨基酸研究可信度。

本課題組之前研究[10]已采用固相肽合成法結(jié)合斑點(diǎn)免疫印跡分析識(shí)別核桃過(guò)敏原Jug r 1的表位1、2、3共3 個(gè)線(xiàn)性表位區(qū)域，即4LVALLFVANAAA15、16FRTTITTMEIDEDID30、125CGISSQRCEIRRSWF139，依次記為Jug r 1-01、Jug r 1-02、Jug r 1-03。為分析上述 3 個(gè)線(xiàn)性表位區(qū)域的關(guān)鍵氨基酸，本研究通過(guò)2 種免疫信息學(xué)分析軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)，并結(jié)合丙氨酸掃描誘變法識(shí)別 Jug r 1的線(xiàn)性表位中的關(guān)鍵氨基酸。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA） 北京索萊寶科技有限公司；96 孔聚苯乙烯酶標(biāo)板 美國(guó)Costar公司；抗人IgE（ε-鏈特異性）-過(guò)氧物酶山羊抗體 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；快速化學(xué)發(fā)光試劑 美國(guó)Merck公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Varloskan Flash多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；高效液相C18柱 美國(guó)Vydac公司。

1.3 方法

1.3.1 核桃過(guò)敏患者血清的收集

本研究共招募10 名受試者，其中6 名為核桃過(guò)敏患者，通過(guò)病人自述攝入核桃后的癥狀和病史確定其對(duì)核桃存在過(guò)敏反應(yīng)?；颊呔唧w信息見(jiàn)表1，研究目的和方法已告知所有受試者，采血過(guò)程征得了所有受試者的同意。采集的血樣37 ℃孵育1 h，于4 ℃、4 000×g離心10 min，取上清液，分裝編號(hào)，置于－80 ℃保存。

表1 核桃過(guò)敏患者信息Table 1 Information of walnut-allergic patients recruited for this study

1.3.2 突變肽段的合成、純化和鑒定

根據(jù)過(guò)敏患者識(shí)別出的3 個(gè)Jug r 1的抗原表位（4LVALLFVANAAA15、16FRTTITTMEIDEDID30、125CGISSQRCEIRRSWF139）的氨基酸序列，依次使用丙氨酸進(jìn)行替代，若原氨基酸序列中氨基酸為丙氨酸，則使用甘氨酸進(jìn)行替代，用9-芴甲氧羰基（fiuorenylmethoxy carbony，F(xiàn)moc）固相合成法合成突變表位肽段[11]。高效液相色譜法測(cè)定的肽純度大于95%。 合成肽分子質(zhì)量通過(guò)電噴霧電離-質(zhì)譜確認(rèn)[12]， 于－20 ℃保存。

1.3.3 Bioedit軟件對(duì)抗原表位區(qū)域的關(guān)鍵氨基酸的預(yù)測(cè)

采用Bioedit軟件對(duì)Jug r 1蛋白序列全長(zhǎng)的氨基酸組成和出現(xiàn)頻率進(jìn)行分析，再運(yùn)用該軟件對(duì)Jug r 1中的3 個(gè)抗原表位區(qū)域的氨基酸組成和出現(xiàn)頻率進(jìn)行分析。通過(guò)對(duì)比各類(lèi)氨基酸分別在Jug r 1蛋白質(zhì)全長(zhǎng)和抗原表位區(qū)域出現(xiàn)頻率的變化，預(yù)測(cè)主要活性氨基酸。

1.3.4 DNAstar軟件對(duì)抗原表位區(qū)域的關(guān)鍵氨基酸的預(yù)測(cè)

采用DNAstar Protean軟件對(duì)3 個(gè)抗原表位區(qū)域的氨基酸進(jìn)行親水性、表面可及性、柔韌性及抗原指數(shù)分析，選擇抗原表位區(qū)域中同時(shí)滿(mǎn)足4 個(gè)參數(shù)條件的氨基酸（親水性＞0、表面可及指數(shù)＞1、柔韌性＞0、抗原指數(shù)＞0），作為預(yù)測(cè)的關(guān)鍵氨基酸。

1.3.5 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)試法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）測(cè)定突變表位肽的IgE結(jié)合能力

