郝夢真，畢 源，宋若琳，陳 錫，車會蓮

（食品質(zhì)量與安全北京實驗室，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

2000年初，樹堅果過敏已成為公眾關(guān)注的公共衛(wèi)生問題[1]，核桃過敏是常見的樹堅果過敏類型。隨著核桃進口貿(mào)易的不斷擴大，核桃過敏問題也逐漸加劇，以韓國為例，截止到2016年核桃已成為引起韓國兒童過敏反應(yīng)的第三大常見食物[2]。目前，過敏原數(shù)據(jù)庫中已收錄了11 種核桃相關(guān)的過敏原，包括英國胡桃中的Jug r 1、Jug r 2、Jug r 3、Jug r 4、Jug r 5、Jug r 6、Jug r 6、Jug r 8。

Teuber等[3]對英國核桃中的過敏原Jug r 1進行體外表達，發(fā)現(xiàn)約75%的核桃過敏患者血清可與Jug r 1識別結(jié)合，說明Jug r 1是英國核桃中的主要過敏原。Jug r 1中的抗原表位具有與過敏患者血清IgE結(jié)合的活性。Wangorsch等[4]發(fā)現(xiàn)，過敏原表位中某些氨基酸殘基對過敏原結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和過敏原IgE結(jié)合活性有關(guān)鍵性作用，因此尋找過敏原表位中的關(guān)鍵氨基酸對認識過敏原的結(jié)構(gòu)和生產(chǎn)低致敏性蛋白有重要意義。

目前，可使用不同的方法預(yù)測或識別過敏原表位中的關(guān)鍵氨基酸。免疫信息學(xué)分析是新興的預(yù)測手段?；谀繕吮砦恢胁煌被岬睦砘再|(zhì)、相對頻率和保守程度[5-7]，免疫信息學(xué)的方法可對目標表位中的關(guān)鍵氨基酸進行預(yù)測。采用免疫信息學(xué)預(yù)測表位關(guān)鍵氨基酸以進一步縮小表位中關(guān)鍵氨基酸的范圍，進而降低定點突變的盲目性。然而，在表位中預(yù)測的關(guān)鍵氨基酸對表位與IgE結(jié)合活性的影響需進一步驗證。丙氨酸掃描誘變法是研究抗原表位關(guān)鍵氨基酸的重要方法，即用丙氨酸依次取代作用表位的氨基酸合成新的多肽[8]，然后采用酶聯(lián)免疫吸附分析法識別降低過敏原致敏性的關(guān)鍵氨基酸。丙氨酸是蛋白質(zhì)中最簡單的中性氨基酸，由于其缺乏特殊的主鏈二面角偏好不會使原蛋白失活，而氨基酸中結(jié)構(gòu)最簡單的甘氨酸由于其側(cè)鏈組成簡單，會使蛋白質(zhì)主鏈具有構(gòu)象靈活性。因此丙氨酸常用于氨基酸替代方法中以構(gòu)建丙氨酸掃描突變體[9]。利用免疫信息學(xué)預(yù)測結(jié)合丙氨酸掃描誘變法可提高過敏原表位關(guān)鍵氨基酸研究可信度。

本課題組之前研究[10]已采用固相肽合成法結(jié)合斑點免疫印跡分析識別核桃過敏原Jug r 1的表位1、2、3共3 個線性表位區(qū)域，即4LVALLFVANAAA15、16FRTTITTMEIDEDID30、125CGISSQRCEIRRSWF139，依次記為Jug r 1-01、Jug r 1-02、Jug r 1-03。為分析上述 3 個線性表位區(qū)域的關(guān)鍵氨基酸，本研究通過2 種免疫信息學(xué)分析軟件進行預(yù)測，并結(jié)合丙氨酸掃描誘變法識別 Jug r 1的線性表位中的關(guān)鍵氨基酸。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA） 北京索萊寶科技有限公司；96 孔聚苯乙烯酶標板 美國Costar公司；抗人IgE（ε-鏈特異性）-過氧物酶山羊抗體 美國Sigma-Aldrich公司；快速化學(xué)發(fā)光試劑 美國Merck公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Varloskan Flash多功能酶標儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；高效液相C18柱 美國Vydac公司。

