孫丹丹，張曉君，路來風，楊 瑩，喬麗萍，王昌祿

（食品營養(yǎng)與安全教育部重點實驗室，天津科技大學食品科學與工程學院，天津 300457）

生物防治指利用生物物種間的相互關系，以一種或一類生物抑制另一種或另一類生物的方法。利用安全且具有拮抗活性的微生物進行果蔬病害生物控制的方法，被認為采后領域最有希望替代化學殺菌劑的方法之一[1]。研究已經(jīng)分離和篩選出了上千種拮抗微生物菌株，這些菌株包括了具有拮抗作用的細菌、小型絲狀真菌和酵母菌等[2-3]，可以有效控制果蔬采后主要病害[4-5]。

利用拮抗微生物防治果蔬采后病害的效果取決于生防制劑的篩選、開發(fā)和應用過程[6]。環(huán)境中包含眾多潛在的生防因子，而一般有效的生防因子制劑需要能夠與果蔬建立密切的關系，進而有效抑制病原菌的擴展；通過抑制病原菌發(fā)育，使病原菌易于被優(yōu)勢微生物區(qū)系攻擊或殺死；同時，能夠在適當?shù)奈稽c定植并達到足以有效防治的密度，從而發(fā)揮對病原菌的控制作用和保護果蔬免受采后病害侵染[1,7]。微生物能在傷口處迅速定植，并且不會引發(fā)宿主劇烈的免疫反應是它能作為生防制劑的前提，而目前缺乏關于拮抗微生物與果蔬建立密切關聯(lián)機制的系統(tǒng)性研究。

海洋紅冬孢酵母（Rhodosporidium paludigenumFell & Tallman）作為海洋中存在的一中抗逆性很強的天然真菌，對多種果蔬的多種采后病害具有良好抑制效果，明顯抑制鏈格孢、灰葡萄孢（Botrytis cinerea）、擴展青霉、指狀青霉、多毛孢等多種病原微生物在冬棗、番茄、蘋果、柑橘、葡萄等果實上引起的病變和腐敗[8-9]。前期實驗結果發(fā)現(xiàn)，營養(yǎng)與空間的競爭和誘導果實抗病等是R. paludigenum生物防治采后病害的主要作用機制[10-11]。R. paludigenum能通過在果實傷口處的快速生長，迅速占據(jù)水果傷口表面的空間，并調控果實局部和系統(tǒng)性免疫反應，從而發(fā)揮限制致病菌對果實組織營養(yǎng)的目的。

果蔬采后病原菌等死體營養(yǎng)型致病菌在與寄主之間建立寄主關系時會分泌大量的降解酶類，幫助病原菌侵入和定植于果蔬組織，同時降解酶可以分解這些果蔬組織的高分子質量組分，產生病原菌能夠代謝的營養(yǎng)[12]。本研究擬參考果蔬采后病原菌與寄主之間建立寄主關系的方式，選取具有優(yōu)良采后生物防治效果的R. paludigenum為研究對象，通過解析其分泌蛋白信息，探究拮抗微生物與番茄之間建立宿主關系的方式及其中的相關機制，旨在為強化拮抗微生物防治制劑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗所用果實均為新鮮（收獲時間，1～2 d）的紅熟期番茄（Solanum lycopersicum），采摘于天津市東麗經(jīng)濟開發(fā)區(qū)溫室試驗果園。選取外觀無機械傷口、大小均勻一致的果實進行實驗，用0.1%次氯酸鈉溶液浸泡消毒1～2 min，用自來水沖洗并在室溫下放干后備用。

R. paludigenumFell & Tallman（IMI 394084）分離自中國東海近海海域，并經(jīng)英國國際微生物所菌種保存和鑒定中心鑒定。將適量活化后的菌種挑入到100 mL番茄液體培養(yǎng)基（番茄果肉25 g，加水定容至100 mL，121 ℃滅菌20 min）中，于200 r/min、28 ℃搖床培養(yǎng)36 h。

病原菌為B. cinerea，分離自腐爛番茄果實表面。挑取適量的霉菌孢子，在馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基斜面上劃線，置于培養(yǎng)箱中，在28 ℃培養(yǎng)7 d后，用接種環(huán)在培養(yǎng)好的霉菌試管斜面上刮取適量孢子，轉移到適量0.05%吐溫-20溶液中，用血球計數(shù)板計數(shù)調整至1×104spores/mL 待用。