參考Cocco等[13]的研究方法，通過(guò)直接ELISA識(shí)別IgE作用表位和關(guān)鍵氨基酸。以3 個(gè)抗原表位肽為陽(yáng)性對(duì)照，以未加抗原的溶劑組為陰性對(duì)照。將合成的凍干肽粉末溶于100%二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）中，使其質(zhì)量濃度為3 mg/mL；用配好的突變表位肽段溶液包被96 孔板，每孔100 μL，4 ℃過(guò)夜孵育后，用洗滌液PBST（1 mL吐溫-20與1 000 mL磷酸鹽緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS））洗滌4 次，每次3 min；加入封閉液（1.0 g BSA與100 mL PBS）在37 ℃封閉2 h，用PBST洗滌3 次，每次3 min；加入一抗反應(yīng)液（過(guò)敏患者血清1∶10稀釋?zhuān)逑♂屢?.1 g BSA/100 mL PBS）37 ℃孵育2 h后，用PBST洗滌3 次；用生物素標(biāo)記的山羊抗人IgE抗體37 ℃孵育1 h后，用PBST洗滌3 次；加入HRP標(biāo)記的鏈霉親和素在37 ℃孵育1 h后，用PBST洗滌6 次；加入TMB顯色液，在37 ℃顯色10～15 min后，加入2 mol/L硫酸溶液終止反應(yīng)；用酶標(biāo)儀測(cè)定其在450 nm波長(zhǎng)處的OD值。

1.3.6 Jug r 1三級(jí)結(jié)構(gòu)分析及關(guān)鍵氨基酸定位

在Protein Data Bank，使用BLAST搜索已知的蛋白質(zhì)為模板[14]。Ber e 1與Jug r 1進(jìn)行蛋白質(zhì)BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)具有約45%的相似度，符合建模標(biāo)準(zhǔn)。采用2S白蛋白的SWISS-MODEL網(wǎng)站中的比對(duì)模式作為模板，建立了較為準(zhǔn)確的三維模型[15]。通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)模擬和能量最小化，得到了Jug r 1的三維模型。由于Jug r 1的N端區(qū)域與建模模板Ber e 1存在顯著差異，因此在Jug r 1的模型省略此部分，而從高度相似的殘基36開(kāi)始。采用可視化軟件RasMol查看Jug r 1線(xiàn)性表位和線(xiàn)性表位中關(guān)鍵氨基酸在三級(jí)結(jié)構(gòu)中的位置。

1.4 數(shù)據(jù)分析

統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行，所有實(shí)驗(yàn)均做3 次平行。使用方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)間差異水平的分析，以Kruskal-Wallis檢驗(yàn)置信水平，95%為顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 Bioedit軟件對(duì)抗原表位的關(guān)鍵氨基酸預(yù)測(cè)結(jié)果

采用Bioedit軟件分析Jug r 1及其3 個(gè)線(xiàn)性表位的一級(jí)序列中各類(lèi)氨基酸的出現(xiàn)頻率，由圖1可看出，在過(guò)敏原Jug r 1的整個(gè)序列中含有19 種氨基酸，缺少賴(lài)氨酸，最多的是L-谷氨酰胺（Q）和精氨酸（R）；在過(guò)敏原Jug r 1的3 個(gè)線(xiàn)性表位區(qū)域中含有丙氨酸（A）、半胱氨酸（C）、天冬氨酸（D）、谷氨酸（E）、苯丙氨酸（F）、甘氨酸（G）、組氨酸（H）、異亮氨酸（I）、賴(lài)氨酸（K）、亮氨酸（L）、蛋氨酸（M）、天冬氨酸（N）、脯氨酸（P）、谷氨酰胺（Q）、精氨酸（R）、絲氨酸（S）、蘇氨酸（T）、纈氨酸（V）、色氨酸（W）、酪氨酸（Y）共16 種氨基酸，組成全蛋白序列的酪氨酸（Y）、組氨酸（H）和脯氨酸（P）沒(méi)有出現(xiàn)。若某種氨基酸在表位區(qū)域中的出現(xiàn)頻率高于蛋白全長(zhǎng)區(qū)域中的出現(xiàn)頻率，表明該氨基酸殘基在表位區(qū)域中起重要作用，其可能為關(guān)鍵氨基酸[16]。丙氨酸（A）、天冬氨酸（D）、苯丙氨酸（F）、異亮氨酸（I）、絲氨酸（S）、蘇氨酸（T）、纈氨酸（V）、色氨酸（W）在表位區(qū)域中出現(xiàn)的頻率高于蛋白全長(zhǎng)區(qū)域，其極有可能為關(guān)鍵活性氨基酸，結(jié)合上述氨基酸在3 個(gè)線(xiàn)性表位出現(xiàn)的位置，預(yù)測(cè)6A、10V、11A、13-15A、16F、20I、26D、28D、30D、127I、128-129S、137S、138W、139F。