1.3 方法

1.3.1 核桃過敏患者血清的收集

本研究共招募10 名受試者，其中6 名為核桃過敏患者，通過病人自述攝入核桃后的癥狀和病史確定其對核桃存在過敏反應(yīng)?；颊呔唧w信息見表1，研究目的和方法已告知所有受試者，采血過程征得了所有受試者的同意。采集的血樣37 ℃孵育1 h，于4 ℃、4 000×g離心10 min，取上清液，分裝編號，置于－80 ℃保存。

表1 核桃過敏患者信息Table 1 Information of walnut-allergic patients recruited for this study

1.3.2 突變肽段的合成、純化和鑒定

根據(jù)過敏患者識別出的3 個Jug r 1的抗原表位（4LVALLFVANAAA15、16FRTTITTMEIDEDID30、125CGISSQRCEIRRSWF139）的氨基酸序列，依次使用丙氨酸進行替代，若原氨基酸序列中氨基酸為丙氨酸，則使用甘氨酸進行替代，用9-芴甲氧羰基（fiuorenylmethoxy carbony，F(xiàn)moc）固相合成法合成突變表位肽段[11]。高效液相色譜法測定的肽純度大于95%。 合成肽分子質(zhì)量通過電噴霧電離-質(zhì)譜確認[12]， 于－20 ℃保存。

1.3.3 Bioedit軟件對抗原表位區(qū)域的關(guān)鍵氨基酸的預(yù)測

采用Bioedit軟件對Jug r 1蛋白序列全長的氨基酸組成和出現(xiàn)頻率進行分析，再運用該軟件對Jug r 1中的3 個抗原表位區(qū)域的氨基酸組成和出現(xiàn)頻率進行分析。通過對比各類氨基酸分別在Jug r 1蛋白質(zhì)全長和抗原表位區(qū)域出現(xiàn)頻率的變化，預(yù)測主要活性氨基酸。

1.3.4 DNAstar軟件對抗原表位區(qū)域的關(guān)鍵氨基酸的預(yù)測

采用DNAstar Protean軟件對3 個抗原表位區(qū)域的氨基酸進行親水性、表面可及性、柔韌性及抗原指數(shù)分析，選擇抗原表位區(qū)域中同時滿足4 個參數(shù)條件的氨基酸（親水性＞0、表面可及指數(shù)＞1、柔韌性＞0、抗原指數(shù)＞0），作為預(yù)測的關(guān)鍵氨基酸。

1.3.5 酶聯(lián)免疫吸附測試法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）測定突變表位肽的IgE結(jié)合能力

參考Cocco等[13]的研究方法，通過直接ELISA識別IgE作用表位和關(guān)鍵氨基酸。以3 個抗原表位肽為陽性對照，以未加抗原的溶劑組為陰性對照。將合成的凍干肽粉末溶于100%二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）中，使其質(zhì)量濃度為3 mg/mL；用配好的突變表位肽段溶液包被96 孔板，每孔100 μL，4 ℃過夜孵育后，用洗滌液PBST（1 mL吐溫-20與1 000 mL磷酸鹽緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS））洗滌4 次，每次3 min；加入封閉液（1.0 g BSA與100 mL PBS）在37 ℃封閉2 h，用PBST洗滌3 次，每次3 min；加入一抗反應(yīng)液（過敏患者血清1∶10稀釋，血清稀釋液0.1 g BSA/100 mL PBS）37 ℃孵育2 h后，用PBST洗滌3 次；用生物素標記的山羊抗人IgE抗體37 ℃孵育1 h后，用PBST洗滌3 次；加入HRP標記的鏈霉親和素在37 ℃孵育1 h后，用PBST洗滌6 次；加入TMB顯色液，在37 ℃顯色10～15 min后，加入2 mol/L硫酸溶液終止反應(yīng)；用酶標儀測定其在450 nm波長處的OD值。