異硫氰酸胍、糜蛋白酶、幾丁質、昆布多糖、蘋果果膠、Chitin Azure 美國Sigma-Aldrich公司；胰蛋白酶 美國Promega公司；尿素、三羥甲基氨基甲烷、二硫蘇 糖醇 美國Bio-Rad公司；胰蛋白酶蛋白酶、天冬氨酸激酶（均為質譜級） 日本和光純藥工業(yè)株式會社。

1.2 儀器與設備

Q Exactive UHMR（超高質量數(shù)范圍）組合型四極桿Orbitrap質譜儀、Easy-nLC 1 000 nL級液相色譜儀 美國 賽默飛世爾科技公司；BX-60熒光顯微鏡 日本奧林巴斯公司；LS-B50L型立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司；HYG-IIa型迴轉式恒溫調速搖床 上海欣蕊自動化設備有限公司；Allegra X-30型臺式高速離心機 美國Beckman公司。

1.3 方法

1.3.1R. paludigenum分泌蛋白質譜鑒定與生物信息學分析

R. paludigenum分泌蛋白質譜鑒定實驗委托上海中科新生命生物科技有限公司開展，具體實驗流程如下：R. paludigenum分泌蛋白經(jīng)過還原和烷基化處理后，加入胰蛋白酶（質量比1∶50），在37 ℃條件下酶解20 h。蛋白質分裝，保存于－80 ℃冰箱。各取樣品20 μg（可根據(jù)實際情況調整上樣量）進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，考馬斯亮藍染色（或者銀染），判斷樣品裂解情況。酶解產物脫鹽后凍干，復溶于0.1%三氟乙酸溶液中，－20 ℃保存待用。質譜分析A液為0.1%甲酸溶液，B液為0.1%甲酸-84%乙腈溶液。色譜柱以95% A液平衡后，樣品由自動進樣器上樣至Trap柱。對于復合的樣品采用1H梯度。質譜數(shù)據(jù)采集：每次全掃描后采集20 個碎片圖譜（MS2Scan）。采用Bradford方法進行蛋白質定量。

R. paludigenum分泌蛋白質生物信息學分析按照聶燕芳等[13]方法，用Signal P（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/）[14]、WoLF PSORT（https://www.genscript.com/wolf-psort.html）[15]、Target P（http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP-1.1/index.php）[16]、TMHMM（http://www.cbs. dtu.dk/services/TMHMM/）[17]和big-PI Predictor（http://gpcr2.biocomp.unibo.it/predgpi/pred.htm）[18]軟件對質譜鑒定得到的拮抗酵母胞外蛋白氨基酸序列進行經(jīng)典分泌蛋白的預測分析，利用Secretome P（http://www.cbs.dtu.dk/services/SecretomeP/）軟件對拮抗酵母非經(jīng)典分泌蛋白進行分析，將氨基酸序列 NN-score＞0.6（人工神經(jīng)網(wǎng)絡算法）的蛋白質定義為非經(jīng)典分泌蛋白[19]。

1.3.2R. paludigenum分泌蛋白抑菌實驗

在馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中加入適當濃度B. cinerea孢子懸浮液、R. paludigenum發(fā)酵上清液鹽析蛋白混合物和番茄空白培養(yǎng)基上清液鹽析蛋白混合物，在25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)18 h，觀察B. cinerea芽管長度和萌發(fā)率，以評估R. paludigenum分泌蛋白對B. cinerea發(fā)育的影響。

1.3.3 番茄果實采后病理學實驗

將R. paludigenum發(fā)酵液于9 000×g、4 ℃條件下離心20 min，獲得發(fā)酵上清液與菌體沉淀物，將收集到的菌體沉淀物用無菌水清洗2 次以充分除去培養(yǎng)基，重新懸浮在pH 6.5磷酸緩沖液中，冰浴超聲5 min后，于25 000×g、4 ℃條件下離心20 min，即獲得酵母胞內上清液。利用不同飽和度(NH4)2SO4溶液同時對酵母發(fā)酵上清液和胞內上清液進行鹽析，低溫（4 ℃）靜置過夜后于8 000×g離心30 min，即分別獲得R. paludigenum酵母分泌蛋白和胞內蛋白混合物。