圖1 核桃過(guò)敏原Jug r 1及其3 個(gè)線(xiàn)性表位區(qū)域的氨基酸分布情況Fig. 1 Distribution of amino acids in Jug r 1 and its three liner epitope regions

2.2 DNAstar軟件對(duì)抗原表位的關(guān)鍵氨基酸預(yù)測(cè)結(jié)果

在獲得Jug r 1的3 個(gè)線(xiàn)性表位的氨基酸序列的基礎(chǔ)上，采用DNAstar Protean軟件對(duì)其一級(jí)結(jié)構(gòu)的親水性、表面可及性、柔韌性以及抗原指數(shù)進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)4 個(gè)可能位點(diǎn)，結(jié)果見(jiàn)表1。按Kyte等[17]的氨基酸親水性標(biāo)準(zhǔn)分析Jug r 1的3 個(gè)線(xiàn)性表位的親水性，親水性指數(shù)大于0則親水性較理想；根據(jù)Emini等[18]分析Jug r 1的3 個(gè)線(xiàn)性表位的表面可及性方法，以表面可及指數(shù)大于1（即區(qū)域位于蛋白質(zhì)表面）為篩選標(biāo)準(zhǔn)；按Karplus-Schulz法[19]對(duì)Jug r 1的柔性區(qū)域進(jìn)行分析；根據(jù)Jameson等[20]分析Jug r 1的3 個(gè)線(xiàn)性表位的潛在抗原表位方法，以抗原指數(shù)大于0為篩選條件。采用DNAstar軟件預(yù)測(cè)Jug r 1的3 個(gè)線(xiàn)性抗原表位中關(guān)鍵氨基酸的結(jié)果如表2所示。

表2 DNAstar軟件預(yù)測(cè)Jug r 1的3 個(gè)線(xiàn)性抗原表位關(guān)鍵氨基酸Table 2 Key amino acids in three epitopes of Jug r 1 predicted by DNAstar

2.3 突變表位肽的合成及其與IgE的結(jié)合能力分析

為了研究2 種免疫信息學(xué)方法預(yù)測(cè)線(xiàn)性表位中關(guān)鍵氨基酸的準(zhǔn)確性，確定Jug r 1的3 個(gè)線(xiàn)性表位中影響表位IgE結(jié)合活性的真實(shí)關(guān)鍵氨基酸，本實(shí)驗(yàn)對(duì)3 個(gè)線(xiàn)性表位進(jìn)行氨基酸定點(diǎn)突變，在線(xiàn)性表位肽中將每個(gè)氨基酸轉(zhuǎn)化為丙氨酸或甘氨酸，并通過(guò)核桃過(guò)敏患者的血清檢測(cè)這些突變肽的免疫反應(yīng)性。

根據(jù)之前研究[10]得到的6 名核桃過(guò)敏患者血清中特異性IgE抗體識(shí)別的抗原表位氨基酸序列，重新合成了42 個(gè)突變表位肽，結(jié)果如表3所示。

表3 突變表位肽段Table 3 Synthetic mutant epitope peptides

續(xù)表3

采用ELISA法檢測(cè)Jug r 1-01、Jug r 1-02、Jug r 1-03的3 種突變表位肽段與過(guò)敏患者血清中特異性IgE抗體的結(jié)合情況，結(jié)果分別如圖2～4所示，其中陰性肽段均為AAAAAAAAAAAAAAA。

圖2 IgE對(duì)Jug r 1表位1的12 個(gè)突變肽的反應(yīng)性分析Fig. 2 Analysis of IgE reactivity to 12 mutant peptides from epitope 1 of Jug r 1