1.3.6 Jug r 1三級結(jié)構(gòu)分析及關(guān)鍵氨基酸定位

在Protein Data Bank，使用BLAST搜索已知的蛋白質(zhì)為模板[14]。Ber e 1與Jug r 1進行蛋白質(zhì)BLAST比對發(fā)現(xiàn)具有約45%的相似度，符合建模標準。采用2S白蛋白的SWISS-MODEL網(wǎng)站中的比對模式作為模板，建立了較為準確的三維模型[15]。通過分子動力學(xué)模擬和能量最小化，得到了Jug r 1的三維模型。由于Jug r 1的N端區(qū)域與建模模板Ber e 1存在顯著差異，因此在Jug r 1的模型省略此部分，而從高度相似的殘基36開始。采用可視化軟件RasMol查看Jug r 1線性表位和線性表位中關(guān)鍵氨基酸在三級結(jié)構(gòu)中的位置。

1.4 數(shù)據(jù)分析

統(tǒng)計分析采用SPSS 17.0軟件進行，所有實驗均做3 次平行。使用方差分析進行數(shù)據(jù)間差異水平的分析，以Kruskal-Wallis檢驗置信水平，95%為顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 Bioedit軟件對抗原表位的關(guān)鍵氨基酸預(yù)測結(jié)果

采用Bioedit軟件分析Jug r 1及其3 個線性表位的一級序列中各類氨基酸的出現(xiàn)頻率，由圖1可看出，在過敏原Jug r 1的整個序列中含有19 種氨基酸，缺少賴氨酸，最多的是L-谷氨酰胺（Q）和精氨酸（R）；在過敏原Jug r 1的3 個線性表位區(qū)域中含有丙氨酸（A）、半胱氨酸（C）、天冬氨酸（D）、谷氨酸（E）、苯丙氨酸（F）、甘氨酸（G）、組氨酸（H）、異亮氨酸（I）、賴氨酸（K）、亮氨酸（L）、蛋氨酸（M）、天冬氨酸（N）、脯氨酸（P）、谷氨酰胺（Q）、精氨酸（R）、絲氨酸（S）、蘇氨酸（T）、纈氨酸（V）、色氨酸（W）、酪氨酸（Y）共16 種氨基酸，組成全蛋白序列的酪氨酸（Y）、組氨酸（H）和脯氨酸（P）沒有出現(xiàn)。若某種氨基酸在表位區(qū)域中的出現(xiàn)頻率高于蛋白全長區(qū)域中的出現(xiàn)頻率，表明該氨基酸殘基在表位區(qū)域中起重要作用，其可能為關(guān)鍵氨基酸[16]。丙氨酸（A）、天冬氨酸（D）、苯丙氨酸（F）、異亮氨酸（I）、絲氨酸（S）、蘇氨酸（T）、纈氨酸（V）、色氨酸（W）在表位區(qū)域中出現(xiàn)的頻率高于蛋白全長區(qū)域，其極有可能為關(guān)鍵活性氨基酸，結(jié)合上述氨基酸在3 個線性表位出現(xiàn)的位置，預(yù)測6A、10V、11A、13-15A、16F、20I、26D、28D、30D、127I、128-129S、137S、138W、139F。

圖1 核桃過敏原Jug r 1及其3 個線性表位區(qū)域的氨基酸分布情況Fig. 1 Distribution of amino acids in Jug r 1 and its three liner epitope regions

2.2 DNAstar軟件對抗原表位的關(guān)鍵氨基酸預(yù)測結(jié)果

在獲得Jug r 1的3 個線性表位的氨基酸序列的基礎(chǔ)上，采用DNAstar Protean軟件對其一級結(jié)構(gòu)的親水性、表面可及性、柔韌性以及抗原指數(shù)進行分析，預(yù)測4 個可能位點，結(jié)果見表1。按Kyte等[17]的氨基酸親水性標準分析Jug r 1的3 個線性表位的親水性，親水性指數(shù)大于0則親水性較理想；根據(jù)Emini等[18]分析Jug r 1的3 個線性表位的表面可及性方法，以表面可及指數(shù)大于1（即區(qū)域位于蛋白質(zhì)表面）為篩選標準；按Karplus-Schulz法[19]對Jug r 1的柔性區(qū)域進行分析；根據(jù)Jameson等[20]分析Jug r 1的3 個線性表位的潛在抗原表位方法，以抗原指數(shù)大于0為篩選條件。采用DNAstar軟件預(yù)測Jug r 1的3 個線性抗原表位中關(guān)鍵氨基酸的結(jié)果如表2所示。