用消過毒的打孔器在每個果實的頂部形成統(tǒng)一大小（5 mm）和盡可能相同的深度（2 mm）的傷口2 個。每個果實第1傷口中加入等量（50 μL）的R. paludigenum酵母分泌蛋白或胞內蛋白，果實第2傷口中加入等量的番茄液體培養(yǎng)基上清液鹽析蛋白混合物或無菌水作為對照。在25 ℃恒溫恒濕條件下誘導48 h后，在果實表面鄰近原傷口5 mm處形成一個新的傷口，接入30 μLB. cinerea病原菌懸液（1×104spores/mL）。在恒溫（25 ℃）恒濕條件下貯藏，每天定時記錄病害發(fā)生情況和病斑直徑。

1.3.4 拮抗酵母分泌蛋白中寡聚半乳糖醛酸酶、葡聚糖酶和幾丁質酶活性測定

按照盧黃娉[20]方法用二硝基水楊酸法測定拮抗酵母分泌蛋白中葡聚糖酶活性，葡聚糖酶活性以每毫升蛋白溶液每小時產生的葡萄糖質量表示；按照De Los Santos-Romero等[21]方法，用可見分光光度法測定拮抗酵母分泌蛋白中幾丁質酶活性，幾丁質酶活性以每毫升蛋白溶液每小時OD570nm增加0.01為1 個單位（U）；按照Lu Laifeng等[22]方法，用二硝基水楊酸法測定拮抗酵母分泌蛋白中果膠酶活性，果膠酶活性以每毫升蛋白溶液每小時產生的D-半乳糖醛酸的質量表示。利用考馬斯亮藍法（Bradford法）測得蛋白質含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS/PC ver. II. x軟件（Statistical Product and Service Solutions）進行統(tǒng)計分析。當組內比較個數(shù)為3 個及3 個以上時，數(shù)據(jù)采用ANOVA進行Duncan差異分析（P＜0.05，差異顯著）；當組內個數(shù)為2 個時，采用獨立樣品t檢驗進行平均數(shù)分離。每個單獨實驗中每個處理至少設3 個以上重復，并按照完全隨機區(qū)組原則進行設計。采用Origin 7.5軟件進行作圖。

2 結果與分析

2.1 R. paludigenum經(jīng)典與非經(jīng)典分泌蛋白鑒定與預測分析

利用QE質譜儀對酵母胞外蛋白混合物進行鑒定 （圖1）。選取Uniprot_Rhodotorula_40850_20171211.fasta為對照數(shù)據(jù)庫，脲甲基化為固定修飾，氧化和磷酸化為可變修飾，使用MASCOT等質譜匹配軟件對液相色譜-串聯(lián)質譜結果進行分析，共計獲得1 632 條目標蛋白質多肽序列。其中，UniPepCount為1和2的蛋白分別共計1 346 個和147 個，合計占比91.48%（圖1A）。80%左右的氨基酸數(shù)目占對應目標蛋白質全長比例在5%以內，另有20%左右的蛋白覆蓋程度高于5%，即在此樣品中該蛋白的峰度可能相對高些，但是沒有絕對量化的標準（圖1B）。

圖1 R. paludigenum發(fā)酵上清液蛋白Unique肽段數(shù)量分布（A）和 肽段序列覆蓋度（B）圖Fig. 1 Distribution of the number of unique protein sequences (A) and coverage of peptide sequences (B) in the fermentation supernatant of R. paludigenum

利用UniParc數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）獲取蛋白質一級氨基酸全長序列。參照經(jīng)典分泌蛋白的4 個特征[13]：1）具有N-端信號肽；2）亞細胞定位為胞外分泌類型，不含有細胞質膜、細胞質及其他亞細胞預測定位信號；3）無跨膜結構域；4）無糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol，GPI）錨定位點對R. paludigenum發(fā)酵上清液中的蛋白混合物進行篩選，除去冗余或者番茄屬（Lycopersicon）等其他來源蛋白質。

首先，利用Signal P軟件對經(jīng)質譜鑒定得到的1 632 條蛋白質氨基酸序列進行信號肽預測分析，結果表明有114 個氨基酸序列具有分泌型信號肽，占總數(shù)的6.99%。其次，使用WoLF PSORTRU軟件對具有信號肽的114 個分泌性蛋白質進行亞細胞定位預測分析，結果表明104 個蛋白質分泌到胞外，屬于胞外蛋白類型。利用Target P進一步對 WoLF PSORT預測的104 個分泌蛋白質進行驗證分析，得到100 個含有分泌型信號肽的蛋白質，所占比例為 96.2%。結合TMHMM Server對以上100 個含有分泌型信號肽的蛋白質進行跨膜區(qū)判斷，結果表明有81 個蛋白質沒有跨膜螺旋，具有典型分泌蛋白的特征。最后，利用big-PI Predictor軟件對上述81 個沒有跨膜螺旋的蛋白質進行分析。結果表明58 個蛋白質氨基酸序列不具有GPI錨定位點，具有經(jīng)典分泌蛋白的特征，另有23 個蛋白質具有GPI 錨定位點，不符合經(jīng)典分泌蛋白的特征。綜合上述不同生物信息學軟件的分析結果，發(fā)現(xiàn)經(jīng)質譜鑒定得到的R. paludigenum發(fā)酵上清液中有58 個具有經(jīng)典分泌特征的蛋白質，占比3.56%（表1）。