用丙氨酸或甘氨酸依次取代Jug r 1表位1中的氨基酸合成突變表位肽，分別用6 名核桃過(guò)敏患者血清為抗體識(shí)別新合成的突變表位肽，分別以Jug r 1-01為陽(yáng)性對(duì)照，以溶劑為陰性對(duì)照，測(cè)得450 nm波長(zhǎng)處OD值如圖2A所示，匯總各名核桃過(guò)敏患者血清IgE對(duì)12 個(gè)突變表位肽的反應(yīng)性得圖2B，以6 名核桃過(guò)敏患者血清IgE的反應(yīng)性均為陰性為篩選標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)關(guān)鍵氨基酸進(jìn)行識(shí)別。由圖2B可知，Jug r 1表位1肽段1-1、1-4、1-5對(duì)應(yīng)表3中第4、7、8位的亮氨酸被丙氨酸替代（L4A、L7A、L8A）后與6 名患者血清IgE的結(jié)合活性均顯著降低（P＜0.01），而該肽段上的其他氨基酸被替代后仍會(huì)出現(xiàn)至少1 例IgE結(jié)合陽(yáng)性的情況。

運(yùn)用同樣的方法確定了Jug r 1表位2、表位3上的關(guān)鍵氨基酸，結(jié)果分別如圖3A、4A所示，匯總后分別得到圖3B、4B。由圖3B可知，Jug r 1表位2肽段2-5、2-6、2-13對(duì)應(yīng)表3中第20位異亮氨酸、第21位蘇氨酸、第28位天冬氨酸分別被丙氨酸替代（I20A、T21A、D28A）后，與6 名患者血清IgE的結(jié)合活性均顯著降低（P＜0.01）。由圖4B可知，Jug r 1表位3肽段3-3、3-5、3-6對(duì)應(yīng)表3中第127位異亮氨酸、第129位絲氨酸、第130位谷氨酰胺分別被丙氨酸替代（I127A、S129A、Q130A）后，與6 名患者血清IgE的結(jié)合活性均顯著降低（P＜0.01）。

圖3 IgE對(duì)Jug r 1表位2的15 個(gè)突變肽的反應(yīng)性分析Fig. 3 Analysis of IgE reactivity to 15 mutant peptides from epitope 2 of Jug r 1

圖4 IgE對(duì)Jug r 1表位3的15 個(gè)突變肽的反應(yīng)性分析Fig. 4 Analysis of IgE reactivity to 15 mutant peptides from epitope 3 of Jug r 1

基于上述丙氨酸掃描誘變法，得到Jug r 1的3 個(gè)線(xiàn)性表位中影響表位免疫反應(yīng)性的關(guān)鍵氨基酸為第4位亮氨酸、第7位亮氨酸、第8位亮氨酸、第20位異亮氨酸、第21位蘇氨酸、第28位天冬氨酸、第127位異亮氨酸、第129位絲氨酸、第130位谷氨酰胺。由于線(xiàn)性表位1、2不在建模范圍內(nèi)，因此無(wú)法在空間結(jié)構(gòu)上標(biāo)注其關(guān)鍵氨基酸。僅對(duì)表位3及其關(guān)鍵氨基酸在蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)上的位置進(jìn)行了標(biāo)注，結(jié)果如圖5所示。

圖5 Jug r 1的正（A）、反（B）面三維結(jié)構(gòu)Fig. 5 Front (A) and back (B) view of 3D structure of Jug r 1