表2 DNAstar軟件預(yù)測Jug r 1的3 個線性抗原表位關(guān)鍵氨基酸Table 2 Key amino acids in three epitopes of Jug r 1 predicted by DNAstar

2.3 突變表位肽的合成及其與IgE的結(jié)合能力分析

為了研究2 種免疫信息學(xué)方法預(yù)測線性表位中關(guān)鍵氨基酸的準確性，確定Jug r 1的3 個線性表位中影響表位IgE結(jié)合活性的真實關(guān)鍵氨基酸，本實驗對3 個線性表位進行氨基酸定點突變，在線性表位肽中將每個氨基酸轉(zhuǎn)化為丙氨酸或甘氨酸，并通過核桃過敏患者的血清檢測這些突變肽的免疫反應(yīng)性。

根據(jù)之前研究[10]得到的6 名核桃過敏患者血清中特異性IgE抗體識別的抗原表位氨基酸序列，重新合成了42 個突變表位肽，結(jié)果如表3所示。

表3 突變表位肽段Table 3 Synthetic mutant epitope peptides

續(xù)表3

采用ELISA法檢測Jug r 1-01、Jug r 1-02、Jug r 1-03的3 種突變表位肽段與過敏患者血清中特異性IgE抗體的結(jié)合情況，結(jié)果分別如圖2～4所示，其中陰性肽段均為AAAAAAAAAAAAAAA。

圖2 IgE對Jug r 1表位1的12 個突變肽的反應(yīng)性分析Fig. 2 Analysis of IgE reactivity to 12 mutant peptides from epitope 1 of Jug r 1

用丙氨酸或甘氨酸依次取代Jug r 1表位1中的氨基酸合成突變表位肽，分別用6 名核桃過敏患者血清為抗體識別新合成的突變表位肽，分別以Jug r 1-01為陽性對照，以溶劑為陰性對照，測得450 nm波長處OD值如圖2A所示，匯總各名核桃過敏患者血清IgE對12 個突變表位肽的反應(yīng)性得圖2B，以6 名核桃過敏患者血清IgE的反應(yīng)性均為陰性為篩選標準，對關(guān)鍵氨基酸進行識別。由圖2B可知，Jug r 1表位1肽段1-1、1-4、1-5對應(yīng)表3中第4、7、8位的亮氨酸被丙氨酸替代（L4A、L7A、L8A）后與6 名患者血清IgE的結(jié)合活性均顯著降低（P＜0.01），而該肽段上的其他氨基酸被替代后仍會出現(xiàn)至少1 例IgE結(jié)合陽性的情況。

運用同樣的方法確定了Jug r 1表位2、表位3上的關(guān)鍵氨基酸，結(jié)果分別如圖3A、4A所示，匯總后分別得到圖3B、4B。由圖3B可知，Jug r 1表位2肽段2-5、2-6、2-13對應(yīng)表3中第20位異亮氨酸、第21位蘇氨酸、第28位天冬氨酸分別被丙氨酸替代（I20A、T21A、D28A）后，與6 名患者血清IgE的結(jié)合活性均顯著降低（P＜0.01）。由圖4B可知，Jug r 1表位3肽段3-3、3-5、3-6對應(yīng)表3中第127位異亮氨酸、第129位絲氨酸、第130位谷氨酰胺分別被丙氨酸替代（I127A、S129A、Q130A）后，與6 名患者血清IgE的結(jié)合活性均顯著降低（P＜0.01）。

圖3 IgE對Jug r 1表位2的15 個突變肽的反應(yīng)性分析Fig. 3 Analysis of IgE reactivity to 15 mutant peptides from epitope 2 of Jug r 1

圖4 IgE對Jug r 1表位3的15 個突變肽的反應(yīng)性分析Fig. 4 Analysis of IgE reactivity to 15 mutant peptides from epitope 3 of Jug r 1