表1 R. paludigenum經(jīng)典分泌蛋白序列信息Table 1 Sequence information of classical secretory proteins in R. paludigenum

結合UniParc數(shù)據(jù)庫58 個具有經(jīng)典分泌特征的R. paludigenum分泌蛋白的人工注釋信息，發(fā)現(xiàn)40 個已知功能蛋白，18 個未知功能蛋白。碳水化合物酶（carbohydrate-active enzymes，CAZymes）類蛋白是指參與碳水化合物合成和降解的重要酶類，其作為分泌蛋白中的一大類，是植物病原菌侵染過程中突破寄主植物細胞壁的關鍵因素，主要包括糖基水解酶、糖基轉移酶、多糖裂解酶、碳水化合物酯酶、碳水化合物結合模塊及輔助模塊酶類6 類。本研究結果發(fā)現(xiàn)，R. paludigenum分泌蛋白中含有藻膠裂解酶和β-葡萄糖苷酶等18 個CAZymes類蛋白，占比31.0%，其中包括糖基水解酶14 個、多糖裂解酶3 個、碳水化合物酯酶1 個（表2）。

表2 R. paludigenum經(jīng)典分泌蛋白的功能注釋分析Table 2 Functional annotation analysis of classical secretory proteins in R. paludigenum

此外，利用 Secretome P 2.0 Server軟件，對R. paludigenum發(fā)酵上清液中不具有信號肽的1 518 條氨基酸序列進行了分析。結果表明，有433 個蛋白質氨基酸序列符合非典型分泌蛋白的特征，占目標蛋白質多肽序列總數(shù)的26.6%。其中，包括糖苷水解酶26家族蛋白、甲殼素脫乙酰酶和蛋白磷酸聚糖5等蛋白。

2.2 R. paludigenum分泌蛋白對B. cinerea發(fā)育的影響

為了研究分泌蛋白在R. paludigenum與B. cinerea互作過程中的功能，本研究將R. paludigenum分泌蛋白混合物與B. cinerea孢子進行共同培養(yǎng)（圖2）。結果表明，相對于番茄液體培養(yǎng)基上清液鹽析所得的蛋白混合物而言，R. paludigenum分泌蛋白可以有效抑制B. cinerea孢子的發(fā)育過程。添加0.1%（體積分數(shù)）R. paludigenum分泌蛋白處理組，B. cinerea孢子萌發(fā)率為（21.1±2.81）%，較對空白照組降低了31.4%。

圖2 R. paludigenum分泌蛋白對B. cinerea萌發(fā)的抑制情況Fig. 2 Inhibition of spore germination of B. cinerea by secretory proteins of antagonistic yeast R. paludigenum

2.3 分泌蛋白在R. paludigenum與番茄建立關聯(lián)中的作用

微生物區(qū)系與宿主之間存在互利共生關系，因此宿主組織往往是潛在生防因子的有效來源。宿主免疫系統(tǒng)可以不間斷監(jiān)測其微生物區(qū)系，通過調整抗性反應機制與微生物之間達到微妙平衡。研究結果發(fā)現(xiàn)，R. paludigenum分泌蛋白參與介導了微生物區(qū)系與宿主之間的動態(tài)識別過程，即番茄果實可以有效識別R. paludigenum的分泌蛋白，并作出溫和與適當?shù)拿庖唔憫▓D3）。R. paludigenum的分泌蛋白處理可以有效降低番茄果實傷口周圍組織處灰霉病的發(fā)生幾率，其病斑直徑和發(fā)病率分別為4.22 mm和19.4%，較無菌水對照組顯著降低了70.5%和30.6%，而較番茄液體培養(yǎng)基上清液（未發(fā)酵）鹽析蛋白處理組而言分別顯著降低了86.7%和72.3%。