3 討 論

Jug r 1是英國(guó)核桃中的2S白蛋白，分子質(zhì)量為15～16 kDa[3]。2S白蛋白被描述為堅(jiān)果中的主要過(guò)敏原，如巴西堅(jiān)果（Ber e 1）、榛子（Cor a 14）、開(kāi)心果（Pis v 1）、腰果（Ana o 3）[21]。這種小體積的蛋白質(zhì)過(guò)敏原以種子貯藏蛋白[22]的形式大量存在于許多可食用的樹(shù)堅(jiān)果中，并參與樹(shù)堅(jiān)果中的交叉反應(yīng)性[23-24]。Chou等[25]發(fā)現(xiàn)，表位上的關(guān)鍵氨基酸是引起不同過(guò)敏原交叉過(guò)敏反應(yīng)的原因。目前鮮見(jiàn)不同樹(shù)堅(jiān)果中2S白蛋白過(guò)敏原表位中關(guān)鍵氨基酸的研究，免疫信息學(xué)預(yù)測(cè)法和丙氨酸掃描誘變法為關(guān)鍵氨基酸的預(yù)測(cè)和識(shí)別提供技術(shù)參考。本研究對(duì)英國(guó)核桃中的2S白蛋白過(guò)敏原線(xiàn)性表位中的關(guān)鍵氨基酸識(shí)別，有利于認(rèn)識(shí)其他樹(shù)堅(jiān)果中2S白蛋白過(guò)敏原表位和不同樹(shù)堅(jiān)果的交叉過(guò)敏反應(yīng)。除此之外，Deus-De-Oliveira等[26]采用蓖麻子2S白蛋白過(guò)敏原Ric c31和Ric c 3的關(guān)鍵氨基酸阻斷了肥大細(xì)胞上IgE與過(guò)敏原結(jié)合，因此過(guò)敏原關(guān)鍵氨基酸的鑒定可為游離氨基酸治療變態(tài)反應(yīng)提供依據(jù)。

Jug r 1的線(xiàn)性表位的研究始于2002年，Robotham等[27]采用20 名核桃過(guò)敏患者血清識(shí)別得到Jug r 1的1 個(gè)線(xiàn)性表位105GLRGEEMEEMVQS117，并鑒定其中的關(guān)鍵氨基酸為107R、108G、109E、110E、113E。在2009年，Sordet等[28]采用3 名核桃過(guò)敏患者血清識(shí)別了4 個(gè)線(xiàn)性表位，分別為6IDNPRR11、42YDEDNQRQH50、72QVVRRQQQQ80、102CGISSQRCEIRR113。畢源等[10]使用6名核桃過(guò)敏患者血清識(shí)別出3 個(gè)Jug r 1的抗原表位4LVALLFVANAAA15、16FRTTITTMEIDEDID30、125CGISSQRCEIRRSWF139，其中表位2和表位3與 文獻(xiàn)[27-28]識(shí)別的位置不同。因此，本研究對(duì)Jug r 1線(xiàn)性表位中的關(guān)鍵氨基酸進(jìn)行識(shí)別，以補(bǔ)充對(duì)核桃過(guò)敏原Jug r 1線(xiàn)性表位致敏性的認(rèn)識(shí)。本研究確定的抗原表位的關(guān)鍵氨基酸中，亮氨酸（L）和異亮氨酸（I）均為中性疏水氨基酸，Shin等[29]發(fā)現(xiàn)相比極性或帶電荷氨基酸，疏水性氨基酸在花生過(guò)敏原Ara h 1表位肽的突變更容易引起表位與IgE結(jié)合活性的改變。除此之外，在針對(duì)α-乳白蛋白[12]、β-酪蛋白和β-乳球蛋白[30]過(guò)敏原表位中關(guān)鍵氨基酸識(shí)別研究中也發(fā)現(xiàn)了亮氨酸和（或）異亮氨酸是線(xiàn)性表位中的關(guān)鍵氨基酸，這可能與疏水氨基酸在維持蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中的作用有關(guān)。除此之外，本研究還發(fā)現(xiàn)蘇氨酸（T）、絲氨酸（S）和谷氨酰胺（Q）也是Jug r 1線(xiàn)性表位中的關(guān)鍵氨基酸，這3 種氨基酸均為極性、不帶電荷的氨基酸，這類(lèi)氨基酸帶有極性基團(tuán)，因此其比疏水氨基酸更容易溶于水，且此類(lèi)氨基酸的側(cè)鏈基團(tuán)易形成二硫鍵，二硫鍵對(duì)于維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性有重要作用。天冬氨酸（D）也是本研究識(shí)別的關(guān)鍵氨基酸，F(xiàn)u Linglin等[7]發(fā)現(xiàn)天冬氨酸同樣是中國(guó)對(duì)蝦中原肌球蛋白和精氨酸激酶共2 種過(guò)敏原線(xiàn)性表位中的關(guān)鍵氨基酸，天冬氨酸是帶負(fù)電的酸性氨基酸，增強(qiáng)線(xiàn)性表位的負(fù)電密度也可能提高肽的致敏性。