基于上述丙氨酸掃描誘變法，得到Jug r 1的3 個線性表位中影響表位免疫反應(yīng)性的關(guān)鍵氨基酸為第4位亮氨酸、第7位亮氨酸、第8位亮氨酸、第20位異亮氨酸、第21位蘇氨酸、第28位天冬氨酸、第127位異亮氨酸、第129位絲氨酸、第130位谷氨酰胺。由于線性表位1、2不在建模范圍內(nèi)，因此無法在空間結(jié)構(gòu)上標注其關(guān)鍵氨基酸。僅對表位3及其關(guān)鍵氨基酸在蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)上的位置進行了標注，結(jié)果如圖5所示。

圖5 Jug r 1的正（A）、反（B）面三維結(jié)構(gòu)Fig. 5 Front (A) and back (B) view of 3D structure of Jug r 1

3 討 論

Jug r 1是英國核桃中的2S白蛋白，分子質(zhì)量為15～16 kDa[3]。2S白蛋白被描述為堅果中的主要過敏原，如巴西堅果（Ber e 1）、榛子（Cor a 14）、開心果（Pis v 1）、腰果（Ana o 3）[21]。這種小體積的蛋白質(zhì)過敏原以種子貯藏蛋白[22]的形式大量存在于許多可食用的樹堅果中，并參與樹堅果中的交叉反應(yīng)性[23-24]。Chou等[25]發(fā)現(xiàn)，表位上的關(guān)鍵氨基酸是引起不同過敏原交叉過敏反應(yīng)的原因。目前鮮見不同樹堅果中2S白蛋白過敏原表位中關(guān)鍵氨基酸的研究，免疫信息學(xué)預(yù)測法和丙氨酸掃描誘變法為關(guān)鍵氨基酸的預(yù)測和識別提供技術(shù)參考。本研究對英國核桃中的2S白蛋白過敏原線性表位中的關(guān)鍵氨基酸識別，有利于認識其他樹堅果中2S白蛋白過敏原表位和不同樹堅果的交叉過敏反應(yīng)。除此之外，Deus-De-Oliveira等[26]采用蓖麻子2S白蛋白過敏原Ric c31和Ric c 3的關(guān)鍵氨基酸阻斷了肥大細胞上IgE與過敏原結(jié)合，因此過敏原關(guān)鍵氨基酸的鑒定可為游離氨基酸治療變態(tài)反應(yīng)提供依據(jù)。

Jug r 1的線性表位的研究始于2002年，Robotham等[27]采用20 名核桃過敏患者血清識別得到Jug r 1的1 個線性表位105GLRGEEMEEMVQS117，并鑒定其中的關(guān)鍵氨基酸為107R、108G、109E、110E、113E。在2009年，Sordet等[28]采用3 名核桃過敏患者血清識別了4 個線性表位，分別為6IDNPRR11、42YDEDNQRQH50、72QVVRRQQQQ80、102CGISSQRCEIRR113。畢源等[10]使用6名核桃過敏患者血清識別出3 個Jug r 1的抗原表位4LVALLFVANAAA15、16FRTTITTMEIDEDID30、125CGISSQRCEIRRSWF139，其中表位2和表位3與 文獻[27-28]識別的位置不同。因此，本研究對Jug r 1線性表位中的關(guān)鍵氨基酸進行識別，以補充對核桃過敏原Jug r 1線性表位致敏性的認識。本研究確定的抗原表位的關(guān)鍵氨基酸中，亮氨酸（L）和異亮氨酸（I）均為中性疏水氨基酸，Shin等[29]發(fā)現(xiàn)相比極性或帶電荷氨基酸，疏水性氨基酸在花生過敏原Ara h 1表位肽的突變更容易引起表位與IgE結(jié)合活性的改變。除此之外，在針對α-乳白蛋白[12]、β-酪蛋白和β-乳球蛋白[30]過敏原表位中關(guān)鍵氨基酸識別研究中也發(fā)現(xiàn)了亮氨酸和（或）異亮氨酸是線性表位中的關(guān)鍵氨基酸，這可能與疏水氨基酸在維持蛋白二級結(jié)構(gòu)中的作用有關(guān)。除此之外，本研究還發(fā)現(xiàn)蘇氨酸（T）、絲氨酸（S）和谷氨酰胺（Q）也是Jug r 1線性表位中的關(guān)鍵氨基酸，這3 種氨基酸均為極性、不帶電荷的氨基酸，這類氨基酸帶有極性基團，因此其比疏水氨基酸更容易溶于水，且此類氨基酸的側(cè)鏈基團易形成二硫鍵，二硫鍵對于維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性有重要作用。天冬氨酸（D）也是本研究識別的關(guān)鍵氨基酸，F(xiàn)u Linglin等[7]發(fā)現(xiàn)天冬氨酸同樣是中國對蝦中原肌球蛋白和精氨酸激酶共2 種過敏原線性表位中的關(guān)鍵氨基酸，天冬氨酸是帶負電的酸性氨基酸，增強線性表位的負電密度也可能提高肽的致敏性。