圖3 R. paludigenum分泌與胞內蛋白對番茄抗病性的影響Fig. 3 Effect of intracellular and extracellular proteins of R. paludigenum on disease resistance of tomato fruits

2.4 不同飽和度(NH4)2SO4鹽析對R. paludigenum分泌蛋白誘導番茄抗病性的影響

向R. paludigenum發(fā)酵上清液中加入不同質量(NH4)2SO4，使之達到不同的飽和度，沉淀之后分別測定酵母分泌蛋白混合物誘導番茄果實抗灰霉病的能力，結果如圖4所示。當(NH4)2SO4飽和度在0%～80%范圍內時，R. paludigenum分泌蛋白混合物中能誘導番茄果實抗病的活性蛋白分子較少，其處理組后的果實灰霉病發(fā)病率與對照組幾乎無顯著差別。當(NH4)2SO4飽和度達到90%時，R. paludigenum分泌蛋白混合物中能誘導番茄果實抗病能力顯著增加，經(jīng)90%飽和度鹽析所得R. paludigenum分泌蛋白混合物處理后，番茄果實傷口周圍組織灰霉病發(fā)病率和發(fā)病程度受到顯著抑制，果實組織發(fā)病率僅為49.9%，較對照組降低了50.1%。

圖4 不同飽和度鹽析R. paludigenum分泌蛋白對 番茄灰霉病的抑制效果Fig. 4 Inhibitory effect on gray mold of gradient salting-out fractions of secretory proteins of antagonistic yeast R. paludigenum

2.5 R. paludigenum分泌蛋白中3 種CAZymes活性分析

對比分析R. paludigenum與B. cinerea分泌蛋白中葡聚糖酶、幾丁質酶和寡聚半乳糖醛酸酶3 種關鍵的CAZymes活性，結果發(fā)現(xiàn)相同體積中B. cinerea葡聚糖酶和寡聚半乳糖醛酸酶活性顯著高于拮抗酵母，特別是寡聚半乳糖醛酸酶活性（表3）。B. cinerea分泌蛋白中的寡聚半乳糖醛酸酶活性為1.121 μg/mL，而R. paludigenum分泌蛋白中的寡聚半乳糖醛酸酶活性僅為0.014 μg/mL。因此，R. paludigenum在果實表面和傷口處的定植不會對果實組織細胞壁造成太大的損傷。而R. paludigenum分泌蛋白中的幾丁質酶活性為3.867 U，較B. cinerea組高出 14.85 倍，而這可能是R. paludigenum分泌蛋白能夠直接抑制B. cinerea發(fā)育的原因。

表3 R. paludigenum與B. cinerea分泌蛋白中3 種CAZymes活性比較Table 3 Activities of three CAZymes in R. paludigenum and B. cinereasecretory proteins

3 討 論

健康的果蔬等植物組織中生活著多種多樣但分類學結構不同且具有宿主特異性的微生物群落，它們可以在果蔬等植物組織表面或者組織內部定植[23-25]。微生物之間、微生物與宿主之間的相互合作賦予果蔬宿主的健康優(yōu)勢，包括促進果實品質、成熟衰老、抗逆性和對病原菌的抵抗力等[23]。本研究所用到的R. paludigenum是一種能夠防治多種果蔬采后病害的拮抗微生物[8,20]。前期研究表明，R. paludigenum在接種到櫻桃番茄傷口后迅速繁殖，24～48 h后櫻桃番茄果實傷口處的酵母數(shù)量是接種時的50～100 倍；R. paludigenum接種到冬棗傷口后迅速繁殖，24～48 h后冬棗果實傷口處的酵母數(shù)量是接種時的50～150 倍，以上兩種情況都很好地抑制了采后病原菌鏈格孢菌的侵染，且不會引起傷口的過敏反應[8]。此外，R. paludigenum還可以定植于柑橘、蘋果、梨和番茄等果實表面或者傷口處，并有效防治柑橘果實采后綠霉、酸腐病害，蘋果、梨采后青霉病害和櫻桃番茄采后黑斑病害等發(fā)生[20,26]，可以初步證實R. paludigenum能夠通過定植過程與果蔬建立互惠互利式的宿主關系。