如今，免疫信息預(yù)測(cè)、氨基酸定點(diǎn)突變技術(shù)是預(yù)測(cè)和研究過(guò)敏原表位中關(guān)鍵氨基酸的重要方法。免疫信息學(xué)的預(yù)測(cè)可為表位中氨基酸定點(diǎn)突變節(jié)約時(shí)間、經(jīng)濟(jì)成本，但免疫信息學(xué)的預(yù)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)不同會(huì)導(dǎo)致預(yù)測(cè)位點(diǎn)與實(shí)際關(guān)鍵氨基酸之間的差異。因此本研究使用Bioedit對(duì)Jug r 1及其3 個(gè)線(xiàn)性表位中氨基酸種類(lèi)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，通過(guò)分析各類(lèi)氨基酸在蛋白和表位出現(xiàn)頻率預(yù)測(cè)關(guān)鍵氨基酸的潛在種類(lèi)，并結(jié)合Jug r 1的3 個(gè)線(xiàn)性表位的氨基酸序列預(yù)測(cè)潛在關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)。除此之外，本實(shí)驗(yàn)使用了預(yù)測(cè)B細(xì)胞線(xiàn)性表位常用的免疫信息學(xué)工具DNAstar，通過(guò)分析表位親水性、表面可及性、柔韌性以及抗原指數(shù)預(yù)測(cè)Jug r 1的3 個(gè)線(xiàn)性表位中關(guān)鍵氨基酸的潛在位點(diǎn)。預(yù)測(cè)效率、準(zhǔn)確率是評(píng)價(jià)免疫信息學(xué)工具預(yù)測(cè)效果的重要指標(biāo)。本研究中預(yù)測(cè)效率為通過(guò)免疫信息學(xué)工具預(yù)測(cè)到真實(shí)關(guān)鍵氨基酸的比例，預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率為免疫信息學(xué)工具預(yù)測(cè)得到的潛在關(guān)鍵氨基酸中真實(shí)關(guān)鍵氨基酸所占比例。免疫信息學(xué)的預(yù)測(cè)效率高，但更容易出現(xiàn)假陽(yáng)性的結(jié)果；預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率高，但更容易出現(xiàn)假陰性的結(jié)果。因此，在采用免疫信息學(xué)對(duì)過(guò)敏原線(xiàn)性表位中的關(guān)鍵氨基酸進(jìn)行研究時(shí)，可結(jié)合后續(xù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適預(yù)測(cè)效率、準(zhǔn)確率的免疫信息學(xué)工具。例如，為降低實(shí)驗(yàn)的盲目性可選擇預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率更高的預(yù)測(cè)工具，或者采用多種預(yù)測(cè)工具結(jié)合的策略。為更全面地發(fā)現(xiàn)過(guò)敏原線(xiàn)性表位中的關(guān)鍵氨基酸可選擇預(yù)測(cè)效率更高的預(yù)測(cè)工具，以減少遺漏關(guān)鍵氨基酸的情況。本研究對(duì)2 種免疫信息學(xué)方法預(yù)測(cè)的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)與丙氨酸掃描誘變法識(shí)別的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行了比較，前者的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率為23.53%，預(yù)測(cè)效率為44.44%，后者的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性18.18%，預(yù)測(cè)效率為22.22%。這2 種免疫信息學(xué)預(yù)測(cè)方法共同篩選出的關(guān)鍵氨基酸為28D，采用2 種免疫信息學(xué)方法結(jié)合的方式得到的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率為100%，而預(yù)測(cè)效率僅為11.11%。使用免疫信息學(xué)方法預(yù)測(cè)在提高關(guān)鍵氨基酸識(shí)別效率的同時(shí)，會(huì)因預(yù)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的不同而出現(xiàn)一些關(guān)鍵氨基酸被忽略的情況，導(dǎo)致對(duì)表位中關(guān)鍵氨基酸的識(shí)別不夠全面。所以，免疫信息學(xué)預(yù)測(cè)選擇的參數(shù)或標(biāo)準(zhǔn)很重要。為了提高預(yù)測(cè)性能，常結(jié)合多種過(guò)敏原特征進(jìn)行綜合分析，例如使用BepiPred、BCPred、SVMTriP、LBtope、 APCPred等B細(xì)胞線(xiàn)性表位預(yù)測(cè)工具可對(duì)過(guò)敏原線(xiàn)性表位進(jìn)行預(yù)測(cè)[31]。這些預(yù)測(cè)工具均基于蛋白質(zhì)中氨基酸的親水性、電荷、暴露表面積和二級(jí)結(jié)構(gòu)等性質(zhì)展開(kāi)的預(yù)測(cè)[32]， 而這些性質(zhì)與抗原的免疫反應(yīng)性有密切關(guān)系[33-34]，因此這些工具也可用于預(yù)測(cè)B細(xì)胞線(xiàn)性表位中的關(guān)鍵氨基酸。通過(guò)篩選同類(lèi)蛋白在不同物種間的保守氨基酸也是預(yù)測(cè)過(guò)敏原關(guān)鍵氨基酸的方法[7]。選擇不同的工具和標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行綜合分析可實(shí)現(xiàn)多維預(yù)測(cè)，有利于提高預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性，但也可能降低預(yù)測(cè)效率。免疫信息學(xué)軟件分析結(jié)果與實(shí)際存在差異，因此免疫信息學(xué)軟件分析結(jié)果需結(jié)合其他實(shí)驗(yàn)方法共同確定抗原表位的關(guān)鍵氨基酸。