如今，免疫信息預(yù)測、氨基酸定點突變技術(shù)是預(yù)測和研究過敏原表位中關(guān)鍵氨基酸的重要方法。免疫信息學(xué)的預(yù)測可為表位中氨基酸定點突變節(jié)約時間、經(jīng)濟成本，但免疫信息學(xué)的預(yù)測標準不同會導(dǎo)致預(yù)測位點與實際關(guān)鍵氨基酸之間的差異。因此本研究使用Bioedit對Jug r 1及其3 個線性表位中氨基酸種類進行統(tǒng)計，通過分析各類氨基酸在蛋白和表位出現(xiàn)頻率預(yù)測關(guān)鍵氨基酸的潛在種類，并結(jié)合Jug r 1的3 個線性表位的氨基酸序列預(yù)測潛在關(guān)鍵氨基酸位點。除此之外，本實驗使用了預(yù)測B細胞線性表位常用的免疫信息學(xué)工具DNAstar，通過分析表位親水性、表面可及性、柔韌性以及抗原指數(shù)預(yù)測Jug r 1的3 個線性表位中關(guān)鍵氨基酸的潛在位點。預(yù)測效率、準確率是評價免疫信息學(xué)工具預(yù)測效果的重要指標。本研究中預(yù)測效率為通過免疫信息學(xué)工具預(yù)測到真實關(guān)鍵氨基酸的比例，預(yù)測準確率為免疫信息學(xué)工具預(yù)測得到的潛在關(guān)鍵氨基酸中真實關(guān)鍵氨基酸所占比例。免疫信息學(xué)的預(yù)測效率高，但更容易出現(xiàn)假陽性的結(jié)果；預(yù)測準確率高，但更容易出現(xiàn)假陰性的結(jié)果。因此，在采用免疫信息學(xué)對過敏原線性表位中的關(guān)鍵氨基酸進行研究時，可結(jié)合后續(xù)實驗?zāi)康倪x擇合適預(yù)測效率、準確率的免疫信息學(xué)工具。例如，為降低實驗的盲目性可選擇預(yù)測準確率更高的預(yù)測工具，或者采用多種預(yù)測工具結(jié)合的策略。為更全面地發(fā)現(xiàn)過敏原線性表位中的關(guān)鍵氨基酸可選擇預(yù)測效率更高的預(yù)測工具，以減少遺漏關(guān)鍵氨基酸的情況。本研究對2 種免疫信息學(xué)方法預(yù)測的關(guān)鍵氨基酸位點與丙氨酸掃描誘變法識別的關(guān)鍵氨基酸位點進行了比較，前者的預(yù)測準確率為23.53%，預(yù)測效率為44.44%，后者的預(yù)測準確性18.18%，預(yù)測效率為22.22%。這2 種免疫信息學(xué)預(yù)測方法共同篩選出的關(guān)鍵氨基酸為28D，采用2 種免疫信息學(xué)方法結(jié)合的方式得到的預(yù)測準確率為100%，而預(yù)測效率僅為11.11%。使用免疫信息學(xué)方法預(yù)測在提高關(guān)鍵氨基酸識別效率的同時，會因預(yù)測標準的不同而出現(xiàn)一些關(guān)鍵氨基酸被忽略的情況，導(dǎo)致對表位中關(guān)鍵氨基酸的識別不夠全面。所以，免疫信息學(xué)預(yù)測選擇的參數(shù)或標準很重要。為了提高預(yù)測性能，常結(jié)合多種過敏原特征進行綜合分析，例如使用BepiPred、BCPred、SVMTriP、LBtope、 APCPred等B細胞線性表位預(yù)測工具可對過敏原線性表位進行預(yù)測[31]。這些預(yù)測工具均基于蛋白質(zhì)中氨基酸的親水性、電荷、暴露表面積和二級結(jié)構(gòu)等性質(zhì)展開的預(yù)測[32]， 而這些性質(zhì)與抗原的免疫反應(yīng)性有密切關(guān)系[33-34]，因此這些工具也可用于預(yù)測B細胞線性表位中的關(guān)鍵氨基酸。通過篩選同類蛋白在不同物種間的保守氨基酸也是預(yù)測過敏原關(guān)鍵氨基酸的方法[7]。選擇不同的工具和標準進行綜合分析可實現(xiàn)多維預(yù)測，有利于提高預(yù)測準確性，但也可能降低預(yù)測效率。免疫信息學(xué)軟件分析結(jié)果與實際存在差異，因此免疫信息學(xué)軟件分析結(jié)果需結(jié)合其他實驗方法共同確定抗原表位的關(guān)鍵氨基酸。