單獨施用拮抗酵母R. paludigenum分泌蛋白可以有效增強傷口周圍組織抵抗B. cinerea侵染的能力，同時未引發(fā)細胞程序性死亡等宿主劇烈的免疫反應，證明分泌蛋白參與了拮抗酵母R. paludigenum與宿主番茄果實建立密切關聯(lián)關系的過程。其中，CAZymes類蛋白，例如寡聚半乳糖醛酸酶等糖基水解酶、多糖裂解酶，可能參與了R. paludigenum在果實表面的定植與識別過程，介導其與番茄果實之間建立宿主關系。為使根瘤菌感染豆科植物根，植物需要通過外源寡聚半乳糖醛酸激活結瘤信號通路和NIN轉錄因子激活果膠裂解酶（LjNPL）對自身的細胞壁進行局部降解，以形成植物侵染點，以便在微生物與植物之間建立關系[27]。同理，糖基水解酶、多糖裂解酶等蛋白可以有助于拮抗酵母局部解聚果膠等果實細胞壁多糖組分，為拮抗酵母在果實表面或者傷口處定植提供定植位點和營養(yǎng)來源。同時，寡聚半乳糖醛酸等微生物定植過程中產生的植物細胞壁多糖酶解組分，可以作為植物損傷相關分子模體被果蔬等宿主識別，激活植保素累積、抗性蛋白響應以及活性氧爆發(fā)等防御過程[28]。另外，擬南芥表面受體蛋白AtRLP42也可以直接識別多種真菌果膠酶進而激活植物體對腐生型病原菌Hyaloperonospora arabidopsidis的抗性[29]。值得注意的是，不同微生物分泌蛋白中果膠水解酶與裂解酶的組成與比例會影響所產生寡糖的聚合度和占比等，而因寡糖聚合度不同其誘發(fā)的宿主抗性響應也有不同[30]。探究不同微生物糖基水解酶、裂解酶等蛋白酶產生順序、組成及其酶解產物的種類與功能研究有助于揭示果蔬等宿主識別拮抗微生物和病原微生物的具體機制。

除參與微生物與宿主之間的互作過程外，R. paludigenum分泌蛋白還介導了其與病原菌之間的互作關系。酵母細胞壁主要由葡聚糖、甘露聚糖、蛋白質、幾丁質、脂類和無機物（磷酸鹽等）構成。其中，幾丁質僅出現(xiàn)于出芽痕中，出芽結束后被葡聚糖和甘露糖所覆蓋。紅酵母屬、隱球酵母屬、拿遜酵母屬等絲狀酵母出芽痕較多，細胞壁中幾丁質含量相應較高，但遠低于采后病原真菌等絲狀真菌。采后病原真菌等霉菌細胞壁一般為幾丁質組成，有的含有纖維素[31]。由此推論，環(huán)境中的高濃度幾丁質水解酶會優(yōu)先限制絲狀真菌的細胞壁合成過程，進而抑制其生長繁殖。R. paludigenum分泌蛋白中含有較高濃度的幾丁質酶等糖基水解酶，推測參與了抑制B. cinerea孢子的萌發(fā)過程，幫助拮抗酵母競爭營養(yǎng)和宿主潛在定植位點，抑制病原菌對寄主的侵入方式等。前期研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加幾丁質可以增加R. paludigenum分泌包括幾丁質酶和β-1,3-葡聚糖酶在內的胞外水解酶，并顯著提高了其對多種果實的采后病原真菌的防治效力[32]，側面印證了以上推論，在培養(yǎng)基中添加幾丁質、葡聚糖和果膠等大分子糖類推測適用于多種生防制劑的病害防治功能強化。

4 結 論

本研究發(fā)現(xiàn)R. paludigenum通過分泌CAZymes等蛋白質與番茄果實開展互利合作，控制病原微生物在果實傷口等位置的發(fā)育，有效保持了采后果蔬的健康狀態(tài)。其中，R. paludigenum需要通過分泌低濃度的寡聚半乳糖醛酸酶等糖基水解酶、多糖裂解酶等蛋白，在不損傷果實組織的情況下與番茄果實建立宿主關系；同時，通過分泌高濃度的幾丁質酶等糖基水解酶，抑制B. cinerea生長與發(fā)育。不過，由幾丁質水解酶酶解病原真菌細胞壁所產生的寡糖分子進一步引發(fā)的宿主免疫響應可能會同時對拮抗微生物和病原微生物的生存造成威脅。隨著高通量測序技術的指數(shù)式發(fā)展，植物（果蔬）微生物組學成為學科熱點和交叉前沿。有益微生物及其組合促進植物在各種環(huán)境下保持健康狀態(tài)，深入了解其功能和作用機制，將在采后貯藏保鮮中有著巨大的應用潛力。