本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，用不同患者的血清識(shí)別的關(guān)鍵氨基酸有所差異，例如在表位3上的第128號(hào)絲氨酸被丙氨酸替代后，1號(hào)患者血清與突變肽的結(jié)合強(qiáng)度未發(fā)生顯著變化，而剩余5 名患者血清與突變肽的結(jié)合強(qiáng)度均不同程度地降低，表位中關(guān)鍵氨基酸與患者IgE之間的結(jié)合存在異質(zhì)性[30]，且表位中關(guān)鍵氨基酸與IgE結(jié)合的異質(zhì)性也可能導(dǎo)致免疫信息學(xué)預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度和效率的下降。因此，對(duì)于核桃主要過(guò)敏原Jug r 1線(xiàn)性表位的關(guān)鍵氨基酸仍需更多患者血清進(jìn)一步識(shí)別，從而更準(zhǔn)確評(píng)估以氨基酸出現(xiàn)頻率和（或）抗原性質(zhì)為參數(shù)預(yù)測(cè)表位中關(guān)鍵氨基酸的準(zhǔn)確率和效率。突變表位肽與IgE結(jié)合存在異質(zhì)性可能與一些單點(diǎn)關(guān)鍵氨基酸并不屬于IgE與Jug r 1表位肽的接觸位點(diǎn)有關(guān)，這些單點(diǎn)氨基酸可能對(duì)表位的立體化學(xué)環(huán)境產(chǎn)生空間體積效應(yīng)[35]，這需要使用具有不同空間容積的氨基酸替代進(jìn)一步研究IgE結(jié)合表位中的關(guān)鍵氨基酸。

4 結(jié) 論

核桃作為樹(shù)堅(jiān)果，對(duì)其線(xiàn)性表位的關(guān)鍵氨基酸尚未得到深入的研究。本研究采用2 種免疫信息學(xué)方法快速預(yù)測(cè)抗原表位，比較了2 種方法的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性，發(fā)現(xiàn)免疫信息學(xué)預(yù)測(cè)的方法一定程度上可降低突變肽合成時(shí)間、經(jīng)濟(jì)成本，但可能遺漏一些關(guān)鍵氨基酸，因此丙氨酸掃描誘變法是識(shí)別表位中關(guān)鍵氨基酸的準(zhǔn)確方法。本研究采用丙氨酸掃描誘變通過(guò)部分中國(guó)核桃過(guò)敏患者血清，識(shí)別了核桃主要過(guò)敏原Jug r 1的B細(xì)胞線(xiàn)性表位中的關(guān)鍵氨基酸，分別為表位1（4LVALLFVANAAA15）中的第4位亮氨酸、第7位亮氨酸、第8位亮氨酸，表位2（16FRTTITTMEIDEDID30）中的第20位異亮氨酸、第21位蘇氨酸、第22位異亮氨酸，表位3（125CGISSQRCEIRRSWF139）中的第127位異亮氨酸、第129位絲氨酸、第130位谷氨酰胺。本研究豐富了對(duì)核桃等堅(jiān)果過(guò)敏原的認(rèn)識(shí)，為預(yù)防和治療核桃過(guò)敏以及在食品加工過(guò)程中消除等位基因提供參考。