本實驗還發(fā)現(xiàn)，用不同患者的血清識別的關(guān)鍵氨基酸有所差異，例如在表位3上的第128號絲氨酸被丙氨酸替代后，1號患者血清與突變肽的結(jié)合強度未發(fā)生顯著變化，而剩余5 名患者血清與突變肽的結(jié)合強度均不同程度地降低，表位中關(guān)鍵氨基酸與患者IgE之間的結(jié)合存在異質(zhì)性[30]，且表位中關(guān)鍵氨基酸與IgE結(jié)合的異質(zhì)性也可能導(dǎo)致免疫信息學(xué)預(yù)測準確度和效率的下降。因此，對于核桃主要過敏原Jug r 1線性表位的關(guān)鍵氨基酸仍需更多患者血清進一步識別，從而更準確評估以氨基酸出現(xiàn)頻率和（或）抗原性質(zhì)為參數(shù)預(yù)測表位中關(guān)鍵氨基酸的準確率和效率。突變表位肽與IgE結(jié)合存在異質(zhì)性可能與一些單點關(guān)鍵氨基酸并不屬于IgE與Jug r 1表位肽的接觸位點有關(guān)，這些單點氨基酸可能對表位的立體化學(xué)環(huán)境產(chǎn)生空間體積效應(yīng)[35]，這需要使用具有不同空間容積的氨基酸替代進一步研究IgE結(jié)合表位中的關(guān)鍵氨基酸。

4 結(jié) 論

核桃作為樹堅果，對其線性表位的關(guān)鍵氨基酸尚未得到深入的研究。本研究采用2 種免疫信息學(xué)方法快速預(yù)測抗原表位，比較了2 種方法的預(yù)測準確性，發(fā)現(xiàn)免疫信息學(xué)預(yù)測的方法一定程度上可降低突變肽合成時間、經(jīng)濟成本，但可能遺漏一些關(guān)鍵氨基酸，因此丙氨酸掃描誘變法是識別表位中關(guān)鍵氨基酸的準確方法。本研究采用丙氨酸掃描誘變通過部分中國核桃過敏患者血清，識別了核桃主要過敏原Jug r 1的B細胞線性表位中的關(guān)鍵氨基酸，分別為表位1（4LVALLFVANAAA15）中的第4位亮氨酸、第7位亮氨酸、第8位亮氨酸，表位2（16FRTTITTMEIDEDID30）中的第20位異亮氨酸、第21位蘇氨酸、第22位異亮氨酸，表位3（125CGISSQRCEIRRSWF139）中的第127位異亮氨酸、第129位絲氨酸、第130位谷氨酰胺。本研究豐富了對核桃等堅果過敏原的認識，為預(yù)防和治療核桃過敏以及在食品加工過程中消除等位基因提供參考。